基于生物信息學整合分析醒脾舒肝湯調節自噬治療中醫郁病的分子機制*

楊仁義，龔翠蘭，車雄宇，顏思陽，周德生，傅馨瑩，陸展輝

1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南中醫藥大學附屬常德醫院，湖南常德415000；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007

中醫郁病主要以心情抑郁、煩躁易怒、精神恍惚、悲傷欲哭、脅肋脹痛、全身不適等為主要癥狀［1］，西醫屬于“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”等范疇。世界衛生組織預測2020年后抑郁癥可能成為人類健康問題的第二大因素［2］。西醫一般予以阿米替林、氟西汀等藥物治療，其作用機制主要與神經鞘磷脂在溶酶體和高爾基膜中的緩慢蓄積，及神經酰胺在內質網中的緩慢蓄積，誘導海馬神經細胞的自噬有關［3-4］。自噬是一種溶酶體依賴性降解、回收、利用機體內大分子和細胞器的程序性死亡方式，受LC3-II、Beclin、p62、Vps等多種分子及信號通路調控，參與機體復雜生理病理過程，是當前研究的熱點問題。中醫從整體觀念、辨證論治的角度出發，在郁病的依從性、接受度、癥狀改善及療效等方面具有一定的優勢［5］。研究發現，加味逍遙散能刺激自噬小體的形成，并激活ATG5及LC3-II的表達，減輕神經細胞凋亡，從而改善抑郁癥狀，所以，中醫藥可能通過激活自噬機制發揮抗抑郁作用［6］。本研究根據郁病病因病機，結合多年臨床經驗認為，郁病病機屬脾虛濕盛，肝郁氣滯的范疇，治法當以醒脾疏肝為主，基于此理論立方的醒脾舒肝湯，由麻黃、紅花、川芎、細辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術、白芍、香附組成。該藥在長期臨床應用中取得了較好的療效，但是其分子機制尚不明確。本研究從神經細胞自噬機制出發，整合中藥及疾病靶點大數據，采用計算機技術多學科交叉分析方法，揭示醒脾舒肝湯調控自噬通路治療郁病的分子機制，為后續機制驗證及進一步開發醒脾舒肝湯提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 醒脾舒肝湯活性化合物收集及篩選利用TCMSP［7］（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）數據庫，收集醒脾舒肝湯中麻黃、紅花、川芎、細辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術、白芍、香附10味中藥的主要化學成分。根據人體對藥物吸收、分布、代謝及毒性的藥代動力學ADMT參數［8］，以口服生物利用度［9］（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類藥性［10］（drug likeness，DL）≥0.18，血腦屏障（blood brain barrier，BBB）≥-0.3為篩選條件［11］，初步篩選出醒脾舒肝湯有效高活性化合物。

1.2 活性化合物作用靶點預測與“中藥—疾病—表型”共同靶點篩選通過PubChem［12］（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）數據庫收集各活性化合物成分信息，以2D、3D結構保存為SDF格式。將活性化合物導入Swiss Target Prediction［13］（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）數據庫預測活性化合物相關靶點，剔除無化學結構、無靶點的化合物。

通過Pubmed中“MeSH”檢索功能檢索“anxiety neurosis（MeSH）”“depressive disorder（MeSH）”“somatoform disorder（MeSH）”及“autophagy（MeSH）”，收集所有檢索詞。將“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”及“自噬”的所有檢索詞納入GeneCards（https：／／www.genecards.org／）數據庫中檢索，收集“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”和“自噬”的作用靶點。

通過Bioinformatics Gent（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）中Van de Peer Lab在線工具取交集獲得“醒脾舒肝湯”“郁病”“自噬”的“中藥—疾病—表型”共同靶點，并繪制韋恩圖。

1.3 共同靶點關鍵基因篩選及蛋白PPI網絡構建

通過String［14］（https：／／string-db.org／）數據庫，將所得到的共同靶點導入，選擇Multiple Protenin，限定物種為Homo sapiens，設定最低要求互動分數為最高可信度0.900［15］，得到PPI相關信息。

將導出的PPI相關信息中Node1、Node2、Combined score值導入Cytoscape軟件，使PPI相關信息網絡圖可視化，并利用Network analyzer計算Degree值，進行可視化。同時采用Cytoscape軟件中Cyto-Hubba、MCODE功能中MCC算法、MCODE算法分別對PPI網絡圖進行亞網絡拓撲分析，篩選出關鍵基因，將3種算法篩選出的基因取并集，整合出共同靶點關鍵基因。

1.4 共同靶點GO 和KEGG 富集分析

利用WebGestalt［16］（http：／／www.webgestalt.org／＃）數據庫，將共同靶點進行GO與KEGG通路富集分析。初步設定基本參數，物種為“Homo sapiens”，采用“ORA”（Over-Representation Analysis，ORA）算法分析，選用“Funtional Database”子數據庫，進行GO和KEGG富集分析。進階參數設定中，設定“Significance Level”P＜0.05，余為默認設置。收集BP、CC、MF、KEGG富集分析數據，進行“加權集合覆蓋”分析，并繪制火山圖。

同時利用Metascape［17］（http：／／metascape.org／gp／index.html＃／main／step1）數據庫，導入共同靶點，基于MCODE算法對KEGG富集分析進行聚類亞網絡分析，并進行可視化。

1.5 關鍵基因非編碼RNA（m iRNA）反向預測及多基因網絡調控模式構建

利用TargetScan［18-20］（http：／／www.targetscan.org／mamm_31／）數據庫反向預測關鍵基因mRNA的miRNA，篩選并收集保守性miRNA，同時利用Cytoscape軟件構建miRNAmRNA相互作用網絡調控模式。

2 結果

2.1 醒脾舒肝湯活性化合物篩選通過TCMSP數據庫共收集醒脾舒肝湯中化合物422個，其中麻黃363個，紅花189個，川芎189個，細辛192個，艾葉135個，柴胡349個，吳茱萸176個，白術55個，白芍85個，香附104個。初步篩選后得出醒脾舒肝湯有效高活性化合物，麻黃10個，紅花12個，川芎6個，細辛6個，艾葉7個，柴胡9個，吳茱萸21個，白術4個，白芍3個，香附10個，基本信息見表1。

2.2 活性化合物靶點預測與“中藥—疾病—表型”共同靶點篩選通過Swiss Target Prediction數據庫對候選化合物相關靶點進行預測，剔除無化學結構及無靶點化合物，得到醒脾舒肝湯中麻黃、紅花、川芎、細辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術、白芍、香附共4 025個靶點，重復靶點整合后得到799個中藥靶點。通過GeneCards數據庫收集得到中醫郁病靶點，即“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”，共得到8 364個抑郁癥疾病靶點。通過GeneCards數據庫收集得到自噬靶點，共得到5 096個自噬表型靶點。利用Bioinformatics Gent取交集獲得“中藥—疾病—表型”共同靶點，共同靶點312個，繪制韋恩圖見圖1，共同靶點見表2。

圖1 “中藥—疾病—表型”共同靶點韋恩圖

2.3 “中藥—疾病—表型”共同靶點蛋白PPI網絡構建及亞網絡拓撲分析利用String數據庫及Cytoscape軟件對共同靶點蛋白進行相互作用網絡分析，得出PPI網絡圖（圖2A）。設定1≤Degree值≤10為綠色；11≤Degree值≤20為紫色；21≤Degree值≤30為粉紅色；31≤Degree值≤63為紅色，根據Network analyzer分析中Degree值設定節點大小，Degree值越大，節點越大。同時采用PPI網絡圖亞網絡拓撲分析，MCC算法、MCODE算法結果分別見圖2B，圖2C，整合3種算法得到的基因，取三者并集得到關鍵基因39個，結果見表3。

表1 醒脾舒肝湯中有效高活性化合物基本信息

續表1 醒脾舒肝湯中有效高活性化合物基本信息

表2 “中藥—疾病—表型”共同靶點

PPI網絡圖中有312個節點，1 627條邊，P-value＜＜1.0e-16，平均節點度為10.4，聚類系數為0.459，其中Degree值大于30的基因為SRC（Degree值 ＝63）；MAPK1（Degree值 ＝62）；PIK3CA（Degree值＝61）；PIK3R1（Degree值＝58）；MAPK3（Degree值＝58）；STAT3（Degree值＝57）；AKT1（Degree值＝53）；FYN（Degree值＝53）；LYN（Degree值＝46）；HSP90AA1（Degree值＝45）；PTPN11（Degree值＝39）；RAC1（Degree值＝39）；RHOA（Degree值＝38）；MAPK8（Degree值＝35）；CREBBP（Degree值＝35）；EGFR（Degree值＝35）；APP（Degree值＝35）；PTK2（Degree值＝34）；JUN（Degree值＝33）；JAK2（Degree值＝33）；JAK1（Degree值＝33）；MAPK14（Degree值＝33）。

圖2 共同靶點PPI網絡圖及亞網絡拓撲分析圖

表3 整合Degree、MCC、MCODE算法的關鍵基因

2.4 共同靶點GO和KEGG富集分析BP富集結果，共富集537個生物過程，加權集合覆蓋分析出10個最相關生物過程，根據“P-Value”升序排列，主要富集于對有毒物質的反應、蛋白質絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的調節、細胞內信號轉導的負調控、肽基酪氨酸修飾、對氧氣水平的反應等生物進程。根據“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3A。

CC富集結果，共富集34個細胞成分，加權集合覆蓋分析出10個最相關細胞成分，根據“P-Value”升序排列，主要富集于膜區、受體復合體、神經細胞體、膜面、谷氨酸能突觸等。根據“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3B。

MF富集結果，共富集71個分子功能類別，加權集合覆蓋分析出10個最相關分子功能類別，根據“P-Value”升序排列，主要富集于蛋白質絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、蛋白質酪氨酸激酶活性、轉錄因子活性，直接的配體調節序列特異性DNA結合、磷酸酶結合、磷蛋白結合等。根據“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3C。

KEGG富集結果，共富集154條信號通路，加權集合覆蓋分析出10條最相關信號通路，根據“P-Value”升序排列，主要為癌癥途徑、MicroRNA通路、細胞凋亡、AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗、MAPK信號通路、趨化因子信號通路等。根據“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3D。

Metascape［17］數據庫MCODE算法對KEGG富集分析進行聚類亞網絡分析，并進行可視化，共同靶點主要聚9類，主要以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類為主，Ⅰ類靶點主要富集于R-HSA-9006934、R-HSA-449147、R-HSA-5674499通路；Ⅱ類靶點主要富集于R-HSA-9006925、R-HSA-449147、RHSA-1257604通路；Ⅲ類靶點主要富集R-HSA-5633007、R-HSA-9006934、R-HSA-3700989通路，Ⅳ類靶點主要富集于R-HSA-418594、RHSA-373076、R-HSA-500792通路，具體結果見圖4、表4。

圖3 共同靶點GO、KEGG富集分析結果圖

圖4 KEGG聚類亞網絡分析圖

2.5 關鍵基因m iRNA預測分析TargetScan數據庫中反向預測39個關鍵基因的保守性miRNA，其中8個關鍵基因CCR5、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCL8、DRD3、HCK、PTGDR2未預測到miRNA，共919個miRNA-mRNA相互作用關系，在Cytoscape軟件中將共同靶點的mRNA設置為“三角形”“紅色”；將反向預測的miRNA設置為“圓形”“藍色”，可視化如圖5。

表4 KEGG聚類亞網絡結果

圖5 關鍵基因mRNA-m iRNA相互作用預測關系圖

3 討論

郁病源于《黃帝內經》，發展于《傷寒雜病論》。《素問·六元正紀大論》中談及郁病甚者，木、火、土、金、水郁分別當以達、發、奪、瀉、折為法治療，從而奠定了郁病學說的基礎。《素問· 舉痛論》云：“思則心有所存，神有所歸，正氣留而不行，故氣結矣。”提出郁病與情志之間的病因關系。此后，張仲景《傷寒論》《金匱要略·婦人雜病脈證治》從六經辨證理論出發，認為郁病屬少陽之樞，氣機升降出入、樞紐開合、肝木調達都賴肝膽疏泄，并創小柴胡湯。郁病多與情志有關，情志過極則氣血失和，氣機不暢，不思飲食，郁久五臟俱傷，主要累及肝脾兩臟，氣滯及痰濕內生，則肝郁氣滯兼有脾虛濕盛，當以疏肝行氣，醒脾祛濕治之。根據多年臨床經驗，結合肝郁氣滯兼有脾虛濕盛病機，制定具有疏肝行氣、醒脾祛濕功效的醒脾舒肝湯，由麻黃、紅花、川芎、細辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術、白芍、香附按特定比例組成，同時采用中醫定向透藥聯合灸法的方式，臨床治療軀體形式障礙、焦慮抑郁狀態取得了較好的療效。

生物信息學是生物醫學與計算機科學的綜合體，利用數學分析方法，已成為系統生命學的重要組成部分。網絡藥理學以中藥為研究對象，以大數據為基礎，研究中藥潛在作用靶點及機制，為推動中醫藥現代化創造了巨大的潛力。分子網絡數據挖掘分析是DNA、RNA、蛋白質等生物分子以網絡整體調控模式參與機體生命過程。“辨證論治”“整體觀念”是中醫學基本特色，網絡藥理學、分子網絡數據挖掘等生命信息學從系統整體對藥物、疾病、機制進行科學認識，兩者具有高度契合性。本研究采用生物信息學方法，挖掘醒脾舒肝湯活性成分、篩選分析“中藥—疾病—表型”共同靶點，從分子、基因角度研究其作用機制。

本研究收集醒脾舒肝湯麻黃、紅花、川芎、細辛、艾葉、柴胡、吳茱萸、白術、白芍、香附中化合物共422個，初步篩選得到具有良好生物活性及口服利用度的化合物，已被文獻報道具有抗脂類沉積、抗損傷、免疫調節等活性。如Vanmierlo等［21］研究發現，麻黃活性化合物谷固醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（Stigmasterol）能通過影響腦膽固醇穩態改善Abcg5-／-小鼠焦慮行為，López-Rubalcava等［22］研究發現β谷固醇能使GABA（A）與其受體結合形成復合物，從而發揮抗抑郁作用。Li等［23］通過代謝組學的方法揭示了豆甾醇能應激抗性大鼠外周血單核細胞的潛在抗抑郁和抗逆機制，其作用機制可能與能量代謝、神經遞質、O-GlcNAcylation和cAMP信號級聯等有關。由此可見，篩選所得醒脾舒肝湯的活性化合物具有抗抑郁的作用。

本研究以中醫“郁病”作為切入點，中西醫結合對應研究“焦慮癥”“抑郁癥”“軀體形式障礙”的作用機制可能與自噬有關［3］，結合GeneCards數據庫挖掘“中藥—疾病—表型”，即“醒脾舒肝湯—郁病—自噬”的共同靶點共312個，充分體現了中藥多成分、多靶點的網絡調控關系，驗證了醒脾舒肝湯可能以其多成分、多靶點、整體協同方式通過自噬機制發揮抗抑郁的作用。進一步分析共同靶點蛋白相互作用網絡圖，結合MCC算法、MCODE算法及拓撲分析，篩選出“醒脾舒肝湯—郁病—自噬”調控關系中關鍵基因39個，其中已有文獻報道，淀粉樣前體蛋白［24］被證實是NRF1基因網絡的靶基因，參與人腦多種疾病的發生，其中包括焦慮抑郁。JUN基因在外周血中過表達，可作為抑郁治療的預測分子［25］，能增強自噬，穩定焦慮抑郁情緒［26］。由此可見，多個關鍵基因既能作為郁病治療的預測靶標，也能參與增強自噬途徑，從而發揮抗抑郁穩定情緒的作用。

本研究對關鍵基因進行富集分析，主要富集于膜區、受體復合體、突觸等細胞成分，通過磷酸化、泛素化等直接作用機制調節蛋白質活性及蛋白結合能力等，影響蛋白—蛋白、蛋白—DNA、蛋白—RNA相互作用關系，從而影響細胞內信號傳導的調控及氧利用等生物進程，其主要作用機制可能與MicroRNA通路、細胞凋亡、AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗等多通路網絡模式調控自噬通路有關。Wang等［6］研究發現，逍遙散加減能通過細胞凋亡機制介導自噬小體形成，增強自噬從而發揮抗抑郁作用，證實細胞凋亡與自噬表型嵌套模式能發揮協同抗抑郁作用。Gulbins等［3］研究發現，抗抑郁藥通過誘導鞘磷脂神經酰胺控制的自噬發揮作用，其作用機制主要與酪氨酸激酶受體通路調控自噬發揮抗焦慮作用有關。研究發現T淋巴細胞與白細胞介素-10介導的炎癥信號通路［27］，激活下游自噬通路［28］，從而發揮抗焦慮抑郁作用。由此可見，關鍵基因能在多細胞成分、多分子功能、多生物進程中與多條通路網絡調控有關。結合預測結果及文獻報道得出，醒脾舒肝湯在細胞膜區改變膜蛋白結構，影響蛋白與蛋白、RNA、DNA結合，影響細胞內信號傳導的生物進程抗焦慮抑郁，其機制可能與網絡化調控多通路機制介導自噬增強有關。

本研究進一步以miRNA通路介導自噬增強為方向，反向預測關鍵蛋白相關miRNA，得出919個miRNA與關鍵蛋白mRNA 相互作用關系。Ma等［29］高通量測序結果顯示，miR-378、miR-34b、miR-194、miR-206、miR-10a、miR-10a、let-7a、miR-34c、miR-34b、miR-21a等在抑郁樣行為的小鼠中異常表達，并且熒光素酶基因報告實驗證實異常表達的miRNA-mRNA相互作用，參與GABA能突觸、自噬通路、神經遞質合成等多種機制發揮抗抑郁作用，其中高通量篩選及實驗驗證結果與本研究預測結果相吻合。由此可見，miRNA-mRNA相互作用模式可能通過調控自噬發揮抗抑郁作用。

綜上所述，基于生物信息學方法分析醒脾舒肝湯治療郁病的作用，預測其治療的關鍵基因，富集分析得出關鍵基因的蛋白互作關系、生物進程和信號通路，同時采用miRNA-mRNA模式反向預測關鍵基因的miRNA，最終得出醒脾舒肝湯多成分、多靶點、多通路、多miRNA參與增強自噬機制發揮抗抑郁作用，為中醫郁病治療，西醫抑郁癥、焦慮癥、軀體形式障礙的治療提供理論靶點及臨床預測標志物，推進中西醫結合診斷治療郁病的發展，同時為進一步開發醒脾舒肝湯提供分子層面依據，為后續實驗提供預測理論基礎。