海洋麥氏交替單胞菌共代謝降解布洛芬研究

郭 雅 麗，王 競，顧 晨，郭 定 環

( 大連理工大學 環境學院, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

近年來，藥品和個人護理產品(pharmaceutical and personal care products，PPCP)作為一種重要的環境優先污染物，受到越來越廣泛的關注．布洛芬(ibuprofen，IBP)作為一種典型的PPCP，是目前使用最廣泛的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)之一[1]．由于傳統廢水處理的去除效率相對較低，IBP無法完全去除并被排放入環境中[2]．已有報道表明，IBP已在污水、地表水、海水甚至地下水中被檢測到，濃度范圍從ng·L-1至μg·L-1[3-4]．毒理學研究表明，長期暴露于即使是低濃度的IBP，仍可顯著影響生物體的生長和發育，并降低群落的生物多樣性，對人類健康和生態系統的平衡具有潛在威脅[5-6]．

在光照環境中，直接和間接(敏化)光解均可降解IBP[7]．已有研究表明，溶解性有機物，尤其是富里酸是重要的光敏劑[8-9]．而Matamoros等發現，在光照條件下，IBP也可以在海水中降解[10]．在生物降解方面，已有研究報道白腐真菌、黏質沙雷氏菌和淡水硅藻舟形藻等從陸地及淡水環境中分離的微生物，在一定條件下也能夠有效地降解IBP[11-13]．有報道表明，由于IBP對顆粒的相對較高的吸附系數，能夠吸附于顆粒有機碳并在湖水中以1 m·d-1的速度沉降，因而易于在沉積物中積累[14]．因此IBP不僅存在于海水中，在沉積物中也被檢出[15-19]，這也就意味著，在海洋環境中光降解并不是IBP轉化的唯一途徑．因此，本研究利用從近海沉積物中分離得到的麥氏交替單胞菌GCW，考察IBP共代謝降解特性、降解過程中生理特性及胞外活性氧的變化，對研究海洋細菌對IBP的生物降解、了解IBP在海洋環境中的歸趨具有重要意義．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用菌株GCW分離自大連市黑石礁近海表層沉積物，經富集培養后，反復利用稀釋涂布平板劃線法分離，從而得到菌株GCW，菌落呈白色，圓形，表面光滑，邊緣整齊．經鑒定為麥氏交替單胞菌Alteromonasmacleodii(Genbank登錄號：KY583738)．

1.2 IBP降解實驗

實驗培養基均用人工海水配制，用20% NaOH溶液調節pH至8.0．

唯一碳源培養基：在人工海水中加入12.5 mg·L-1NH4NO3、2.5 mg·L-1K2HPO4·3H2O和250 mg·L-1IBP．

不同共代謝培養基：向人工海水中分別加入6 g/L的蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉．

1.3 活性物種定位及鑒別

為定位IBP降解發生在菌株胞內還是胞外，對降解活性物種進行了定域實驗．將菌株培養72 h，取菌液6 000 r/min離心分離10 min，將上清液過0.22 μm有機濾膜去除細胞后作為胞外提取液．將沉淀洗滌后用濃度10 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)重懸，隨后冰浴超聲破壁5 min，15 000 r/min離心分離20 min，上清液作為胞內提取液．在無菌培養基(空白對照)、胞外和胞內提取液中分別加入1 mg·L-1的IBP，于25 ℃，150 r/min的恒溫搖床中避光反應5 h．為了避免胞內活性物質在超聲破碎過程中變性失活，又進行了完整細胞實驗．將離心(6 000 r/min，10 min)后的沉淀用預冷無菌超純水洗滌2次，重懸于滅菌人工海水，在相同條件下進行反應．

1.4 胞外活性氧及相關酶檢測

(1)羥基自由基

?OH是一種典型的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，其測定采用苯甲酸高效液相色譜法[20]．色譜柱為Sinochrom ODS-BP (4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為40 ℃．其中，流動相A為超純水(含0.1%三氟乙酸)，流動相B為乙腈，流動相A與流動相B體積比為87∶13，波長為255 nm，單個樣品運行時間為20 min．?OH濃度計算方法如下式所示：

c(?OH)=c(p-HBA)×5.87

(1)

其中c(?OH)為?OH濃度，c(p-HBA)為對羥基苯甲酸濃度．

(2)超氧陰離子自由基

(3)過氧化氫

H2O2檢測采用的是DPD/POD法[22]．向2 mL 的胞外提取液中加入0.2 mL濃度為0.5 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH=6)，再加入37 μL 用濃度為0.05 mol·L-1的H2SO4配制的10 g·L-1DPD溶液和37 μL的1 g·L-1POD溶液，利用紫外-可見分光光度計測量吸光度，波長為551 nm，體系以不加POD為空白對照．

(4)鐵載體

鐵載體的檢測基于鉻天青(chrome azurol S，CAS)法[22]．將CAS檢測液與胞外提取液等體積充分混勻后放置1 h，利用紫外-可見分光光度計測定吸光度，波長為630 nm，以酵母浸粉培養基作為空白對照．

(5)L-氨基酸氧化酶

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，LAAO)的檢測同樣基于DPD/POD法[23]．取1 mL 胞外提取液，加入等體積的5 g·L-1亮氨酸溶液作為底物，以不作處理的胞外提取液作對照，一同在25 ℃，150 r/min的恒溫搖床中反應1 h，用DPD/POD法分別測定反應后體系的H2O2濃度，相減則為1 h內產生的H2O2．

1.5 生理特性分析

(1)生長曲線

生長曲線的測定采用比濁法，利用紫外-可見分光光度計測定菌懸液的光密度來推測菌體的濃度，測定波長為600 nm．

(2)胞外聚合物

利用堿法提取菌株經過72 h培養后的胞外聚合物(EPS)．取10 mL菌液，10 000 r/min離心分離20 min，上清液即為溶解態EPS．在沉淀中加入10 mL超純水充分混勻，加入0.06 mL濃度為36.5%的甲醛溶液，靜置于4 ℃條件下反應1 h，隨后向體系內加入4 mL濃度為1 mol·L-1的NaOH溶液靜置于4 ℃條件下培養3 h，離心分離(10 000 r/min，4 ℃，20 min)，收集上清液經0.22 μm 有機濾膜過濾后即為結合態EPS．EPS中多糖測定采用苯酚-硫酸法，蛋白質測定采用考馬斯亮藍法．

(3)胞外脫氫酶活性

脫氫酶活性(dehydrogenase activity，DHA)的檢測采用氯化三苯基四氮唑-脫氫酶活性法[24]．

(4)電子傳遞系統活性

電子傳遞系統活性(electron transport system activity，ETSA)的檢測是基于四唑還原作用來體現耗氧值，底物是碘硝基氯化四氮唑藍(INT)[25]．

1.6 IBP分析方法

IBP的測定采用高效液相色譜法．色譜柱為Supersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為40 ℃．其中，流動相A為含有0.02 mmol·L-1磷酸二氫鈉的超純水(用磷酸調pH=3.0±0.05)，流動相B為乙腈，流動相A與流動相B的體積比為40∶60，流速為0.8 mL·min-1，在222 nm 波長下對IBP濃度進行測定．單個樣品運行時間為12 min．

2 結果與討論

2.1 IBP降解特性

首先，為了考察菌株GCW能否以IBP為唯一碳源生長，進行了唯一碳源降解實驗(圖1)．實驗發現，IBP未發生明顯降解，表明在實驗條件下，GCW不能夠以IBP為唯一碳源生長．而IBP在自然環境中可能與各種易降解物質共存，因此，選取常見的有機質作為共代謝底物考察了IBP的共代謝降解效果(圖1)．實驗表明，在無細胞接入和經過熱失活細胞的兩個不同空白對照組中，72 h 后IBP未發生明顯降解(<5%)．而牛肉膏和蛋白胨培養基中的3 d降解率分別為85%和69%，酵母浸粉培養基最高，為90%．因此，后續實驗選擇酵母浸粉作為共代謝底物．對菌株GCW好氧共代謝降解IBP進行動力學研究，實驗結果如圖2所示．在經歷24 h的停滯期后，對24～72 h的IBP濃度基于c/c0值取對數，按一級反應動力學方程線性擬合，擬合結果符合準一級反應動力學，IBP降解速率常數為0.061 h-1，相對應的半衰期T1/2為35.4 h．

關于海洋環境中IBP生物降解目前還未見報道，本研究中的降解速率與IBP在海水中光降解的相關研究結果(0.14 h-1)也相當[10]．對比淡水及陸地環境中IBP生物降解的研究，Marco-Urrea等發現白腐真菌對IBP的7 d降解率約為70%[11]，Xu等分離的黏質沙雷氏菌對IBP的5 d降解率為93%[12]，本研究在降解周期及降解率方面具有一定優勢．

圖1 不同培養基中的IBP降解曲線

圖2 IBP降解曲線

為了明確降解發生的位置，進行了降解活性物種定位實驗(圖3)．實驗結果表明，菌株GCW胞內提取液和完整細胞中的IBP均不發生降解，而胞外提取液中IBP發生明顯降解，降解率達79%．因此，降解IBP的活性物質位于胞外．

圖3 GCW不同部分的IBP降解

為了分辨降解活性物質的種類，進行了活性物種淬滅實驗(圖4)．發現煮沸抑制了97.2%的IBP降解，說明降解活性物質為熱敏性物質．而蛋白酶K抑制了56.9%的降解，說明菌株GCW降解IBP為酶和非酶物質共同作用，其中酶的作用占56.9%．隨后進行了ROS淬滅實驗，發現SOD抑制了3.4%的降解，CAT抑制了31.2%的降解，硫脲抑制了56.8%的降解．結果表明，ROS參與了菌株GCW對IBP的降解，且H2O2和?OH起主要作用．

圖4 淬滅實驗的IBP相對降解率

2.2 降解過程中的生理特性變化

為了探究IBP對菌株GCW的影響，考察了菌株在含與不含IBP的培養基中的生長曲線、胞外聚合物、脫氫酶活性等生理特性，這些生理特性也在一定程度上反映了其降解IBP的機理．

菌株GCW在含與不含IBP體系中的生長曲線如圖5所示．GCW經過6 h左右生長到達對數期，經過約36 h生長到達對數末期并進入穩定期，隨后直至72 h菌量不再有明顯變化．同時還可以看出，1 mg·L-1的IBP對菌株GCW的生長無顯著影響．

胞外聚合物是微生物分泌于細胞外的高分子聚合物，它覆蓋在微生物表面，在微生物與外部環境之間形成一個緩沖層，能夠幫助細胞抵御有害物質的毒害．同時，已有報道表明Alteromonasmacleodii菌屬能夠產生EPS[26]．經72 h培養后，IBP對菌株GCW分泌EPS的影響如圖6所示．結果表明，加入IBP的實驗組比對照組EPS的蛋白質含量提高了15.5%，多糖含量提高了

圖5 含/不含IBP培養基中GCW的生長曲線

圖6 IBP對EPS分泌的影響

16.7%，這一結果表明加入IBP促進了EPS的分泌，這可能是由于菌株通過分泌EPS來抵御外界環境的毒害．

脫氫酶是細菌關鍵的氧化還原酶之一，在細菌生長和降解污染物過程中起到重要作用．本實驗測定了IBP對菌株胞外脫氫酶活性的影響，實驗結果如圖7所示．結果表明，含IBP實驗組的DHA相對于不含IBP的對照組有顯著提高，尤其是在前60 h內，提高了10.8%～35.5%．以上結果說明，IBP會刺激菌株GCW胞外脫氫酶活性，進而有利于污染物的降解．

圖7 IBP對胞外脫氫酶活性的影響

電子傳遞系統活性是檢測微生物潛在代謝活性的重要生化指標之一，可作為降解能力測定的有力補充．測定其活力是測定電子傳遞過程中的限速步驟酶反應即CoQ-Cytb復合體的氧化活力．本實驗測定了菌株胞內電子傳遞系統活性的變化，如圖8所示．結果表明，菌株GCW在培養至36 h后ETSA最高，含IBP與不含IBP分別為1.11和0.85 μg·g-1·min-1，隨后菌體的電子傳遞系統活性隨時間呈降低趨勢．菌株GCW在培養的前60 h內，含IBP實驗組的ETSA相對于不含IBP的對照組有顯著提高，提高了10.1%～30.7%．以上結果表明，IBP會刺激菌株GCW電子傳遞系統活性．

圖8 IBP對電子傳遞系統活性的影響

2.3 ROS形成與IBP降解

隨后還測定了降解過程中H2O2濃度及IBP降解情況，如圖10(a)所示．結果表明，H2O2濃度在降解過程中呈上升趨勢，并在72 h結束時達到峰值，分別為0.93和1.21 μmol·L-1．同時發現在培養至指數期后期(36 h)之前，H2O2的產生幾乎可以忽略不計．已有研究表明，LAAO在細胞外H2O2產生中起著至關重要的作用，廣泛分布于包括細菌在內的不同生物中．Gómez等首次報道海洋細菌Marinomonasmediterranea可以合成L-賴氨酸-ε-氧化酶(lodA)，該酶可以催化L-賴氨酸的氧化脫氨反應釋放H2O2[30]．他們進一步研究發現，lodA在生長的穩定期會分泌到細胞外環境中[31]，這與本文的研究結果相一致．此外，在IBP降解過程中(24～60 h)，含IBP的H2O2濃度低于不含IBP的；而通過對兩組中LAAO活性檢測發現，含IBP中LAAO的活性明顯高于不含IBP的(圖10(b)所示)．這意味著含IBP的產胞外H2O2能力高于不含IBP的，進而說明含IBP的H2O2濃度下降并不是由于IBP抑制了H2O2的產生，而是降解IBP消耗了H2O2所致．這也解釋了IBP降解結束后(72 h)，含IBP的H2O2濃度高于不含IBP的這一現象．

圖9 IBP對NADH氧化還原酶的影響

而研究表明，H2O2本身并不能降解IBP，需要轉化為其他活性物質才能起到降解作用．已有研究表明，海洋系統中有機Fe(Ⅱ)絡合物可以催化H2O2發生芬頓反應產生?OH[32]．在蘇榮葵對UV/H2O2高級氧化技術降解布洛芬的研究中，?OH也被證明是導致IBP降解的最主要原因[33]．因此，本研究測定了體系中的胞外?OH濃度和鐵載體的活性．在胞外提取液中檢測到?OH濃度分別為1.7和1.0 μmol·L-1，且在達到穩定期(60 h)后，濃度趨于穩定(圖11(a))．同時，含IBP鐵載體的活性顯著高于不含IBP(圖11(b))，結合H2O2的測定結果，含IBP的胞外?OH濃度應高于不含IBP的．然而含IBP的胞外?OH濃度卻明顯低于不含IBP的，因此這可能是由于在IBP降解中消耗了?OH，這也是IBP非酶降解的主要途徑．

3 結 語

本研究首次探討了海洋環境中IBP的生物降解，證實了麥氏交替單胞菌GCW能夠共代謝降解IBP，以酵母浸粉為共基質時具有最好的降解效果，并且在降解周期及降解率方面具有一定優勢．IBP的加入可以提高菌株EPS、DHA和ETSA等生理特性，并且促進與胞外ROS產生相關的NADH氧化還原酶、LAAO和鐵載體的活性．GCW降解IBP發生在胞外，由酶和非酶物質共同介導．降解IBP的非酶物質主要為ROS，且?OH起最主要作用．本研究加深了對海洋環境中IBP生物降解的了解，對研究IBP在海洋環境中的歸趨具有啟示作用．