蔥白提取物誘導PGC-1α活化非酒精性脂肪性肝病大鼠線粒體代謝的研究*

劉云 ，郭潔 ，張曼玲 ，時昭紅 ，

（1.湖北中醫藥大學，武漢 430065；2.武漢市第一醫院，武漢 430022）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝臟損傷，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征，包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化[1]。NAFLD除直接或通過促進并存的其他肝病的進展，導致肝衰竭和肝細胞癌（HCC）外，還參與2型糖尿病和動脈硬化的發病，是導致慢性肝病的重要原因之一[2]。

本課題組前期通過動物實驗發現，中劑量（50 mg/kg）蔥白提取物每日灌胃可顯著改善NAFLD大鼠脂肪肝變性[3]，并通過上調過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）與過氧化物酶體增殖物受體γ輔助激活因子1α（PGC-1α）從而促進肝臟脂肪分解消耗[4]。近年來，隨著線粒體功能障礙在NAFLD中的樞紐作用、轉錄輔助激活因子PGC-1α及其信號活化通路的發現[5]，調控此線粒體代謝關鍵基因進而阻斷NAFLD進展已成為治療和新藥研發的重點。前期研究已經表明辛溫通陽中藥蔥白提取物能夠上調NAFLD大鼠肝細胞內PGC-1α表達，而PGC-1α的上調能影響哪些線粒體代謝關鍵分子靶點，從而減少肝細胞內脂肪浸潤及氧化損傷對揭示蔥白提取物治療NAFLD有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物及細胞系 SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠 48 只，6～8 周齡，體質量 180～220 g，由湖北省疾病控制中心提供。合格證編號：SCXK（鄂）2008－0005；293T細胞系，購于賽默飛公司。

1.2 藥物與試劑 蔥白提取物來自于華夏小蔥根莖，由武漢市第一醫院藥劑研究室采用超臨界二氧化碳萃取工藝提取[6]，為褐色粉末狀，批號：20110902，以適量植物油調配成為懸混液，控制濃度為5 g/L；D12492高脂飼料（H10060），含60%能量，購于賽諾公司；由武漢巴菲爾生物有限公司提供空載腺病毒及PGC-1αRNAi腺病毒，PGC-1αRNAi腺病毒滴度：109 pfu/mL。PGC-1α 抗體（PA5-22958）、線粒代謝相關蛋白細胞色素c氧化酶B（COX-B）抗體（ab15191）、線粒體轉錄因子（TFAM）抗體（sc-166965）、細胞色素c氧化酶合成蛋白（SCOX）抗體（sc-98499）、中鏈酰基輔酶 A 脫氫酶（MCAD）抗體（sc-98926）、核呼吸因子 1（NRF-1）抗體（sc-54134）購于 Santa Cruz公司，HRP標記羊抗兔二抗（BA1054）、HRP標記兔抗羊二抗（BA1060）、β-actin抗體（BM0627）購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 Sigma30高速低溫離心機（法國，Sigma公司），HITACHI7160全自動生化檢測儀（日本，HITACHI），微量移液器（Eppendorf公司），電泳儀電源（北京六一儀器廠，DYY-7C），垂直電泳槽（北京六一儀器廠，DYCZ-24DN），電轉儀（北京六一儀器廠，DYCZ-40）；水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，TS-1），pH計（德國Metter-Toledo GmbH公司，LP115），電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司，CPA）；P4000高效液相色譜儀（美國TSP公司），二極管陳列檢測器（美國TSP公司，UV6000），熒光定量 PCR 儀（ABI7500，美國Temo公司）。

2 方法

2.1 造模方法 48只SD大鼠飼養于武漢市第一醫院動物房，晝夜節律12 h∶12 h，即晨6時開燈，晚6時關燈，20～24℃，25%相對濕度，自由飲水，適應性飼養7 d后，除外8只空白組大鼠給予維持飼料外，其余40只大鼠給予高脂飼料喂養12周。

2.2 造模后給藥 高脂飼料喂養12周后結束造模，空白組大鼠繼續給予普通飼料持續喂養，另外40只大鼠隨機分為模型組、蔥白組、轉染組、空轉組及轉染加蔥白組，每組各8只，5組大鼠繼續給予高脂飼料喂養；空白組大鼠每日生理鹽水1 mL腹腔注射和3 mL生理鹽水灌胃；蔥白組大鼠每日蔥白提取物灌胃1次，蔥白提取物灌胃計量為50 mg/kg，同時生理鹽水1 mL腹腔注射；轉染組大鼠每日給予腸系膜上靜脈（SMV）皮下置管給藥 0.05 mg/kg，同時予以3mL生理鹽水灌胃；空轉組大鼠每日給予SMV皮下置管注射空載體病毒0.05 mg/kg，同時予以3 mL生理鹽水灌胃；轉染加蔥白組大鼠每日給予SMV皮下置管給藥0.05 mg/kg及50 mg/kg蔥白提取物灌胃。各組操作固定每日下午，共持續進行4周。

2.3 標本采集 藥物處理4周后，大鼠禁食不禁水12 h，以3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，靜置一段時間，待血液分層后與4℃，3 000 r/min離心15 min，離心半徑4 cm，分離血清，-80℃凍存備用。同時取出肝臟，稱質量，用4℃生理鹽水沖洗，常規進行蘇木精-伊紅（HE）及紅油染色。

2.4 觀察指標及方法 觀察大鼠進食、毛發、糞便、活動量情況。

2.4.1 化學合成的PGC-1α小干擾RNA的構建與應用 化學合成的PGC-1α小干擾RNA（SiRNA）參照設計的序列：反義鏈5’-CCACCTAACTTCACCACATCT3-’，正義鏈 5’-AGATGTGGTGAATTTAGGTGG-3’，將化學合成的PGC-1αsiRNA轉染至NAFLD進展期大鼠，采用經SMV皮下置管給藥通路。麻醉大鼠后，腹中線切開，顯露SMV，將24號穿刺導管針從SMV分支插入。固定后，以硬膜外導管續接引入皮下，外接肝素帽后固定，供siRNA注射用。采用熒光實時定量聚合酶鏈式反應（Realtime PCR）檢測PGC-1α的表達，驗證轉染成功。

2.4.2 肝組織病理學檢查 在各組大鼠肝右葉相同處取適量肝組織，于10%甲醛溶液中固定，再經脫水后以石蠟包埋，最后進行HE及紅油染色，在光學顯微鏡下觀察肝臟的病理變化。并按照NAFLD活動性評分（NAS評分）標準進行打分[5]。

2.4.3 血清中高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量測定 生化檢測儀測定各組大鼠血清中HDL-C、LDL-C、TC、TG 含量。

2.4.4 RNA的提取和逆轉錄聚合酶鏈反應 引物設計見表1，Trizol試劑一步反向引物法抽提肝組織總RNA，紫外分光光度儀檢測其濃度及純度，1%瓊脂糖變性電泳檢測RNA完整性。用M-MLV逆轉錄酶進行反轉錄，PCR擴增上述基因，同時擴增βactin蛋白作內參照。取6～10 μL擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀上觀察、照相。

2.4.5 Western Blot檢測組織細胞蛋白的表達 取肝組織勻漿，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌離心3次，加蛋白提取液200 μL混勻，沸水煮10～15 min后，12 000 r/min離心30 min，離心半徑4 cm，取上清液，測總蛋白濃度，-20℃保存備用。配制10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠，樣品加熱變性后每孔加80μg蛋白，電泳分離，電轉移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉4℃搖動封閉過夜，膜在一抗中室溫下孵育2 h，TBS洗滌，二抗室溫2 h。加顯色液1 μL，X線底片曝光，顯影、定影，并對底片上反應條帶行計算機密度掃描定量分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.5 統計學方法 使用SPSS 24.0軟件對所有數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 PGC-1α RNAi腺病毒及空載體腺病毒包裝及轉染率實驗 在實驗各組大鼠中進行PGC-1α RNAi腺病毒轉染驗證。結果顯示空白組1.12±0.09，模型組 0.65±0.03，蔥白組 1.04±0.07，轉染組 0.34±0.02，空轉組 0.66±0.05，轉染加蔥白組 0.71±0.11。和空轉組比，轉染組PGC-1α mRNA的表達水平明顯降低（P＜0.01），證實轉染成功。和空白組比，模型組PGC-1α mRNA的表達水平降低（P＜0.01），證實NAFLD發生發展過程與PGC-1α失活相關。和模型組比，蔥白組PGC-1α mRNA的表達水平增加（P＜0.01），轉染加蔥白組差異無統計學意義。見圖1。

圖1 PGC-1αRNAi腺病毒實驗各組大鼠肝臟PGC-1α mRNA 表達的影響（±s，n=8）Fig.1 Effect of PGC-1αRNAi adenovirus on PGC-1α mRNA expression of rat liver in each group（±s，n=8）

3.2 蔥白提取物對NAFLD大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平及肝臟脂代謝蛋白乙酰輔酶A羥化酶（ACCase）、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶-1（CPT-1）mRNA的影響 高脂飼料可顯著影響大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平，與空白組比較，模型組NAFLD大鼠血清TC、TG、LDL-C的表達水平均升高，HDL-C水平下降（P＜0.01）；而蔥白提取物可改善高脂飲食對血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影響，與模型組比較，通過蔥白提取物灌胃后蔥白組大鼠血清TC、TG、LDL-C表達水平均降低，HDL-C水平升高（P＜0.01）；轉染組、空轉組及轉染加蔥白組與模型組間的差異無統計學意義，見圖2。

為驗證蔥白提取物對肝臟脂質合成的影響，我們檢測了脂肪酸合成與分解關鍵限速酶ACCase與CPT-1 mRNA的表達。與空白組相比較，模型組大鼠ACCasemRNA 表達升高（P＜0.05），而CPT-1mRNA表達降低（P＜0.05）；與模型組相比，蔥白組 ACCase mRNA 表達明顯降低（P＜0.01），而 CPT-1 mRNA 表達明顯升高（P＜0.01），見圖3。與模型組相比，轉染組和轉染加蔥白組未見明顯異常。

3.3 蔥白提取物對NAFLD大鼠肝臟組織病理學影響 從肝臟外觀來看，空白組大鼠肝臟色澤鮮紅，表面光滑，邊緣銳利；蔥白組接近正常對照組，無明顯油膩狀，指壓有彈性，體積大小接近正常對照組；其余4組大鼠肝臟肉眼觀體積增大，顏色淺黃，質軟，邊緣變鈍，表面帶油膩感。

從HE染色結果來看，空白組細胞基本無異常變化，未見明顯脂滴空泡；模型組，空轉組，轉染組及轉染加蔥白組細胞胞漿內充滿大小不等的脂滴空泡，部分肝細胞核被擠到一邊，細胞腫脹，同時可見用紅色箭頭標記的炎性細胞浸潤；蔥白組細胞內脂滴明顯少于模型組。

從油紅染色結果來看，空白組肝細胞邊緣清晰，核大，細胞內未見紅色脂滴聚集；模型組，空轉組及轉染組肝細胞邊緣欠清晰，細胞間結合欠緊密，胞漿內充滿大小不等的紅色脂滴，細胞發生明顯的腫脹；蔥白組肝細胞內橘紅色脂滴明顯少于模型組，轉染加蔥白組肝細胞內紅色脂滴介于模型組和蔥白組之間。

圖 2 實驗各組大鼠血清 TG、TC、HDL-C、LDL-C 濃度比較（mmol/L，±s，n=8）Fig.2 Comparison of serum concentrations of TG，TC，HDL-C and LDL-C of rats in each group（mmol/L，±s，n=8）

圖3 實驗各組大鼠肝臟ACCase mRNA、CPT-1mRNA的表達（±s，n=8）Fig.3 Expression of ACCase and CPT-1 mRNA of rats in each group（±s，n=8）

通過肝細胞氣球樣變、小葉內炎癥及肝細胞脂肪變3方面進行NAS評分，其結果顯示與空白組大鼠相比，高脂飲食造成的模型組大鼠的NAS評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，經蔥白提取物處理后的蔥白組大鼠肝臟NAS評分有明顯改善（P＜0.01）；空轉組，轉染組，轉染加蔥白組未見明顯差異。見圖 4，圖 5。

3.4 蔥白提取物對NAFLD大鼠肝臟線粒體合成的影響 細胞凋亡是NAFLD疾病進展的最要標志之一，而肝細胞凋亡的途徑主要有兩種，即死亡受體通路及線粒體通路[7-8]。因此，本實驗研究了蔥白提取物對NAFLD大鼠肝臟線粒體合成的影響。在實驗各組大鼠中，與空白組比較，模型組大鼠肝臟的PGC-1α、NRF-1、TFAM 蛋白的表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，蔥白組大鼠肝臟的PGC-1α、NRF-1、TFAM蛋白表達升高（P＜0.01）；與空轉組比較，轉染了PGC-1αSiRNA的轉染組大鼠中PGC-1α、NRF-1、TFAM蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

3.5 蔥白提取物對NAFLD大鼠肝臟線粒體代謝功能的影響 實驗研究表明，線粒體呼吸連中關鍵限速酶的下降，可導致電子傳遞的紊亂，致使線粒體的腫脹、凋亡，進而引起“二次打擊”[9-12]。因此，本實驗對線粒體呼吸鏈關鍵分子靶點進行了研究，以驗證蔥白提取物對其影響。在實驗各組大鼠中，與正常組比較，模型組的線粒體代謝功能相關蛋白 COX-B、SCOX、MCAD 的表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，蔥白組的COX-B、SCOX、MCAD蛋白表達升高（P＜0.01）；與空轉組比較，轉染組的COX-B、SCOX、MCAD 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖7。

圖4 實驗各組大鼠肝臟組織HE及紅油染色Fig.4 HE and red oil stain of rat liver tissue of rats in each group

圖5 實驗各組大鼠肝臟NAS量表評分（±s，n=8）Fig.5 NAS scale scores of liver of rats in each group（±s，n=8）

4 討論

NAFLD的發病機制雖尚未完全明了，但“二次打擊”學說為目前醫學界廣泛接受。第1次打擊是以胰島素抵抗（IR）為中心的肝內脂肪的蓄積，第2次打擊是氧化磷酸化的激活、呼吸鏈的損傷導致能量代謝障礙、細胞因子活化，從而引起炎癥和纖維化[13]。

線粒體的合成和代謝功能的紊亂是NAFLD疾病進展的關鍵因素之一。線粒體被譽為“人體的化工廠”，在肝細胞線粒體中存在著多種代謝反應，它既是肝細胞三磷酸腺苷（ATP）合成的場所，又是脂肪酸β氧化和肝糖異生的主要場所[14]。線粒體代謝功能失調參與了NAFLD的發生發展。在NAFLD早期，肝糖異生增加與IR密切相關。隨著病情進展，可使線粒體超微結構出現了損傷，其呼吸鏈復合物的量及活性下降，合成ATP的功能障礙。因此，線粒體代謝障礙與胰島素抵抗，氧應激，脂質過氧化和ATP合成減少等均密切相關，是NAFLD發生發展的關鍵。保護肝細胞線粒體，提高肝細胞抗氧化能力，阻止過氧化應激反應，對于減少肝臟脂肪沉積并避免因“二次打擊”而導致肝功能失代償具有重要意義[15]。

圖6 大鼠肝臟PGC-1α、NRF-1、TFAM蛋白的表達水平條帶圖及灰度統計圖（±s，n=8）Fig.6 Histogram and gray scale statistical map of the levels of PGC-1α，NRF-1，TFAM in rat liver tissue detected by Western Blot（±s，n=8）

圖7 大鼠肝臟COX-B、SCOX、MCAD蛋白的表達水平條帶圖及灰度統計圖（±s，n=8）Fig.7 Histogram and gray scale statistical map of the levels of COX-B，SCOX，MCAD in rat liver tissue detected by Western Blot（±s，n=8）

通過血生化檢查，證實蔥白提取物能改善NAFLD大鼠血脂水平，可顯著降低血清TG、TC、LDL-C濃度，升高血清HDL-C濃度。同時，蔥白提取物可降低脂質合成基因ACCase[16]的表達，并升高促進脂肪酸氧化分解基因CPT-1[17]的表達。通過HE染色及紅油染色，證實蔥白提取物能改善NAFLD大鼠肝臟小葉內炎癥、肝細胞氣球樣變及肝細胞脂肪變。

PGC-1α在肝臟中最重要的作用是通過促進NRF-1和2，雌激素相關受體α（ERRα）以及轉錄抑制蛋白陰陽1（YY1）的轉錄來增加肝細胞線粒體生物合成[18-20]。其中，NRFs可通過調節TFAM表達的，TFAM作為線粒體DNA轉錄因子，可控制線粒體內DNA復制、保存以及表達，雖然ERRα和YY1同樣具有上述作用，但任然是NRFs占主導地位[21]；同時，NRFs還可控制編碼氧化磷酸化蛋白的核基因的表達[22]。因此，PGC-1α可同時上調線粒體DNA和線粒體DNA編碼的蛋白的數量，進而增加脂肪酸氧化、檸檬酸循環和氧化磷酸化的能力。

通過比較模型組與蔥白組NRF-1、TFAM蛋白的表達，實驗發現蔥白提取物是通過上調PGC-1α表達來增加肝細胞線粒體DNA及其編碼蛋白的表達，對維持正常的線粒體功能有重要作用。

進一步的研究表明NRF-1，TFAM表達的下降可影響線粒體呼吸鏈的穩定[23]。線粒體呼吸鏈是由多種酶所共同構成，如 SCOX，COX-B，MCAD[24]。

因此，在本次實驗中驗證了蔥白提取物對線粒體呼吸鏈穩定性的影響。筆者發現在模型組大鼠中PGC-1α、SCOX、COX-B以及MCAD的表達共同下降，呈正相關性；與模型組大鼠相比，蔥白組大鼠在運用蔥白提取物后 PGC-1α、SCOX、COX-B、MCAD蛋白表達上調，證實蔥白提取物可通過上調PGC-1α，增加SCOX、COX-B、MCAD蛋白的表達，進而維持線粒體呼吸鏈穩定性。

綜上所述，通過運用辛溫通陽的蔥白提取物可誘導PGC-1α的高表達，PGC-1α作為轉錄輔助因子可促進線粒體的生物合成相關蛋白NRF-1、TFAM上調，而NRF-1、TFAM上調可增加氧化還原反應關鍵蛋白SCOX、COX-B和MCAD，為維持呼吸鏈的穩定起到重要作用，使肝細胞維持正常的脂肪酸代謝及糖異生反應，從而減輕TG在肝臟的堆積，可達到治療脂肪肝變性的目的。