miR-448靶向SIRT1對血管平滑肌細胞增殖、凋亡和運動能力的調節作用①

朱彥彬 李 立 王賢芝 仲 偉 張富釗

(川北醫學院附屬醫院血管外科，南充 637000)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)是動脈中膜的重要組成部分，是執行血管收縮功能的重要物質基礎[1]。臨床研究表明，VSMCs異常增殖與多種心血管疾病(動脈粥樣硬化、冠心病和冠脈支架內再狹窄等)的發生發展相關[2]。研究調節VSMCs細胞生物學行為的關鍵因子對心血管疾病治療具有重要意義。沉默信息調節蛋白1(silencing information regulatory protein 1，SIRT1)是Sirtuin家族成員，可調節氧化應激、炎癥和自噬等生理過程，對動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷等具有預防保護作用[3]。研究顯示，SIRT1可抑制VSMCs增殖及血管炎癥反應，但其上游調節機制尚未明確[4-5]。miR-448屬于miRNA家族，可與靶mRNA的3′UTR互補結合抑制多種蛋白翻譯，調控細胞增殖、分化和凋亡過程[6]。miR-448可調節SIRT1表達，參與2型糖尿病發生發展，但其對VSMCs的作用及機制報道較少[7]。本研究分析miR-448和SIRT1的靶向關系及其對VSMCs細胞生物學行為的調節作用，為心血管疾病治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD雄性大鼠20只，體重250～280 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2017-0022，飼養于我院動物中心實驗室，每12 h更換光照條件，保持室溫恒定為25℃，自由攝食與飲水。

1.1.2儀器 FACSCantoⅡ流式細胞儀(美國BD公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.1.3試劑 DMEM培養基、胎牛血清及轉染試劑(賽默飛世爾)；熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)；EDU試劑盒(廣東銳博生物科技有限公司)；MTT檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)；Transwell小室、Matrigel基底膜(美國BD公司)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑(日本TaKaRa公司)；抗GAPDH抗體、抗α-SMA抗體、抗Ki67抗體、抗PCNA抗體、抗Caspase-3抗體、抗Caspase-9抗體、抗MMP-2抗體及抗MMP-9抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1造模 SD大鼠預飼養1周后，隨機分為對照組和模型組，每組10只。參考文獻[8]建立頸動脈損傷模型：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(6 ml/kg)麻醉，剃除頸部皮毛，75%酒精局部消毒，分離皮下組織和肌肉，暴露頸內動脈、頸外動脈、頸總動脈，頸外動脈遠心端打死結，動脈夾臨時結扎頸內動脈和頸總動脈近心端，顯微剪在頸外動脈剪1個小口，沿頸外動脈將2.0 F球囊送至頸總動脈，注射生理鹽水充盈球囊，反復抽拉3次后放氣，撤出球囊，待頸動脈血流恢復后依次縫合，對照組僅暴露頸動脈后即縫合傷口。術后14 d腹腔麻醉處死大鼠，分離頸全部總動脈。

1.2.2大鼠頸動脈組織VSMCs細胞分離培養與鑒定 將頸總動脈放入D-Hanks液中洗清殘血，血管放入2 mg/ml Ⅱ 型膠原酶和高糖細胞培養基(1∶1)中，37℃溫浴15 min，剝去血管表面筋膜和纖維層，置于含1%青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清的高糖培養基，37℃孵育過夜，分別加入1 ml Ⅱ型膠原酶(2 mg/ml)和彈力蛋白酶(0.25 mg/ml)于6孔板，剪碎，37℃孵育1 h，槍頭吹打后離心，重懸，細胞生長至 80%融合(7～10 d)傳代。采用α-SMA單克隆抗體進行免疫熒光鑒定，取培養到第2代的對數期細胞，棄培養基，加入1 ml 4%多聚甲醛固定20 min，加入 0.25 % Triton X-100 室溫透膜 1 h，加入含 10%山羊血清的封閉液室溫封閉1 h，加入羊抗鼠α-SMA 一抗(1∶ 200)4℃孵育過夜，加入Alex488 兔抗羊二抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，加入DAPI 染核，室溫避光10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3RT-PCR、Western blot檢測大鼠頸動脈組織VSMCs miR-448和SIRT1表達 取各組大鼠VSMCs，Trizol法提取組織總RNA，RT-PCR反應，以GAPDH為內參，參考文獻[9-10]設計引物、反應體系及條件。采用細胞裂解液嚴格按照蛋白裂解步驟提取總蛋白，將50 μg蛋白樣品經SDS-PAGE電泳轉至PVDF膜，加入一抗4℃孵育過夜，加二抗37℃孵育2 h，ECL顯色。Photoshop軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4miR-448和SIRT1靶向關系研究 將體外分離培養的正常大鼠VSMCs接種于細胞培養板，24 h后分別轉染miR-448 mimic和miR-448 inhibitor。RT-PCR測定各VSMCs中miR-448表達。Western blot檢測SIRT1蛋白表達。熒光素酶報告基因系統研究miR-448和SIRT1靶向關系，miRNA靶點預測軟件提示，miR-448的可能結合位點為SIRT1 mRNA的3′UTR 位點906～913，體外合成含該位點的DNA片段(wt)及含該位點突變體(mut)的DNA片段，亞克隆至雙熒光素酶啟動子載體。將該質粒轉染于miR-448組和miR-448 inhibitor組細胞，培養48 h，熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

1.2.5細胞培養與轉染 將體外分離培養的正常大鼠VSMCs分為miR-448組、miR-SIRT1組、SIRT1組和對照組。采用Lipofectamine 2000轉染miR-448 mimic，轉染前24 h接種細胞，將miR-448 mimic轉染于miR-488組和miR-SIRT1組細胞；將SIRT1構建至pc-DNA 3.1載體過表達后轉染至miR-SIRT1組和SIRT1組細胞，按照轉染試劑操作步驟進行轉染。

1.2.6EDU染色檢測細胞的增殖 取轉染后各組VSMCs，按照EDU試劑盒說明書進行EDU染色，于熒光顯微鏡下觀察細胞增殖情況，Image-pro Plus軟件計算。Western blot檢測Ki67、PCNA蛋白表達。

1.2.7流式細胞術檢測細胞的凋亡 取轉染后各組VSMCs，離心管收集細胞培養液及胰酶消化后的細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸并計數。取5×104～1×105個/ml重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，依次加入195 μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞，5 μl Annexin V-FITC輕輕搖勻，10 μl Propidium Iodide染色液混勻。室溫避光孵育30 min，流式細胞術檢測。Western blot檢測Caspase-3和Caspase-9蛋白表達。

1.2.8Transwell檢測細胞侵襲 取100 μl稀釋好的基質膠均勻覆蓋于Transwell小室底部。取轉染后各組細胞，0.2%胰蛋白酶消化，以含1%小牛血清的培養液調整細胞濃度為2×105個/ml。取100 μl 稀釋好的細胞懸液加于上室，下室為500 μl含10%胎牛血清培養基，37℃、5%CO2培養48 h，取出小室，按照Hemacolor Kit說明書固定、染色，下室面表面細胞為侵襲細胞，顯微鏡下拍照、計數，共計數5個視野，取平均值。實驗設置3個平行小室，重復3次，以穿膜的腫瘤細胞數評價其侵襲能力。

1.2.9劃痕實驗檢測細胞遷移 取轉染后各組VSMCs接種于96孔板，待細胞長滿單層棄培養基，滅菌移液槍頭在皿底劃一直線，洗滌3次，盡量清洗掉被劃下的細胞，更換無血清培養基常規培養，顯微鏡下觀察劃痕處細胞生長情況，根據劃痕寬度計算細胞遷移率。Western blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達。

2 結果

2.1各組大鼠動脈損傷組織VSMCs分離鑒定 正常組織和動脈損傷組織VSMCs中均可見α-SMA陽性信號，表明所分離細胞為VMSCs。見圖1。

2.2miR-448和SIRT1在動脈損傷組織VSMCs中的表達 與對照組相比，動脈損傷組織VSMCs中miR-448表達明顯上調(P<0.05)，SIRT1表達明顯下調(P<0.05)。見圖2。

2.3miR-448靶向抑制SIRT1表達 與對照組相比，miR-448組miR-448表達明顯上調(P<0.05)，SIRT1表達明顯下調(P<0.05)，miR-448 inhibitor組miR-448表達明顯下調(P<0.05)，SIRT1表達明顯上調(P<0.05)。熒光素酶報告系統實驗結果顯示，共轉染野生型熒光素酶質粒和miR-448，熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，表明miR-448可靶向負調控SIRT1，見圖3。

2.4miR-448靶向抑制SIRT1促進VSMCs增殖 EDU細胞增殖實驗顯示，與對照組相比，miR-448組細胞數明顯增多(P<0.05)，SIRT1組細胞數明顯減少(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組細胞數明顯增多(P<0.05)。Western blot顯示，與對照組相比，miR-448組Ki67和PCNA蛋白表達明顯上調(P<0.05)，SIRT1組Ki67和PCNA蛋白表達明顯下調(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組Ki67和PCNA蛋白表達明顯上調(P<0.05)，見圖4。

2.5miR-448靶向抑制SIRT1抑制VSMCs凋亡 流式細胞術結果顯示，與對照組相比，miR-448組細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，SIRT1組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)。Western blot顯示，與對照組相比，miR-448組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達明顯下調(P<0.05)，SIRT1組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達明顯上調(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達明顯下調(P<0.05)，見圖5。

圖1 各組大鼠動脈損傷組織中VSMCs分離鑒定Fig.1 Isolation and identification of VSMCs in artery injury tissues of rats

圖2 miR-448和SIRT1在正常組織與動脈損傷組織VSMCs中的表達Fig.2 Expression levels of miR-448 and SIRT1 in VSMCs of normal tissues and arterial injury tissuesNote:Compared with Control,*.P<0.05.

圖3 miR-448對SIRT1 表達的靶向調控作用Fig.3 Effect of miR-448 on targeting expression of SIRT1Note:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1 wt,#.P<0.05.

圖4 miR-448靶向抑制SIRT1對VSMCs增殖的影響Fig.4 Effect of miR-448 targeting inhibiting SIRT1 on proliferation of VSMCsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1,#.P<0.05.

圖5 miR-448靶向抑制SIRT1對VSMCs凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-448 targeting inhibiting SIRT1 on apoptosis of VSMCsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1,#.P<0.05.

圖6 miR-448靶向抑制SIRT1對VSMCs細胞侵襲和遷移的影響Fig.6 Effect of miR-448 targeting SIRT1 on inhibit invasion and migration of VSMCsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1,#.P<0.05.

2.6miR-448靶向抑制SIRT1促進VSMCs侵襲和遷移 與對照組相比，miR-448組細胞侵襲率和遷移率明顯升高(P<0.05)，SIRT1組細胞侵襲率和遷移率明顯下降(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組細胞侵襲率和遷移率升高(P<0.05)。Western blot顯示，與對照組相比，miR-448組MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯上調(P<0.05)，SIRT1組MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯下調(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯上調(P<0.05)，見圖6。

3 討論

miR-448屬于miRNAs家族，參與冠狀動脈粥樣硬化、前列腺癌、乳腺癌等多種疾病的發生。LI等[11]研究發現，過表達miR-448可促進VSMCs增殖和遷移，在多種心血管疾病(冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓等)中具有重要作用，但作用機制尚未明確。本研究建立大鼠頸動脈損傷模型，分析miR-448作用于VSMCs的機制。本研究中，動脈損傷組織VSMCs中miR-448表達明顯上調，SIRT1表達明顯下調，且經熒光素酶活性實驗證實miR-448可靶向負調控SIRT1表達，提示miR-448可能通過靶向負調控SIRT1表達調控VSMCs生物學行為，參與動脈組織損傷的病理過程。SIRT1作為Sirtuins家族成員，參與多種細胞過程，如能量代謝、DNA修復、氧化應激等[12]。研究表明，SIRT1可調節VSMCs功能紊亂，在血管的生長發育中具有重要作用[13]。提示miR-448可通過靶向負調控SIRT1表達調節VSMCs功能，導致動脈組織損傷。

VSMCs異常增殖是高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病發生發展的細胞病理學基礎[14]。本研究發現，miR-448可靶向抑制SIRT1表達上調Ki67和PCNA蛋白表達，促進VSMCs細胞增殖。Ki67和PCNA為細胞增殖蛋白，是目前反映腫瘤細胞增殖活性和增殖速率最可靠的指標，與多種惡性腫瘤的發展及預后有關[15]。提示miR-448可通過抑制SIRT1表達上調細胞增殖蛋白表達，促進VSMCs增殖。WANG等[16]研究發現，SIRT1可抑制損傷的VSMCs增殖，促進其凋亡，與本研究結果基本相符，提示miR-448可通過靶向抑制SIRT1表達。促進VSMCs增殖，增加高血壓、冠心病等心血管疾病發生風險。本研究中，miR-448可靶向抑制SIRT1表達，下調Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達，抑制細胞凋亡，提示miR-448可靶向抑制SIRT1表達，抑制細胞凋亡的級聯反應，抑制VSMCs凋亡。

臨床研究表明，損傷誘導的VSMCs由中膜向內膜遷移、增殖、分泌大量細胞外基質等是導致血管重構的重要病理基礎[17]。本研究發現，miR-448可靶向抑制SIRT1表達，上調MMP-2和MMP-9蛋白表達，抑制VSMCs侵襲和遷移。MMP-2和MMP-9所有MMPs中分布最廣，可特異性降解Ⅳ型膠原纖維，其中MMP-9還可以釋放血管內皮生長因子參與血管生成，在調節細胞增殖、侵襲、轉移及血管生成等方面具有重要作用[18-19]。KITADA等[20]研究表明，SIRT1在VSMCs侵襲和遷移中具有重要作用，與本研究結論基本相符，提示miR-448可靶向抑制SIRT1表達，上調MMP-2和MMP-9表達，促進VSMCs侵襲和遷移，增加血管重構風險。

綜上所述，miR-448可靶向負調控SIRT1表達，促進VSMCs增殖、侵襲和遷移，抑制其凋亡，為心血管疾病的研究和防治提供了理論基礎。