白及顆粒對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺組織α-1 antitrypsin、Neutrophil Elastase及MPO表達的影響*

程芳，武尚亮，趙麗華

（1.天津海濱人民醫院藥劑科，天津 300280；2.天津紅日康仁堂藥業有限公司，天津 301700；3.北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所中心實驗室，北京 100142）

慢性阻塞性肺?。–OPD）是慢性氣道阻塞性疾病的統稱，是以呼吸氣流受限為特征的肺部疾病。呼吸氣流受限不完全可逆，呈進行性發展，與肺部對香煙的煙霧等有害氣體或其他有害顆粒的異常炎癥反應有關[1]。COPD與慢性支氣管炎及肺氣腫密切相關，呼吸道反復病毒感染和繼發性細菌感染是導致慢性支氣管炎病變發展的重要因素，長期接觸工業粉塵、大氣污染及過敏因素也是引起慢性支氣管炎的重要原因，而機體抵抗力下降，呼吸系統防御受損則是發病的內在因素[2]。已有研究證明白及或白及顆粒對PM2.5、石英粉（矽肺）、鹽酸等引起的肺損傷具有很好的療效[3]。白及歸肺、肝、胃經，功效為收斂止血，消腫生肌，說明書指明白及顆粒可用于慢性氣管炎，肺氣腫等肺部相關疾病[4]。在臨床上，慢性支氣管炎和肺氣腫是導致COPD的最常見疾病，慢性支氣管炎或肺氣腫的早期，大多數患者有慢性咳嗽、咳痰癥狀，肺氣腫常與慢性支氣管炎并存，一般病程較長，當患者病情嚴重到一定程度，肺功能檢査出現持續氣流受限時，則診斷為慢阻肺[5]。本實驗研究了白及顆粒對COPD模型的影響，為白及顆粒的臨床應用提供了藥效學實驗研究基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器 BX53型奧林巴斯顯微鏡。DHP-9082型電熱恒溫培養箱，上海合恒儀器設備有限公司。KD-PⅢ型攤片機，北京世紀科信科學儀器有限公司。KD-H型烤片機，北京世紀科信科學儀器有限公司。徠卡石蠟切片機，德國（徠卡）生產。酶標分析儀，北京普朗新技術有限公司。Alpha1502型紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司。DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀，北京六一儀器廠。KB-900型智能脫色搖床，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 動物 SPF級健康SD大鼠60只，體質量180～220 g，雄性，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。

1.3 藥品和試劑 白及顆粒：云南永安制藥有限公司，規格：10 g/袋（相當于 10g生藥），批號 20171206，服用方法：開水沖服。每次10 g，每日2次。水合氯醛：北京市旭東化工廠，批號20160730。脂多糖（LPS），Sigma公司。多聚甲醛，批號：F20170503，國藥集團化學試劑有限公司。無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司，批號20170121。二甲苯，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20161125。枸櫞酸，批號：20170621，國藥集團化學試劑有限公司。TMS-P超敏試劑盒，批號：1703031405，福建邁新生物技術開發有限公司。枸櫞酸鈉，批號：20170713，國藥集團化學試劑有限公司。磷酸鹽緩沖液（PBS），批號：20170815，北京Solarbio科技有限公司。α-1抗胰蛋白酶抗體（α-1 antitrypsin），北京博奧森生物技術有限公司。中性粒細胞彈性蛋白酶抗體（Neutrophil Elastase），北京博奧森生物技術有限公司。髓過氧化物酶抗體（MPO），北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 模型制備 取60只SPF級健康雄性SD大鼠（180～220）g，除預留空白對照組大鼠 10只外，其余50只均用于制備COPD大鼠模型。于實驗第1、15天（每隔2周1次）以3.5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，造模大鼠采用一次性氣管插管法經氣管注入0.2 mL LPS溶液（用生理鹽水配制為1 mg/mL溶液）。第15天除外第2～28天每天給予煙熏，放入自制的有機玻璃密閉熏煙箱內，每次10只，用8支香煙，煙熏每天2次，每次30 min。將麻醉大鼠仰臥位固定在鼠板上，頭高尾低呈45°角放置，暴露聲門，在光源下將套管針迅速插入大鼠氣管內，拔出套管針鋼芯，以棉絲放在塑料套管外口插管成功后，先抽取空氣0.3 mL后抽取LPS溶液0.2 mL，通過套管針快速注入氣管。然后將大鼠固定板直立旋轉，左右搖晃30次，使LPS液能夠均勻分布于兩肺[6]。

1.5 分組給藥 除10只空白對照組大鼠，另取50只造模大鼠，隨機分為模型對照組、羧甲司坦片組（0.14 g/kg）、白及顆粒高劑量組（生藥5.4 g/kg）、白及顆粒中劑量組（生藥3.6 g/kg）、白及顆粒低劑量組（生藥1.8 g/kg）。灌胃給藥，每日1次，連續4周，末次給藥1 h后使用動物呼吸功能測定儀測定大鼠第0.3秒呼氣容積與肺活量比值（FEV 0.3/FVC%）。

1.6 樣品提取與保存 實驗結束，取左肺4%多聚甲醛溶液固定，右肺各葉-80℃保存。

1.7 肺組織形態學檢測[7]常規脫水、透明、浸蠟、包埋及切片。蘇木精-伊紅（HE）染色：觀察肺組織炎性細胞浸潤，進行炎癥病理學評分。HE染色肺臟病理分級：0級，無炎癥；1級，輕度炎癥，炎性細胞浸潤，病變范圍小于10%；2級，中度炎癥，肺泡間隔增厚，病變范圍占10%～30%；3級，重度炎癥，炎性細胞浸潤，肺泡間隔增厚，病變范圍大于30%。

1.8 免疫組化法測定肺組織α-1 antitrypsin、中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）及MPO表達 石蠟切片脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育10 min，10%山羊血清封閉 10 min，滴加 Ι抗（α-Antitrypsin 1∶400；NE 1∶450；MPO 1∶400[8]），37℃孵育2 h，滴加適量生物素標記Ⅱ抗，37℃孵育30 min。滴加適量的辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。DAB顯色劑顯色，沖洗，復染，脫水，透明，封片。免疫組化圖片采用Image J軟件進行灰度值分析，計算各組平均光密度值（IOD）。IOD=log[gv0/gv）]，gv0 為背景灰度值，gv為目標區灰度值。

1.9 Western Blot法測定肺組織Neutrophil Elastase、MPO表達 取適量肺組織，提蛋白，取上清液，BCA法蛋白定量。將蛋白樣品直接上樣到SDSPAGE膠加樣孔內，開始時電壓80 V，后增加到180 V，電泳到染料抵達分離膠底部。將蛋白后轉印至PVDF膜上。封閉1 h，加Ι抗（中性粒細胞彈性蛋白酶抗體封閉液稀釋濃度1∶650；髓過氧化物酶抗體封閉液稀釋濃度1∶800）4℃孵化過夜。TBST清洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（封閉液稀釋濃度 1∶4 000），室溫孵育 2 h，ECL 法顯色曝光，使用Image J軟件分析圖像。結果以相對光密度值表示，相對光密度值=目的蛋白光密度值/β-action光密度值。

1.10 統計學方法 所有數據采用SPSS 24.0軟件進行統計處理，以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 白及顆粒對大鼠COPD模型肺功能的影響 與空白對照組相比，模型對照組FEV 0.3/FVC%顯著降低（P<0.01），與模型對照組相比，白及顆粒低劑量組、白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組、羧甲司坦片組FEV 0.3/FVC%顯著升高（P<0.05或P<0.01）。見表 1。

表1 各組FEV 0.3/FVC%的比較（±s）Tab.1 Comparison of FEV 0.3/FVC% in each group（±s）

表1 各組FEV 0.3/FVC%的比較（±s）Tab.1 Comparison of FEV 0.3/FVC% in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 動物數 劑量（g/kg） FEV0.3/FVC%（%）空白對照組 10 — 88.69±0.93模型對照組 10 — 78.57±1.93*羧甲司坦片組 10 0.14 84.37±1.42##白及顆粒低劑量組 10 1.8 81.38±1.53#白及顆粒中劑量組 10 3.6 82.75±1.36#白及顆粒高劑量組 10 5.4 83.63±1.77#

2.2 白及顆粒對大鼠慢阻肺模型肺臟HE染色病理分級的影響 與空白對照組相比，模型對照組HE染色病理分級顯著增加（P<0.01），與模型對照組相比，白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組、羧甲司坦片組HE染色病理分級顯著降低（P<0.05或P<0.01）。見表 2，圖 1。

表2 各組肺臟HE染色病理分級的比較（±s）Tab.2 Comparison of pathological grades of lung in each group（±s）

表2 各組肺臟HE染色病理分級的比較（±s）Tab.2 Comparison of pathological grades of lung in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 動物數 劑量（g/kg） 病理分級（級）空白對照組 10 — 0模型對照組 10 — 2.5±0.3*羧甲司坦片組 10 0.14 1.5±0.4##白及顆粒低劑量組 10 1.8 2.3±0.3白及顆粒中劑量組 10 3.6 1.7±0.3#白及顆粒高劑量組 10 5.4 1.4±0.4##

圖1 大鼠肺組織HE結果（×200）Fig.1 HE results of rat lung tissue(×200)

2.3 白及顆粒對大鼠慢阻肺模型肺臟α-1 antitrypsin表達的影響 與空白對照組相比，模型對照組肺臟細胞α-1 antitrypsin表達顯著增加（P<0.05），與模型對照組相比，白及顆粒低劑量組、白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組、羧甲司坦片組肺臟細胞α-1antitrypsin表達顯著增加（P<0.05或P<0.01）。見表 3，圖 2。

2.4 白及顆粒對大鼠慢阻肺模型肺臟NE表達的影響 與空白對照組相比，模型對照組肺臟細胞NE表達顯著增加（P<0.01），與模型對照組相比，白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組、羧甲司坦片組肺臟細胞NE表達顯著降低（P<0.05或P<0.01）。見表 4，圖 3。

2.5 白及顆粒對大鼠慢阻肺模型肺臟MPO表達的影響 與空白對照組相比，模型對照組肺臟細胞MPO表達顯著增加（P<0.01），與模型對照組相比，白及顆粒低劑量組、白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組、羧甲司坦片組肺臟細胞MPO表達顯著降低（P<0.05或P<0.01）。見表5，圖4。

表3 各組免疫組化染色肺臟細胞α-1 antitrypsin表達的比較（±s）Tab.3 Comparison of α-1 antitrypsin expression in lung cells of each group（±s）

表3 各組免疫組化染色肺臟細胞α-1 antitrypsin表達的比較（±s）Tab.3 Comparison of α-1 antitrypsin expression in lung cells of each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 動物數 劑量（g/kg） IOD空白對照組 10 — 0.035±0.008模型對照組 10 — 0.107±0.011*羧甲司坦片組 10 0.14 0.241±0.032##白及顆粒低劑量組 10 1.8 0.134±0.024#白及顆粒中劑量組 10 3.6 0.183±0.022##白及顆粒高劑量組 10 5.4 0.223±0.038##

圖2 大鼠肺組織α-1 antitrypsin表達的結果（×200）Fig.2 Results of α-1 antitrypsin expression in rat lung（×200）

表4 各組免疫組化染色肺臟細胞NE表達的比較（±s）Tab.4 Comparison of NE expression in lung cells of each group（±s）

表4 各組免疫組化染色肺臟細胞NE表達的比較（±s）Tab.4 Comparison of NE expression in lung cells of each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 動物數 劑量（g/kg） IOD空白對照組 10 — 0.074±0.015模型對照組 10 — 0.387±0.081*羧甲司坦片組 10 0.14 0.153±0.038##白及顆粒低劑量組 10 1.8 0.335±0.066白及顆粒中劑量組 10 3.6 0.272±0.063#白及顆粒高劑量組 10 5.4 0.218±0.072##

圖3 大鼠肺組織NE表達的結果（×200）Fig.3 Results of NE expression in rat lung tissue(×200)

表5 各組免疫組化染色肺臟細胞MPO表達的比較（±s）Tab.5 Comparison of MPO expression in lung cells of each group（±s）

表5 各組免疫組化染色肺臟細胞MPO表達的比較（±s）Tab.5 Comparison of MPO expression in lung cells of each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05。

組別 動物數 劑量（g/kg） IOD空白對照組 10 — 0.075±0.021模型對照組 10 — 0.537±0.061*羧甲司坦片組 10 0.14 0.337±0.069*白及顆粒低劑量組 10 1.8 0.424±0.094#白及顆粒中劑量組 10 3.6 0.379±0.082#白及顆粒高劑量組 10 5.4 0.301±0.078*

圖4 大鼠肺組織NE表達的結果（×200）Fig.4 Results of NE expression in rat lung tissue(×200)

2.6 Western blot法檢測大鼠肺臟NE和MPO的水平結果 與空白對照組相比，模型對照組NE和MPO蛋白表達顯著增高（P<0.01），與模型對照組相比，白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組、羧甲司坦片組NE表達均顯著降低（P<0.05或P<0.01），見表6。與模型對照組相比白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組、羧甲司坦片組MPO表達均顯著降低（P<0.05），結果見圖 5。

3 討論

COPD大多是由慢性支氣管炎、支氣管哮喘等發展而來。其主要病理改變是由于病原微生物造成支氣管黏膜不同程度的纖維增生或潰瘍，導致氣道狹窄和阻塞以及細支氣管周圍炎，從而造成纖毛運動障礙和痰液分泌增多，痰液不易排出而阻塞，進一步發展為支氣管壁潰瘍，形成肉芽組織，小支氣管塌陷，從而形成阻塞性肺氣腫[9]。

COPD是以持續存在的呼吸道癥狀，氣道黏液高分泌氣道阻塞同時肺功能快速下降為特征。慢阻肺存在不完全可逆性氣流受限是診斷慢阻肺的必備條件[10]。肺功能測定指標是診斷慢阻肺的金標準，FEV1<80%預計值可確定為不完全可逆性氣流受限[11]。本研究結果表明白及顆粒低劑量組、白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組FEV0.3%顯著增加。

表6 大鼠肺臟NE和MPO表達的相對光密度值（±s）Tab.6 Relative optical density values of NE and MPO expression in lungs of each group（±s）

表6 大鼠肺臟NE和MPO表達的相對光密度值（±s）Tab.6 Relative optical density values of NE and MPO expression in lungs of each group（±s）

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 動物數 劑量（g/k g） N E M P O空白對照組 3 — 0.1 5±0.0 6 0.1 1±0.0 5模型對照組 3 — 0.5 4±0.2 1** 0.4 9±0.1 6**羧甲司坦片組 3 0.1 4 0.2 6±0.0 7## 0.2 7±0.1 3#白及顆粒低劑量組 3 1.8 0.4 2±0.1 5 0.3 6±0.1 3白及顆粒中劑量組 3 3.6 0.2 6±0.0 9## 0.3 1±0.1 2#白及顆粒高劑量組 3 5.4 0.3 1±0.1 2# 0.2 9±0.1 4#

圖5Westernblot法檢測大鼠肺臟NE和MPO的水平結果Fig.5 Results of Western blot detection of NE and MPO in rat lungs

黏蛋白是氣道黏液的主要成分，是由儲存在氣道上皮杯狀細胞及黏膜下腺的胞內顆粒分泌而來的。中性粒細胞彈性蛋白酶是目前已知的促黏蛋白分泌的最重要的誘導劑[12]。與肺氣腫發生有關的內源性蛋白酶主要是中性粒細胞和單核細胞釋放的彈性蛋白酶。中性粒細胞彈性蛋白酶能降解肺組織中的彈性硬蛋白及結締組織基質中的膠原蛋白，破壞肺泡壁的結構。肺泡壁破壞、彈性減弱，更影響到肺的排氣能力，末梢肺組織則因殘氣量不斷增多而發生擴張，肺泡孔擴大，肺泡間隔也斷裂，擴張的肺泡互相融合形成氣腫囊腔。病變累及肺腺泡的各個部位，從終末呼吸細支氣管直至肺泡囊和肺泡均呈彌漫性擴張，遍布于肺小葉內。如果肺泡間隔破壞較嚴重，氣腫囊腔可融合成直徑超過1 cm的大囊泡，形成大泡性肺氣腫[13]。慢性支氣管炎伴有肺感染，尤其是吸煙者，肺組織內滲出的中性粒細胞和單核細胞較多，可釋放多量彈性蛋白酶。同時，中性粒細胞和單核細胞還可生成大量氧自由基，能氧化α-1 antitrypsin活性中心的蛋氨酸使之失活[14]。α-1 antitrypsin乃彈性蛋白酶的抑制物，失活后則增強了彈性蛋白酶的損傷作用。α-1 antitrypsin缺乏是引起原發性肺氣腫的原因，α-1 antitrypsin缺乏的家族，肺氣腫的發病率比一般人高15倍，主要是全腺泡型肺氣腫。α-1 antitrypsin為呼吸系統的非特異性可溶因子，與呼吸道抵抗力關系密切，它可抑制多種酶的活性，包括細菌的酶，以及中性白細胞溶酶體分泌的蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、纖維蛋白溶酶和凝血酶。α-1 antitrypsin的缺乏與慢性阻塞性肺病的形成關系密切，因為它的缺乏，不能及時控制感染和炎癥產生的多種蛋白酶，而造成肺組織破壞。

MPO是中性粒細胞的激活標志，其水平變化代表著嗜中性多形核白細胞的活性狀態[15]。MPO的主要功能是在吞噬細胞內殺滅微生物，利用過氧化氫和氯離子產生次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基。MPO不僅能殺滅吞噬于細胞內的微生物，而且可釋放到細胞外，破壞多種靶物質，如腫瘤細胞、原蟲、毒素等，對機體產生和調節炎癥反應等多方面發揮作用。然而，在特定條件下，MPO催化反應生成的氧化劑超過局部抗氧化劑的防御反應時，就會導致氧化性組織損傷[16]，炎癥向管壁周圍組織及肺泡擴展，導致細支氣管周圍炎，而且還可發生纖維閉塞性細支氣管炎，是引起慢性阻塞性肺氣腫的病變基礎。阻塞性通氣障礙慢性細支氣管炎時，由于小氣道的狹窄、阻塞或塌陷，導致了阻塞性通氣障礙，使肺泡內殘氣量增多，肺泡擴張，間隔變窄，肺泡孔擴大，肺泡間隔斷裂，擴張的肺泡融合成較大的囊腔。病理檢測結果顯示：白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組HE染色炎癥分級顯著降低；白及顆粒劑低劑量組、白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組大鼠肺臟細胞α-1 antitrypsin表達顯著增加；白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組大鼠肺臟細胞NE表達顯著降低；白及顆粒低劑量組、白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組大鼠肺臟細胞MPO表達顯著降低。蛋白印跡檢測結果顯示：白及顆粒中劑量組、白及顆粒高劑量組大鼠肺組織內NE及MPO表達顯著降低。

白及顆粒可能通過增加慢阻肺模型大鼠肺臟α-1 antitrypsin表達，降低NE及MPO的表達，起到減輕慢阻肺模型大鼠肺組織細胞炎癥反應，最終產生改善慢阻肺模型大鼠肺功能的藥理作用。