三陰性乳腺癌組織PD-1/PDL-1表達與腫瘤臨床特征和T淋巴細胞免疫功能的相關性分析

王鋼樂，董 懿，劉 恒

乳腺癌目前仍然是威脅全世界女性健康的主要惡性腫瘤，具有較高的發病率、復發率和病死率，并呈現年輕化趨勢[1]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer， TNBC)是指免疫組織化學染色顯示雌激素受體、孕激素受體和原癌基因Her-2均為陰性的一種特殊類型乳腺癌，約占乳腺癌總體的10.0%～20.8%，具有特殊的生物學行為和臨床病理特征，預后往往較差[2-3]。腫瘤的發生與惡性增殖、凋亡抑制、免疫逃逸、促血管新生、炎性反應等密切相關[4]。程序性死亡分子-1(PD-1)/程序性死亡配體-1(PDL-1)被證實參與多種腫瘤的發生和發展過程，鐘亞春等[5]研究指出，PD-1/PDL-1在乳腺癌組織中高表達，抑制T淋巴細胞的殺傷作用，并且與腫瘤TNM分期和直徑大小密切相關。呂淑貞等[6]則證實了乳腺癌組織PD-1/PDL-1高表達與腫瘤進展和不良預后密切相關。目前，關于TNBC和PD-1/PDL-1表達相關性方面的研究較少。因此，本研究主要探討TNBC患者腫瘤組織PD-1/PDL-1表達與腫瘤臨床特征和T淋巴細胞免疫功能的相關性，為明確TNBC的發生機制及臨床干預提供依據。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2018年6月—2020年2月我院經病理確診的TNBC患者76例作為TNBC組，納入標準：①年齡18～75歲；②接受手術切除腫瘤組織，且病理確診為TNBC；③自愿簽署本研究知情同意書。排除標準：①復發性乳腺癌、轉移性乳腺癌；②其他部位原發惡性腫瘤；③伴全身感染、自身免疫性疾病；④腫瘤標本不合格或被污染。另選取同時間段來我院就診的非TNBC患者124例作為非TNBC組，乳腺良性腫瘤患者50例作為良性組。

TNBC組年齡45～69(53.4±6.9)歲；體質量指數(BMI)20.8～24.6(22.5±1.3)kg/m2；單側腫瘤66例(左側32例、右側34例)，雙側10例；腫瘤直徑0.6～5.8(3.5±1.2)cm；導管癌32例，小葉癌44例；絕經45例，未絕經31例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期30例，Ⅲ期22例，Ⅳ期9例；低分化30例，中分化21例，高分化25例；淋巴結轉移24例。非TNBC組年齡43～72(54.5±7.2)歲；BMI 20.9～26.2(22.9±1.5)kg/m2；腫瘤直徑0.5～5.6(3.6±1.3)cm；單側90例(左側43例、右側47例)，雙側34例；導管癌53例，小葉癌71例；絕經69例，未絕經55例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例，Ⅲ期34例，Ⅳ期25例；低分化57例，中分化42例，高分化25例；淋巴結轉移15例。良性組年齡42～74(54.1±7.0)歲；BMI 21.2～26.1(22.6±1.4)kg/m2；腫瘤直徑0.7～5.9(3.4±1.1)cm；單側42例(左側20例、右側22例)，雙側8例；導管癌33例，小葉癌17例；絕經29例，未絕經21例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期21例，Ⅲ期14例，Ⅳ期5例；低分化16例，中分化24例，高分化10例；淋巴結轉移6例。3組年齡、BMI和腫瘤直徑等比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準實施。

1.2研究方法 分別采用免疫組織化學染色法和Western blot法檢測各組腫瘤組織中PD-1和PDL-1表達情況，采用流式細胞術檢測各組腫瘤組織T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+和調節性T細胞(Treg)百分比。采用Pearson相關分析探討3組PD-1和PDL-1定量表達與CD4+、CD8+和Treg百分比的相關性。采用單因素分析探討TNBC組PD-1和PDL-1表達與腫瘤臨床特征的關系。

1.2.1免疫組織化學染色：將各組手術切除的新鮮腫瘤標本，制成厚度約4 μm的20～30個組織切片。根據免疫組織化學染色檢測試劑盒和蛋白定量檢測試劑盒(美國Sigma公司生產)操作步驟完成相應的檢測過程。免疫組織化學染色過程中需要的兔抗人PD-1和PDL-1單克隆抗體一抗以及對應大鼠抗兔抗體二抗均購自美國R&D公司，以IgG抗體作為陰性對照。結果以200倍顯微鏡下計數視野中陽性細胞百分比，以黃染細胞為陽性細胞。每例隨機挑選3個組織切片，取平均值為最終結果。

1.2.2Western blot：各組手術切除腫瘤組織剪碎勻漿，加入細胞裂解液提取總蛋白，測定濃度和純度后應用內參β-actin抗體進行劑量標準化檢測。吸取30 μg樣本蛋白和等量內參蛋白，經冰浴變性、8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后將分離區帶電轉移至聚偏二氟乙烯膜，先后滴加羊抗人PD-1、PDL-1和β-actin抗體一抗(稀釋濃度為1︰2000，美國CA公司生產)靜置過夜，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后滴加兔抗羊二抗(稀釋濃度為1︰500，美國CA公司生產)室溫孵育4 h，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，ECL顯色。結果掃描保存，采用Lab Works4.5凝膠成像軟件(美國Invitrogen 公司生產)行半定量分析，結果以樣品蛋白與內參蛋白電泳條帶的灰度值比值表示。

1.2.3流式細胞術：各組手術切除腫瘤組織剪碎勻漿，加入磷酸緩沖鹽溶液調整濃度為2×106/ml，采用FACS Caliber型流式細胞儀進行檢測，根據預設淋巴細胞亞群種類進行染色，保證預觀察的淋巴細胞亞群損失降至最低，同時圖像清晰度滿意。

2 結果

2.1組間PD-1和PDL-1陽性表達情況比較 TNBC組PD-1和PDL-1陽性表達率明顯高于非TNBC組和良性組，且非TNBC組亦明顯高于良性組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者免疫組織化學染色(200×，DAB顯色劑加蘇木精復染) TNBC為三陰性乳腺癌，PD-1為程序性死亡分子-1，PDL-1為程序性死亡配體-1

表1 TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者PD-1和PDL-1陽性表達比較[例(%)]

2.2組間PD-1和PDL-1定量表達比較 TNBC組PD-1和PDL-1定量表達水平明顯高于非TNBC組和良性組，且非TNBC組亦明顯高于良性組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3組間T淋巴細胞亞群比較 TNBC組CD4+、CD8+和Treg百分比均明顯低于非TNBC組和良性組，且非TNBC組亦明顯低于良性組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4相關性分析 Pearson相關分析發現，PD-1和PDL-1定量表達與CD4+、CD8+和Treg百分比呈負相關性(P<0.01)。見圖4和表2。

圖2 Western blot法檢測TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者PD-1和PDL-1定量表達 A：TNBC組，B：非TNBC組，C：乳腺良性腫瘤組；TNBC為三陰性乳腺癌，PD-1為程序性死亡分子-1，PDL-1為程序性死亡配體-1，β-actin為內參。與非TNBC組同指標比較，aP<0.05；與良性組同指標比較，cP<0.05

圖3 流式細胞術檢測TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者T淋巴細胞亞群百分比 TNBC為三陰性乳腺癌,Treg為調節性T細胞；與非TNBC組同指標比較，aP<0.05；與良性組同指標比較，cP<0.05

2.5TNBC組PD-1和PDL-1表達與腫瘤臨床特征的關系 單因素分析顯示，TNBC組PD-1和PDL-1陽性表達率在患者年齡、BMI、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、絕經狀態方面無顯著差異(P>0.05)，但在腫瘤TNM分期、組織學分級和淋巴結轉移方面有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。見表3。

3 討論

腫瘤細胞凋亡或壞死不是雜亂無章的，而是眾多基因間相互高度協調共同作用的結果[7]。PD-1/PDL-1是介導腫瘤細胞凋亡和免疫逃逸的最重要途徑，PD-1屬免疫球蛋白，由268個氨基酸殘基組成；而PDL-1由CD274基因編碼，主要參與調控T淋巴細胞對腫瘤的識別、呈遞、細胞毒性和免疫殺傷作用[8-9]。

圖4 Pearson相關分析TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者PD-1和PDL-1定量表達水平與CD4+、CD8+和Treg百分比的相關性 TNBC為三陰性乳腺癌，PD-1為程序性死亡分子-1，PDL-1為程序性死亡配體-1,Treg為調節性T細胞

本研究發現，TNBC組PD-1和PDL-1陽性表達率和定量表達水平均明顯高于非TNBC組及良性組，且非TNBC組亦明顯高于良性組。提示PD-1和PDL-1高表達與TNBC的惡性程度有一定關系。PD-1通常被稱為免疫調節的“檢查點分子”，有助于維持自身的免疫耐受性[10]。PD-1在許多腫瘤浸潤的CD8+ T細胞、CD4+T細胞、自然殺傷T細胞、B細胞、活化單核細胞和樹突狀細胞上表達[11]。PD-1參與T細胞的調節，通過與配體(PDL-1或程序性死亡配體-2)形成復合物，傳遞抑制信號，從而抑制腫瘤增殖，發揮免疫系統的負調節作用[12]。本研究還發現，TNBC組CD4+、CD8+和Treg百分比均明顯低于非TNBC組和良性組，非TNBC組亦明顯低于良性組。提示TNBC患者常伴隨T淋巴細胞免疫功能的下降，該結果與免疫耐受和免疫逃逸的發生密切相關。PDL-1在造血細胞、內皮細胞、上皮細胞中大量表達，主要對炎癥和腫瘤的發生起調節作用[13-14]。特別是，PDL-1在腫瘤細胞中的表達已被證明能抑制T淋巴細胞活化和誘導T淋巴細胞凋亡[15]。臨床研究發現，抗PD-1單克隆抗體在大量預處理的TNBC隊列中報告的總體反應率為18.5%[16]。

表2 TNBC、非TNBC及乳腺良性腫瘤患者PD-1和PDL-1定量表達與CD4+、CD8+和Treg百分比的相關性分析

表3 TNBC患者PD-1和PDL-1表達與腫瘤臨床特征的關系(例)

本研究采用Pearson相關分析發現，PD-1和PDL-1定量表達水平與CD4+、CD8+和Treg百分比呈負相關性。提示乳腺癌患者PD-1和PDL-1表達常與T淋巴細胞亞群表達呈負相關性，也證實了PD-1和PDL-1與免疫抑制的重要聯系。雖然PDL-1介導免疫逃避機制，并被認為與預后不良有關，但是腫瘤細胞表達PDL-1可能在抑制免疫反應方面無效，可能僅反映淋巴細胞浸潤，在一些PDL-1高表達的惡性腫瘤中，這些腫瘤通常有良好的預后，包括乳腺癌[17-18]。其他研究也發現PDL-1并非總與預后不良相關，最近對非小細胞肺癌、黑色素瘤和結直腸癌的研究表明，PDL-1的表達與預后良好有關[19-20]。其中一項研究指出腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)與98%的PDL-1陽性腫瘤相關，并且發現PDL-1與TIL顯著相關，提示非小細胞肺癌PDL-1的表達可能反映了TIL介導的抗腫瘤炎性反應，而不是與腫瘤免疫逃逸有關[21]。

本研究單因素分析發現，TNBC組PD-1和PDL-1陽性表達率在腫瘤TNM分期、組織學分級和淋巴結轉移方面有顯著差異。但該發現與鐘亞春等[5]結論不一致，他認為腫瘤直徑>5 cm的乳腺癌組織中PD-1和PDL-1表達水平明顯高于直徑<5 cm的腫瘤組織。但總體來說，PD-1和PDL-1陽性表達與乳腺癌尤其是TNBC的惡性程度密切相關。

綜上，TNBC患者腫瘤組織中PD-1/PDL-1異常高表達可能與T淋巴細胞免疫功能抑制和腫瘤惡性生物學行為有關。本研究創新點在于比較了不同類型腫瘤組織中PD-1/PDL-1及T淋巴細胞亞群的表達情況，能夠直觀反映腫瘤浸潤的微環境變化，闡述PD-1/PDL-1表達與T淋巴細胞主導的免疫功能的相互作用機制。但本研究所采用樣本來源為單中心，樣本量有限，且未動態觀察各指標變化情況，因此仍需后續研究加以證實本文結論。