TLR4抑制劑TAK-242預(yù)處理改善急性缺血性腦卒中誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷①

伉 奕 楊涌濤 馬 宇 程 惠 石燕芳 王 玥 展群嶺 萬 東

(重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院腦病科，重慶 400080)

腦卒中是一類由腦血管病變引發(fā)的神經(jīng)功能缺損的腦血管疾病，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類[1]。其中缺血性腦卒中的發(fā)病率、病死率和復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于出血性腦卒中[2]。急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)發(fā)生時機(jī)體會產(chǎn)生強(qiáng)刺激引起全身的應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)其他遠(yuǎn)端臟器發(fā)生病理改變。腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官，也是重要的靶器官，腦卒中應(yīng)激引起的消化道癥狀在臨床上很常見，如腹脹、便秘等[3]，但由此引發(fā)的腸黏膜屏障損傷機(jī)理未見確切報(bào)道。因此，研究AIS病程中腸黏膜屏障功能障礙的發(fā)生機(jī)制具有重要臨床意義。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)是固有免疫的重要組成部分，可構(gòu)成腸道的第一道保護(hù)屏障，既是細(xì)胞內(nèi)的跨膜信號傳導(dǎo)分子，又是細(xì)胞表面的免疫識別受體。有研究表明，急性肝衰竭誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷中，LPS/TLR4/MyD88信號通路被激活，TLR4表達(dá)水平顯著上調(diào)[4]；也有研究認(rèn)為，LPS可以通過激活TLR4/MyD88信號通路而影響腸上皮緊密連接，會導(dǎo)致腸道通透性增加，腸黏膜屏障破壞[5]。然而，TLR4是否參與AIS誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷，目前還未曾報(bào)道。本研究通過線栓法制備大鼠中動脈栓塞所致的大鼠AIS模型，觀察TLR4抑制劑TAK-242預(yù)處理對大鼠腸黏膜損傷的影響，以期為AIS的治療提供思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠45只，7～8周齡，體重(260±20)g，由湖北省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證編號：SCXK(鄂)2019-0013。飼養(yǎng)條件：溫度為24℃，濕度為50%，通風(fēng)良好，明暗光照交替12 h，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。

1.1.2主要儀器及試劑 TAK-242又名Resatorvid(瑞沙托維)，購自美國MedChemExpress公司；二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、IL-6、內(nèi)毒素(endotoxin，ET)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、D-乳酸(D-Lactate， D-Lac)和IL-1β檢測試劑盒購自美國R&D公司；異硫氰酸熒光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-Dextran)購自美國Sigma公司；Claudin-1、ZO-1、TLR4、MyD88、NF-κB p65和β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1動物造模及分組處理 將45只SPF級雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成3組，即假手術(shù)組(sham)、模型組(model)、TAK-242預(yù)處理組(TAK-242)，每組15只。所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，參照文獻(xiàn)[6]采用改良Longa線栓法制作AIS大鼠模型，術(shù)后待大鼠清醒后采用Zea-Longa五級評分法進(jìn)行評估，以1～3分為造模成功。其中sham組大鼠僅暴露頸動脈不插入線栓。術(shù)前24 h，TAK-242組大鼠經(jīng)尾靜脈注射TAK-242(10 mg/kg)[7]，sham組和model組大鼠分別注射等量生理鹽水。

1.2.2神經(jīng)功能缺損評分 各組大鼠于造模24 h后，采用Zea-Longa五級評分法評估神經(jīng)功能缺損情況，0分：未觀察到神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：不能完全伸展左前肢，輕度神經(jīng)功能缺失；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺失；3分：向左側(cè)傾倒，重度神經(jīng)功能缺失；4分：無法正常行走，意識水平低下。評分越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重[8]。

1.2.3TTC法評估大鼠腦梗死面積 造模24 h后，各組隨機(jī)取5只大鼠，采用斷頭法處死大鼠，取腦并剔除小腦和低位腦干，立即放入-20℃冷凍，取出后沿冠狀位從額極向后連續(xù)切片(約2 mm)，2%TTC 染液于37℃避光染色15 min。正常區(qū)域呈鮮紅色，梗死區(qū)域呈白色。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算腦梗死面積占腦組織總面積的百分比(%)。

1.2.4ELISA檢測大鼠血清相關(guān)指標(biāo) 腹主動脈取血，以3 000 r/min離心5 min，分離血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中DAO、D-Lac、ET、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.2.5FITC-Dextran示蹤法[9]檢測大鼠腸黏膜通透性 各組隨機(jī)取5只大鼠，于造模后20 h，采用0.4 mg/g FITC-Dextran進(jìn)行灌胃處理，4 h后采血，肝素鈉抗凝，3 500 r/min離心15 min。取25 μl血漿加入100 μl PBS，用全波長多功能酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品濃度。

1.2.6HE染色觀察大鼠腸黏膜組織病理學(xué)變化 取距Treitz韌帶5 cm處部分空腸組織，PBS液洗凈后用10%甲醛固定24 h，隨后進(jìn)行脫水處理，并進(jìn)行石蠟包埋，制作石蠟切片，厚度為3～4 μm，行HE染色，于顯微鏡下觀察病理改變，采用Chui′s評分評價腸損傷情況[10]。

1.2.7Western blot檢測大鼠小腸組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組大鼠小腸組織，加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，冰上碾磨組織，4℃條件下12 000 r/min離心15 min，收集上清，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白煮沸變性后上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入Claudin-1、ZO-1、TLR4、MyD88、NF-κB p65和β-actin一抗，4℃孵育過夜。次日加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，ECL試劑曝光顯影。以目的蛋白與β-actin灰度比值表示該目的蛋白的相對表達(dá)量。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較Fig.1 Comparison of neurological scores of rats in each groupNote:Compared with sham group,**.P<0.01;compared with model group,##.P<0.01.

2 結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 如圖1所示，與sham組比較，model組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.05)。

2.2TAK-242預(yù)處理對AIS大鼠腦梗死面積的影響 如圖2所示，sham組大鼠未出現(xiàn)腦梗死現(xiàn)象，而model組和TAK-242組大鼠均出現(xiàn)腦梗死現(xiàn)象。與model組比較，TAK-242組大鼠腦梗死面積顯著降低(P<0.05)。

2.3TAK-242預(yù)處理對AIS大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量的影響 如圖3所示，與sham組比較，model組大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量顯著降低(P<0.05)。

2.4TAK-242預(yù)處理對AIS大鼠血清中炎癥因子水平的影響 如圖4所示，與sham組比較，model組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6顯著降低(P<0.05)。

2.5TAK-242預(yù)處理對AIS大鼠腸黏膜通透性的影響 如圖5所示，與sham組比較，model組大鼠血漿中FITC-Dextran濃度顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠血漿中FITC-Dextran濃度顯著降低(P<0.05)。

圖2 各組大鼠腦梗死面積比較

圖3 各組大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量比較Fig.3 Comparison of DAO，D-Lac and ET contents in serum of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01;compared with model group，##.P<0.01.

2.6TAK-242預(yù)處理對AIS大鼠腸黏膜組織病理變化的影響 如圖6A所示，sham組大鼠小腸黏膜完好，腸上皮細(xì)胞未見破壞，絨毛排布規(guī)整，刷狀緣光整平滑；model組有嚴(yán)重的組織損傷，絨毛萎縮變形，腸隱窩加深，大量炎癥細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管充血；與model組比較，TAK-242組絨毛高度恢復(fù)，隱窩排列整齊，各層結(jié)構(gòu)相對清晰完整。如圖6B所示，與sham組比較，model組Chui′s評分顯著升高(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組Chui′s評分顯著降低(P<0.05)。

圖4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較Fig.4 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 contents in serum of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01;compared with model group，##.P<0.01.

圖5 各組大鼠腸黏膜通透性的比較Fig.5 Comparison of intestinal permeability of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01;compared with model group，##.P<0.01.

圖6 各組大鼠小腸組織切片病理觀察

2.7TAK-242預(yù)處理對AIS大鼠小腸組織緊密連接蛋白表達(dá)的影響 如圖7所示，與sham組比較，model組大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白水平均顯著降低(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白水平均顯著升高(P<0.05)。

2.8TAK-242預(yù)處理對AIS大鼠小腸組織TLR4/NF-κB信號通路的影響 如圖8所示，與sham組比較，model組大鼠小腸組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平均顯著上升(P<0.05)；與model組比較，TAK-242組大鼠小腸組織中MyD88和NF-κB p65蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，TLR4蛋白水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖7 各組大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白表達(dá)比較Fig.7 Comparison of Claudin-1 and ZO-1 protein expression in small intestine of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01，***.P<0.001;compared with model group，#.P<0.05，##.P<0.01.

圖8 各組大鼠小腸組織中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較Fig.8 Comparison of TLR4，MyD88 and NF-κB p65 protein expression in small intestine of rats in each groupNote:Compared with sham group，**.P<0.01;compared with model group，##.P<0.01.

3 討論

胃腸道作為人體重要的組織系統(tǒng)，是營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的主要器官。正常情況下，腸道黏膜的各種生理性屏障可以保證致病因素?zé)o法越過屏障侵入腸道以外的地方，但遭受打擊或應(yīng)激狀態(tài)下，屏障完整性被破壞，腸道就成了各種毒素和病原微生物入侵機(jī)體的第一道防線。目前認(rèn)為腸道在應(yīng)激時是多器官功能障礙的始動器官，AIS可使機(jī)體處于一種強(qiáng)烈的應(yīng)激狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中使用的TLR4信號通路抑制劑TAK-242分子量小，可在機(jī)體組織中迅速分散，直接結(jié)合TLR4胞內(nèi)區(qū)域，從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生[11]。本研究結(jié)果顯示，TAK-242預(yù)處理可有效改善AIS大鼠神經(jīng)功能以及腸黏膜屏障損傷。

D-乳酸(D-Lac)是腸道內(nèi)多種細(xì)菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，如大腸桿菌、克雷伯桿菌、乳酸桿菌等。正常生理?xiàng)l件下，腸道內(nèi)的D-Lac在腸黏膜機(jī)械屏障的屏蔽下很少被吸收，但當(dāng)腸黏膜屏障功能發(fā)生障礙時，D-Lac可經(jīng)由損傷的腸黏膜入血，導(dǎo)致D-Lac的生成量上升，因此血液中D-Lac的含量能夠作為評價腸黏膜受損傷程度的一個重要指標(biāo)[12]。二胺氧化酶(DAO)是存在于哺乳動物小腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的一種酶，它能夠分解氨基酸代謝過程中產(chǎn)生的胺。在腸黏膜上皮細(xì)胞無損傷的情況下，血漿中無DAO的出現(xiàn)，但當(dāng)腸黏膜上皮細(xì)胞被破壞時，細(xì)胞內(nèi)的DAO便會釋放入血，使血液中的含量上升，故DAO水平可以反映腸黏膜屏障功能及通透性的變化[13]。內(nèi)毒素(ET)是促使機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要因素之一，腸道黏膜屏障可導(dǎo)致腸道內(nèi)ET移位至血液循環(huán)系統(tǒng)，因而血液ET含量常被作為臨床判斷機(jī)體腸道黏膜屏障功能的指標(biāo)[14]。有研究顯示，重癥急性胰腺炎(SAP)誘導(dǎo)的大鼠胃腸功能障礙模型中，血清D-Lac和ET水平顯著上調(diào)，右美托咪定可減輕SAP大鼠胃腸黏膜的損傷，下調(diào)D-Lac和ET的水平[15]。本研究結(jié)果顯示，AIS大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量顯著升高，表明腸黏膜屏障功能被破壞；而TAK-242預(yù)處理后可降低大鼠血清中DAO、D-Lac和ET含量，說明抑制TLR4的表達(dá)可以有效減輕屏障的損傷。

在眾多腸道屏障功能障礙的損傷機(jī)制中，炎癥介導(dǎo)損傷屬于其中極其重要的一部分[16]。正常情況下，炎癥反應(yīng)本身屬于機(jī)體自身的保護(hù)機(jī)制，但在反應(yīng)激烈不受控制的情況下會呈現(xiàn)出“瀑布樣”反應(yīng)，對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷。AIS誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷將導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素移至血液循環(huán)系統(tǒng)，從而誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，甚至是多系統(tǒng)功能衰竭綜合征(MODS)。故本研究檢測了各組大鼠血清中炎癥因子水平，結(jié)果顯示AIS大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著上升；而TAK-242預(yù)處理后大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著降低。說明干預(yù)TLR4表達(dá)可以抑制AIS大鼠腸黏膜屏障損傷介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

FITC-Dextran是一種低分子多聚糖，正常情況下，機(jī)體不含F(xiàn)ITC-Dextran且不被小腸吸收，經(jīng)胃管進(jìn)入消化道的FITC-Dextran進(jìn)入血液循環(huán)的唯一方式便是破壞腸道屏障的完整性。血漿中的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，F(xiàn)ITC-Dextran的濃度越高，提示腸黏膜屏障損傷越嚴(yán)重[17]。本研究結(jié)果顯示，AIS大鼠血漿中FITC-Dextran濃度顯著升高，與既往研究結(jié)果一致[9]；而采用TAK-242預(yù)處理后大鼠血漿中FITC-Dextran濃度顯著降低。同時病理結(jié)果顯示，模型組大鼠的腸黏膜組織被破壞，腸絨毛減少且頂端上皮細(xì)胞壞死，腸黏膜內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；而TAK-242預(yù)處理后大鼠腸黏膜厚度及絨毛長度恢復(fù)，隱窩排列整齊，各層結(jié)構(gòu)相對清晰完整。說明腸黏膜屏障保護(hù)系統(tǒng)與TLR4的表達(dá)具有相關(guān)性，抑制其表達(dá)可降低腸上皮細(xì)胞的通透性，緩解腸黏膜的損傷。

TLR4作為腸道固有免疫的重要組成部分，構(gòu)成了腸道對細(xì)菌識別的第一道屏障，它既是細(xì)胞表面免疫識別受體，又是胞內(nèi)跨膜信號傳導(dǎo)分子。在TLR4激活后的信號傳遞過程中，MyD88依賴的信號途徑占主導(dǎo)地位，通過依次活化多個胞內(nèi)信號銜接分子，最終激活通路下游的NF-κB從而調(diào)控多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)[18-19]。此外，腸黏膜結(jié)構(gòu)系統(tǒng)中包含緊密連接蛋白，其中膜蛋白ZO-1和跨膜蛋白Claudin-1是兩種典型的緊密連接蛋白。他們的存在影響腸道選擇性屏障功能，無論是變異、減少還是缺失都會導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的通透性提高，從而使內(nèi)毒素等大分子物質(zhì)進(jìn)入體循環(huán)。故ZO-1和Claudin-1的表達(dá)水平能在一定程度上反映腸屏障損傷情況[20-21]。本研究結(jié)果顯示，AIS大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白水平均顯著降低，而TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平均顯著上升；采用TAK-242預(yù)處理后大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1蛋白水平均顯著升高，MyD88和NF-κB p65蛋白水平均顯著降低，而TLR4蛋白水平改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這主要與TAK-242的作用原理相關(guān)，TAK-242對TLR4信號通路的抑制作用主要是通過下調(diào) TLR4下游信號分子MyD88蛋白的表達(dá)發(fā)揮抑制作用[22]。由此可以推測AIS誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷與TLR4/NF-κB信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，TLR4抑制劑TAK-242可通過抑制TLR4/NF-κL信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而改善AIS誘導(dǎo)的腸道屏障功能損傷，本研究結(jié)果可為AIS誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷的防治提供新的理論依據(jù)。此外，腸道炎癥反應(yīng)是腸黏膜屏障損傷的早期表現(xiàn)，而本研究并未對腸道局部炎癥因子水平進(jìn)行檢測，這是本文的不足之處，后續(xù)研究中將進(jìn)行完善。