傷濕祛痛膏的UPLC-Orbitrap-MSn成分分析及其抗氧化、抗炎作用研究

陳揚，李朝峰，張雪，趙苑伶，劉妍，劉靜，趙崇軍，林瑞超，馬志強*

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.中藥品質評價北京市重點實驗室，北京 100102）

類風濕性關節炎是一種常見的自身免疫性疾病，多見四肢關節滑膜炎，與T 淋巴細胞、Th1 細胞介導的免疫系統功能紊亂密切相關，致殘率較高，急需強效的治療策略［1-3］。傷濕祛痛膏記載于《中華人民共和國衛生部藥品標準（中藥成方制劑第8冊）》［4］，由生川烏、生草烏、麻黃、蒼術、當歸、白芷、干姜、山柰、八角茴香、薄荷腦、冰片、樟腦和水楊酸甲酯等制得，主治風寒濕凝滯筋骨證，常用于治療類風濕性關節炎［5］，但其成分及作用機制尚不明確。

機體內存在自由基的產生與清除，正常情況下處于動態平衡中。當體內自由基過多時，會使機體產生氧化應激反應，導致炎癥反應的產生，因此自由基清除能力是抗炎活性的表征之一［6］。DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）常被用作自由基清除能力評價，其原理是DPPH 從抗氧化劑中吸收一個氫原子，使得其溶液顏色由紫色變為黃色，吸光度降低［7］。

白細胞介素-17（IL-17）家族是由IL-17 A～F組成的細胞因子亞群，在急性和慢性炎癥反應中起著至關重要的作用。IL-17 家族通過其相應的受體發出信號，激活包括NF-κB、MAPKs和C/EBPs在內的下游通路，誘導抗菌肽、細胞因子和趨化因子的表達，共同參與機體炎癥及免疫反應進程［8］。

本研究通過超高效液相-線性軌道離子阱-高分辨液質聯用技術對傷濕祛痛膏成分進行了解析，并測定了其氧化自由基清除率來表征其抗炎能力，通過分子對接技術［9］探究傷濕祛痛膏對經典炎癥信號通路IL-17 家族通路靶點的作用效果，為后續研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Thermo-LTQ-Orbitrap-XL-HRMSn線性離子阱-串聯靜電場軌道阱高分辨質譜儀，配有：熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 2.1 化學工作站（美國Thermo Scientific 公司）；Utimate 3000 UHPLC 超高液相色譜系統，含二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD 檢測器（美國Thermo Scientific 公司）；UH5300 型雙光束紫外可見分光光度計（日本株式會社日立制作所）；MS105DU 型萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料及試劑

傷濕祛痛膏浸膏（哈爾濱力強藥業有限公司）；乙酸（質譜級，美國Thermo Scientific 公司）；甲醇（質譜級，美國Thermo Scientific 公司）；甲醇（分析純，北京化工廠）；無水乙醇（分析純，北京化工廠）；雙蒸水（香港屈臣氏集團）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS201012-09）。

1.3 超高效液相質譜聯用條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：AQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：0.3%乙酸水溶液（A），甲醇溶液（B）；梯度洗脫條件：0～5 min（10%～40%B），5～18 min（40%～60%B），18～30 min（60%～80%B），30～40 min（80%～100%B），40～45 min（100%～100%B）；流速：0.2 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2 質譜條件

HESI 電噴霧離子源，正負離子檢出模式，電離源電壓4 KV，離子源溫度350 ℃，氣化室溫度300 ℃，毛細管電壓25 V，鏡筒透鏡補償電壓110 V，鞘氣和輔助氣為高純氮氣（純度＞99.99%），鞘氣流速40 arb，輔助氣流速20 arb；激活能量單位0.25 q；激活時間30 ms；歸一化碰撞能量35%；傅里葉高分辨掃描范圍m/z 50～1 300 Da，傅里葉變換全掃分辨率為30 000，二級和三級質譜選取上一級豐度最高的3 個峰進行碰撞誘導解離碎片掃描。

1.3.3 樣品制備

取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用甲醇配制成1 g/mL的母液，超聲30 min，用甲醇稀釋至6.25 mg/mL，12 000 rpm 4 ℃離心15 min，取上清液。

1.4 UV-Vis檢測DPPH自由基清除

1.4.1 DPPH溶液的制備

精密稱取一定量的DPPH，加入一定量的無水乙醇，配制成0.2 mmol/L DPPH母液，現用現配。

1.4.2 供試品溶液的制備

取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用90%甲醇水溶液配制成1 g/mL 的母液，超聲30 min，過濾，用90%甲醇水溶液配制成一定濃度的傷濕祛痛膏溶液，取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，避光反應30 min，待測。

1.4.3 空白組溶液的制備

取3 mL 90%甲醇水溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，避光反應30 min，待測。

1.4.4 對照組溶液的制備

取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 90%甲醇水溶液，避光反應30 min，待測。

1.4.5 反應及測定

將避光反應30 min后的供試品、空白組、對照組溶液移取到1 cm 比色皿中，于517 nm 波長下測定，測定3次取平均值。

1.4.6 專屬性考察

取空白組溶液和對照組溶液，在200～900 nm 之間進行全波長掃描，觀察對照組溶液在DPPH 的最大吸收波長處是否有吸收。

1.4.7 線性關系考察

精密移取不同體積的傷濕祛痛膏母液，分別置于25 mL 容量瓶中，加入90%甲醇水溶液至刻度線，定容，配制成不同濃度的傷濕祛痛膏溶液。分別取3 mL不同濃度的傷濕祛痛膏溶液，向內加入2 mL 2 mmol/L的DPPH 溶液，避光反應30 min，在517 nm 波長下測定其吸光度均值，計算自由基清除率，線性擬合。

1.5 分子對接

1.5.1 對接分子的準備

使用Chemdraw19 軟件繪制傷濕祛痛膏質譜解析成分，能量最小化處理保存成mol2 格式文件，利用SYBYL X2.1.1 軟件進行加氫和加電荷處理，保存成pdb格式。

1.5.2 對接受體的準備

通過KEGG 數據庫查詢IL-17 家族通路靶點，在PDB數據庫［10］獲得靶點三維結構，利用SYBYL X2.1.1軟件去除水分子及原有配體，加氫、加電荷處理，保存成pdb格式。

1.5.3 柔性分子對接

通過SYBYL X2.1.1 軟件，采用Surflex-Dock 柔性對接算法，選擇“automatic”自動對接方式，每次對接保留Total-score得分前二十的構象。

2 結果

2.1 傷濕祛痛膏的化學成分鑒定

采用正負離子模式分別進行掃描，通過和已有文獻報道比對，鑒定出蒼術（CZ）27 種成分、烏頭（WT）25 種成分、干姜（GJ）20 種成分、白芷（BZ）4 種成分、當歸（DG）4 種成分、八角茴香（BJ）2 種成分、麻黃（MH）2 種成分、山柰（SN）1 種成分，其中多種成分在多味藥中均含有，合計鑒別出85 種成分，主要為生物堿、黃酮、香豆素、二苯基庚烷類化合物，結果見圖1、表1及表2。

圖1 傷濕祛痛膏總離子流圖

表1 傷濕祛痛膏正離子模式成分定性分析

續表1

表2 傷濕祛痛膏負離子模式成分定性分析

2.2 UV-Vis檢測DPPH自由基清除

專屬性考察結果可以看出，傷濕祛痛膏溶液在DPPH 的最大吸收波長處沒有吸收，對測定沒有影響，見圖2。因此，選擇文獻報道［32］的517 nm 作為檢測波長，將待測液與DPPH 溶液避光反應30 min 后測定。以DPPH 自由基清除率Y 為縱坐標，傷濕祛痛膏溶液的濃度X（mg/mL）為橫坐標進行線性回歸，線性考察結果見表3。傷濕祛痛膏溶液在0.1～0.7 mg/mL 濃度范圍內與DPPH 自由基清除率呈良好的線性關系，計算得出DPPH 自由基清除率的半數抑制濃度IC50值為0.345 7 mg/mL，說明傷濕祛痛膏具有體外清除DPPH自由基的能力，具有一定抗炎活性。

圖2 專屬性考察結果

表3 線性關系考察結果

2.3 分子對接

將質譜鑒定出的結構明確的62 個成分與IL-17家族通路的55 個靶點，通過SYBYL X 2.1.1 軟件進行分子對接，每次對接顯示得分前二十的對接構象，3 410 次對接共產生68 200 個對接構象。根據給出對接打分值Total-score，＞5 分為對接成分與靶點間具有活性，＞7 分為具有很強的活性。使用Origin Lab 將對接結果繪制成熱圖，結果見圖3。結果顯示，55 個靶點全部有得分≥5 分的相應對接成分，即傷濕祛痛膏成分對IL-17 家族全部靶點具有對接活性。52 個靶點具有打分值≥7 分的對接成分，占比為94.55%，大部分成分與靶點的對接得分都在7 分以上，并且干姜中的二苯基庚烷類化合物表現出極好的對接活性，與大多數靶點的得分都在10 分以上。說明傷濕祛痛膏對IL-17 家族炎癥通路的靶點具有良好的對接活性。將對接打分值前十的對接構象使用Discovery Studio 2020可視化，結果見圖4。

圖3 對接結果Total-score熱圖

圖4 最佳對接構象結果圖

3 討論

DPPH 自由基清除實驗過程中考察了DPPH 的濃度及反應體積，傷濕祛痛膏的濃度、體積及二者的反應時間后，參考文獻確定DPPH 的濃度為2 mmol/mL，反應時間為30 min。

LC-MS 實驗考察了柱溫、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%乙酸水、甲醇-0.3%乙酸水體系，考慮到峰型和分離度，最終選定了30 ℃柱溫、甲醇-0.3%乙酸水為流動相。

類風濕性關節炎終生患病率高達1%，是最常見的全身性炎癥關節炎。目前臨床用藥多是甲氨蝶呤聯合糖皮質激素，或者與TNF、B 細胞、T 細胞、白細胞介素的單克隆抗體抑制劑等價格較高的生物制品聯用［33-35］。傷濕祛痛膏作為治療類風濕性關節炎等癥的常用藥，具有良好的應用前景。本文通過液質聯用、自由基清除實驗及分子對接方法，闡明了傷濕祛痛膏抗氧化、抗炎作用的藥效物質基礎。

本實驗室前期的網絡藥理學研究表明，傷濕祛痛膏的組成藥味很多，涉及的靶點、通路也較多。本文將關注點放在傷濕祛痛膏成分與經典炎癥通路IL-17通路靶點的相互作用。結果顯示，傷濕祛痛膏的質譜鑒定成分對此通路涉及的靶點具有很強的活性。本研究采用的Surflex-Dock 算法是柔性對接方式，研究表明此算法在幾種算法中正確率最高［36-37］。分子對接結果表明，傷濕祛痛膏可以多靶點起到抗炎作用，且具有良好活性，一定程度上解釋了傷濕祛痛膏治療類風濕性關節炎等慢性炎癥的科學內涵，為傷濕祛痛膏的后續研究提供一定的參考。