普通煙草NtWRKY53基因克隆、鑒定及表達分析

劉萬峰 ，蒲文宣，楊愛國，高軍平，王 奇，孫明銘，張新要，孫 楠，陳 凱，王國平,3，李曉旭*,

1.湖南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，長沙市勞動中路386號 410007

2.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所 煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號 266101

3.玉溪中煙種子有限責任公司，云南省玉溪市南翔路14號 653100

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，其家族成員在N端具有1個或者2個高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域（WRKYGQK），其命名也來源于該結(jié)構(gòu)域［1］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員在C端有C2H2或者C2HC型的鋅指結(jié)構(gòu)［1-2］。據(jù)報道WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合W-box（TTGACC/T）順式元件，進而調(diào)控下游基因的表達［3］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員在真菌性、細菌性和病毒性病原物引發(fā)的植物生物逆境應答中起重要作用［4-5］。在擬南芥中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY3和AtWRKY4編碼基因受灰霉病（Botrytis）和水楊酸（SA）誘導表達，并且與野生型相比wrky3、wrky4單突變體及wrky3/wrky4雙突變體接種灰霉病后表型表現(xiàn)更加嚴重，說明其對灰霉病抗性具有正向調(diào)控作用［6-7］。轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY70編碼基因能夠被二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）所誘導，AtWRKY70基因過表達能夠增強對二孢白粉菌的抗性［8-9］。此外，丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）侵染擬南芥時，AtWRKY25基因高量表達，而AtWRKY25基因過表達能夠增加對丁香假單胞菌的抗性［10］。同時，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員也參與非生物逆境脅迫響應［11-12］。在擬南芥中，由生物逆境誘導的基因AtWRKY25同樣也被干旱脅迫以及熱脅迫所誘導，AtWRKY25過表達時能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱能力［13-14］。在水稻中研究發(fā)現(xiàn)OsWRKY30基因參與干旱脅迫，該基因過表達可以顯著提高耐旱性［15］。另外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員也參與植物衰老過程的調(diào)控。在擬南芥中，AtWRKY54和AtWRKY70作為負調(diào)控因子調(diào)控擬南芥的葉片衰老過程［16］。此外，轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY53編碼基因在衰老時期表達量上調(diào)，wrky53突變體具有晚衰表型，并且該基因過表達能夠促進葉片衰老［17-18］。有研究表明參與葉片衰老調(diào)控的AtWRKY53基因，同樣能被丁香假單胞菌誘導表達。同時，相對于野生型，wrky53/wrky46雙突變體對丁香假單胞菌更為敏感，說明AtWRKY53基因可能同時調(diào)控生物逆境應答和葉片衰老。此外，在禾本科植物紫花針茅中，SpWRKY53基因受鹽和干旱等非生物脅迫的誘導，并且SpWRKY53基因過表達可以顯著促進葉片的衰老［19］。另有研究表明，小麥TaWRKY53b基因在葉片衰老期顯著上調(diào)，說明該基因可能在調(diào)節(jié)小麥葉片衰老中起重要作用［20］。在水稻中，OsWRKY53過表達的水稻植株對稻瘟病的抗性明顯增強［21］。在玉米中，不同的非生物脅迫如低溫、NaCl、H2O2和PEG均能顯著誘導ZmWRKY53基因的表達，并且在接種玉米紋枯病的葉片中ZmWRKY53基因的表達量也有顯著提高［22］。

煙草是重要的經(jīng)濟作物，在生長發(fā)育過程中會受外界逆境脅迫而影響產(chǎn)量和品質(zhì)［23-25］。同時，煙草收獲的對象是落黃成熟的葉片，煙葉成熟落黃對品質(zhì)特征等起重要作用［26-28］。為此，采用比較基因組學的方法，在普通煙草中鑒定、克隆NtWRKY53基因，并對其保守結(jié)構(gòu)域、進化關系、共線性、亞細胞定位、轉(zhuǎn)錄激活以及基因表達模式進行分析，旨在明確煙草逆境脅迫、葉片落黃的調(diào)控機制，為煙草育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

普通煙草K326為主栽品種，用于后續(xù)非生物脅迫處理；臺煙8號為CMV抗性品種［29］，用于CMV接種處理；雪茄煙Beinhart1000-1為黑脛病抗性品種［30］，用于黑脛病接種處理。

pCHF3-cGFP、pBridge載體、農(nóng)桿菌GV3101以及酵母AH109菌株由本實驗室保存。pBlunt0載體、大腸桿菌感受態(tài)購自北京全式金有限公司。Trizol購自美國Invitrogen公司。PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Ex TaqTM熒光定量試劑盒、高保真pfu酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自大連寶生物公司。Infusion連接試劑盒、酵母SD培養(yǎng)基、色氨酸缺失物、X-Gal等購自日本Clonetech公司。限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo Fisher公司。引物合成和載體測序由北京六合華大基因有限公司完成。熒光定量PCR儀為美國ABI公司的ABI 7500型，激光共聚焦顯微鏡為德國Leica公司的TCS-SP8型。

1.1.1 非生物脅迫處理

試驗設置在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，采用盆栽將普通煙草K326種植于光照培養(yǎng)箱中。光周期設置為16 h光照/8 h黑暗，溫度設置為24 ℃。在煙株現(xiàn)蕾期采集莖尖、莖、根尖、根、幼嫩葉片和衰老葉片等，液氮迅速冷凍后放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫黄胀煵軰326種子由本實驗室保存，在MS固體培養(yǎng)基中萌發(fā)，待幼苗長至6片真葉時，將其在MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)5 d。參考文獻［31］進行非生物逆境及激素處理。干旱處理：將懸浮培養(yǎng)5 d的煙草幼苗放于吸水濾紙上模擬干旱處理，以未經(jīng)處理的煙草幼苗為對照，分別在1 h、6 h、12 h采樣，每組采集3株長勢相近的整株幼苗；鹽處理：將懸浮培養(yǎng)5 d的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至含有0.05 mol/L NaCl的MS溶液中進行處理，以未經(jīng)處理的煙草幼苗為對照，分別在1 h、6 h、12 h采樣，每組采集3株長勢相近的整株幼苗；冷脅迫、熱脅迫處理：將懸浮培養(yǎng)5 d的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至新的MS溶液中，隨后放入4 ℃、37 ℃培養(yǎng)箱中，以未經(jīng)處理的煙草幼苗為對照，分別在1 h、6 h、12 h采樣，每組采集3株長勢相近的整株幼苗；ABA激素處理：將懸浮培養(yǎng)5 d的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至含有10-5mol/L ABA的MS溶液中進行處理，以未經(jīng)處理的煙草幼苗為對照，分別在1 h、6 h、12 h采樣，每組采集3株長勢相近的整株幼苗。以上所有樣品均經(jīng)液氮冷凍后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 CMV接種

參考文獻［29］進行煙草CMV接種，接種毒源為CMV亞組I的Fny株系（CMV-Fny），普通煙草臺煙8號種子由本實驗室保存，以空白接種液接種的煙草植株為對照。接種方法：待煙苗處于6片真葉期時，在葉片上均勻撒上石英砂，選取最上面2片充分展開的真葉為接種葉，用脫脂棉蘸取接毒液輕輕摩擦2遍，1 h后用清水將葉片表面殘留的石英砂沖洗干凈。接病后在1、3和5 d時采樣，每組采集3株病情相近植株的葉片組織。

1.1.3 黑脛病接種

參考文獻［30］進行黑脛病接種，接種毒源為黑脛病菌0號生理小種（由本實驗室保存），接種品種為Beinhart1000-1，以未接種的煙草植株為對照。接種方法：在6片真葉期煙苗周圍5 cm處，將長柄勺子豎直插入土壤中進行傷根處理，隨后取菌谷放入土壤，立刻覆土、灌水保濕。接病后分別在1、3和5 d時采樣，每組采集3株病情相近植株的根部組織。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的制備

將采集的組織和逆境脅迫處理樣品從-80 ℃冰箱取出，在液氮中研磨成粉末。使用Trizol試劑盒提取總RNA并去除基因組DNA，使用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋至25 ng/μL備用。

1.2.2 NtWRKY53基因的克隆

在茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫（http：//solgenomics.net/）下載普通煙草K326蛋白序列（Nitab-v4.5 proteins），以擬南芥AtWRKY53的蛋白全長序列為query，進行本地BLASTP比對，得到候選基因（Nitab4.5_0000223g0340），基于得到的候選基因序列，設計相應擴增引物。上游引物：5′-ATGGATTGTGGTTTCAATTGG-3′，下游引物：5′-TTATCTGAAAAATTCTGAGTT-3′，使用pfu高保真酶進行目的基因克隆，擴增后完成膠回收。取8 μL WRKY53基因擴增膠回收產(chǎn)物與2 μL pBlunt0平端載體混合，在PCR儀中25 ℃反應20 min完成連接反應，將連接產(chǎn)物全部加入100 μL大腸桿菌感受態(tài)細胞中，并完成轉(zhuǎn)化，在含有100 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基平板上進行抗性篩選，對陽性單克隆使用目的基因擴增引物進行PCR鑒定，將經(jīng)過鑒定的陽性克隆進行測序。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

普通煙草NtWRKY53基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子的序列特征通過在線程序ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）進行預測分析，包括其等電點、分子量等理化性質(zhì)；在擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫（www.arabidopsis.org）和NCBI（http：//solgenomics.net/）中下載擬南芥AtWRKY53（ACF20468）、AtWRKY6（AF331713）、AtWRKY31（ACF20468）和其他物種中相關WRKY轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列，包括水稻 OsWRKY53（DAA05118）、小麥TaWRKY53（AGF90798）、玉米ZmWRKY53（NP_001147551）、紫花針茅SpWRKY53（AOZ56938）以及 番 茄 SlWRKY53 （XP_004244630）、葡萄VvWRKY53（RVW26716）、蘋 果 MdWRKY53（RXH95720）。參照文獻［31］使用MAFFT完成多序列比對，利用Texshade將多序列比對結(jié)果進行可視化，分析其保守的WRKY結(jié)構(gòu)域。基于多序列比對結(jié)果，使用MEGA v6.06構(gòu)建鄰接樹（Neighbor-Joining，NJ tree），參數(shù)設置：Poisson模型，Pairwise Deletion，Bootstrap Value設置為1 000次；同時在默認參數(shù)下，利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線程序?qū)ι鲜鲂蛄羞M行保守基序（motif）預測分析。

1.2.4 共線性分析

在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）和茄科基因組數(shù)據(jù)庫分別下載擬南芥和普通煙草K326基因組注釋信息，參考文獻［32］利用McScan X在默認參數(shù)下進行擬南芥和普通煙草基因組的共線性分析。

1.2.5 亞細胞定位分析

參考文獻［31］對轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY053進行亞細胞定位分析。以Blunt-NtWRKY53為模板，對不含終止密碼子的NtWRKY53基因CDS序列進行PCR擴增，使用Infusion重組酶，將目的片段連接到pCHF3-cGFP亞細胞定位載體上，構(gòu)建35S ∷NtWRKY53-cGFP融合表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞后，進行陽性篩選，將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，在含有100 μg/mL壯觀霉素（Spec）和50 μg/mL利福平（Rif）的YEP固體平板上進行抗性篩選，通過PCR進行陽性鑒定。參考文獻［33］在本氏煙葉片中進行瞬時表達，以含有35∷GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株為對照，將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和對照分別以200 r/min振蕩12 h后，5 000 r/min離心3 min集菌，用重懸液重懸后，分別注射到葉片背部，避光12 h。隨后取注射葉片材料，在Leica激光共聚焦顯微鏡TCS-SP8下對熒光信號（DAPI、GFP）進行觀察，激發(fā)光波長分別選擇405 nm和488 nm。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄激活實驗

參考文獻［31］對轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY053進行轉(zhuǎn)錄活性分析。以Blunt-NtWRKY53為模板，對NtWRKY53基因全長CDS序列進行擴增，膠回收純化后，使用Infusion重組酶連接到pBridge載體中，構(gòu)建NtWRKY53-GAL4BD融合表達載體，在含有氨芐青霉素（Amp）的LB平板上進行抗性篩選后，用PCR鑒定陽性克隆并測序。以pBridge空載體為對照，將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109感受態(tài)細胞中，在-Trp缺陷平板（SD/-Trp）上進行營養(yǎng)缺陷篩選，隨后將所篩選的陽性克隆轉(zhuǎn)移至顯色培養(yǎng)基（SD/-Trp/X-gal）上進行顯色分析。

1.2.7 表達模式分析

根據(jù)NtWRKY53基因的CDS序列，利用Primer premier 5設計特異性熒光定量檢測引物，上游引物序列：5′-TCAAGAAACAAGCCAACAATCCAAA-3′，下游引物序列：5′-TGACGGCGAATAACCTCC TACCAAA-3′。參考文獻［34］，采用普通煙草NtEF1α基因（GenBank ID NM001326165）作為管家基因。各個組織及處理獨立進行3次生物學重復，每組生物學重復為獨立樣本并單獨提取RNA，同時熒光定量實驗設置3次技術性重復。基于2-ΔΔCt法計算NtWRKY53基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtWRKY53基因的克隆及分析

以擬南芥AtWRKY53的蛋白序列進行本地BLASTP比對，鑒定得到NtWRKY53蛋白，其與AtWRKY53具有59%的相似性。基于普通煙草K326數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，設計NtWRKY53基因特異性擴增引物進行PCR擴增。以不含cDNA模板的擴增體系作陰性對照，擴增片段大約1 000 bp左右。將擴增片段經(jīng)過膠回收純化后，將其連接到pBlunt0平端載體，并對陽性菌落進行測序。結(jié)果（圖1）表明，NtWRKY53基因的CDS序列全長1 095 bp，由364個氨基酸組成。利用ProtParam在線工具分析NtWRKY53蛋白的理化性質(zhì)，其相對分子質(zhì)量為41 189.62 Da，理論等電點為5.60。

圖1 NtWRKY53基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR electrophoretogram of NtWRKY53 gene

2.2 NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)所鑒定的NtWRKY53蛋白序列，將其與其他物種中的相關WRKY53蛋白進行多序列比對（圖2）。完全保守的氨基酸殘基用黑色標注，相對保守的氨基酸殘基用灰色標注，發(fā)現(xiàn)NtWRKY53基因所編碼的蛋白具有典型WRKY結(jié)構(gòu)域（WRKYGQK），在其C端具有保守的Cys2HisCys型鋅指結(jié)構(gòu)域。

圖2 NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子WRKY結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 WRKY domain analysis of NtWRKY53 transcription factor

2.3 NtWRKY53的進化分析和保守基序分析

以擬南芥、番茄和水稻等物種中已報道的WRKY53轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥中其他WRKY轉(zhuǎn)錄因子為參考，使用MEGA重建鄰接樹（圖3）。參與進化分析的11個WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員被分為2個亞類（Clade）和3個亞家族（Subgroup）。其中，NtWRKY53與文獻報道的不同物種WRKY53轉(zhuǎn)錄因子均聚在Clade I中，煙草NtWRKY53與番茄StWRKY53、擬南芥AtWRKY53聚在一起，說明其直系同源。其中擬南芥 AtWRKY53、煙草NtWRKY53、番茄SlWRKY53和葡萄VvWRKY53等雙子葉植物中的WRKY53聚在亞家族I中，而小麥TaWRKY53、水稻OsWRKY53和玉米ZmWRKY53等單子葉植物中的WRKY53聚在亞家族Ⅱ中，說明單子葉、雙子葉植物中的WRKY53可能發(fā)生了結(jié)構(gòu)及功能上的分化。

對參與進化分析的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的保守基序（Motif）進行分析可以看出，同一亞家族內(nèi)保守基序的種類和數(shù)目相似度較高，不同亞家族成員之間保守基序差異較大，也從側(cè)面反映出進化分析的可靠性。值得注意的是，NtWRKY53和AtWRKY53的保守基序的組織形式高度一致，提示兩者可能發(fā)揮著類似的生物學功能。

2.4 共線性分析

利用McScan X在默認參數(shù)下對擬南芥基因組和普通煙草K326基因組進行共線性分析（圖4）。At1～At5分別代表擬南芥的5條染色體，Nt01～Nt24代表普通煙草的24條染色體。結(jié)果表明，普通煙草NtWRKY53基因與擬南芥AtWRKY53基因在擬南芥和普通煙草基因組的共線性區(qū)塊中，存在共線性關系，進一步說明所鑒定的普通煙草NtWRKY53基因與擬南芥AtWRKY53基因直系同源。

圖3 NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化及保守基序分析Fig.3 Phylogenetic and conserved motifs analyses of NtWRKY53 transcription factor

圖4 普通煙草和擬南芥WRKY53基因的共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of WRKY53 gene between Nicotiana tabacum and Arabidopsis

2.5 NtWRKY53亞細胞定位分析

構(gòu)建了35S∷NtWRKY53-GFP融合表達載體，利用農(nóng)桿菌侵染本氏煙草葉片，瞬時表達NtWRKY53-cGFP蛋白（圖5）。BF為明場，細胞核特異性染料DAPI指示細胞核。35S∷GFP為陰性對照，其GFP熒光信號遍布整個細胞。而融合NtWRKY53的GFP蛋白信號只能在細胞核中觀察到，并與細胞核染料DAPI的信號重疊，這說明NtWRKY53是一個核定位蛋白，符合其轉(zhuǎn)錄因子的特性。

圖5 NtWRKY53的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of NtWRKY53

2.6 NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活分析

在擬南芥中，AtWRKY53被報道具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可調(diào)控下游基因表達［17-18］。在煙草中，對NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活分析結(jié)果表明，GAL4BD-NtWRKY53（即融合表達NtWRKY53的酵母表達菌株）在顯色培養(yǎng)基（X/-Trp）上能夠正常生長，并且顯示藍色，表明轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY53能夠激活下游報告基因的表達（圖6）。而GAL4BD對照酵母菌株在顯色培養(yǎng)基（X/-Trp）上不顯示藍色，說明其不能激活報告基因表達。轉(zhuǎn)錄激活分析表明，NtWRKY53在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖6 NtWRKY53酵母轉(zhuǎn)錄激活分析Fig.6 Transactivation assay of NtWRKY53 in yeast

2.7 NtWRKY53基因的表達模式分析

采集普通煙草K326的不同組織進行實時熒光定量PCR分析，以莖組織中目的基因表達量為參考，計算相對表達量。結(jié)果表明，NtWRKY53基因在莖（S）、根（R）、根尖（Rt）、幼葉（YL）和衰老葉片（SL）中表達，而在莖尖（St）中沒有檢測到目的基因表達（圖7 A）。值得注意的是，相對于幼葉煙草衰老葉片中NtWRKY53基因表達量顯著上調(diào)。

對NtWRKY53基因在非生物逆境脅迫條件下的表達分析發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53基因的表達受多種非生物逆境脅迫的誘導（圖7 B）。在0.05 mol/L NaCl鹽脅迫下，NtWRKY53基因的表達量在處理6 h時達到對照（MOCK）的12.71倍左右，隨后下降。在干旱脅迫下，NtWRKY53基因的表達量也出現(xiàn)先上調(diào)，后下降的情況。而在冷脅迫和熱脅迫處理下，NtWRKY53基因的表達量逐漸下降。同時，激素脫落酸（ABA）處理下，NtWRKY53基因的表達也被誘導，在處理1 h后，表達量達到對照的6.07倍，隨后下降。

對NtWRKY53基因在生物逆境脅迫條件下的表達分析發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53基因的表達受多種生物脅迫的誘導（圖7 C）。在接種CMV（CMV-Fny）后，NtWRKY53基因的表達量顯著上調(diào)，在接種3 d時達到對照的6.7倍，在接種5 d時其表達量有所下降。在接種黑脛病（Black Shank，BS）1 d時，NtWRKY53基因的表達量為對照的4.2倍，之后表達量下降。

3 討論

圖7 NtWRKY53基因的表達模式分析Fig.7 Expression pattern analysis of NtWRKY53 gene

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在生物、非生物脅迫響應以及植物生長發(fā)育和葉片衰老等過程中起重要的調(diào)控作用［2］。本研究中鑒定并克隆到煙草中AtWRKY53的同源基因NtWRKY53。多序列比對發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53蛋白具有典型WRKY結(jié)構(gòu)域和Cys2HisCys型鋅指結(jié)構(gòu)域。進化分析和共線性分析發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53與擬南芥AtWRKY53直系同源。同時，AtWRKY53與NtWRKY53保守基序的類型和組織結(jié)構(gòu)高度類似，暗示其生物學功能可能有較強的一致性。亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)果表明，NtWRKY53定位在細胞核中并且具有轉(zhuǎn)錄激活活性，表明NtWRKY53可能作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮相關生物學功能。

本研究中發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53同擬南芥AtWRKY53、水稻OsWRKY53、小麥TaWRKY53b和紫花針茅SpWRKY53結(jié)構(gòu)域高度相似且在進化關系上同源，表明這些同源基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子可能承擔類似的生物學功能。值得注意的是，AtWRKY53、TaWRKY53b、SpWRKY53基因在衰老葉片中上調(diào)表達，而過表達AtWRKY53、SpWRKY53基因能夠分別促進擬南芥和紫花針茅的葉片衰老過程［19-20，35］。在煙草中NtWRKY53基因在衰老葉片中表達量較高，暗示其參與煙草葉片衰老、落黃的調(diào)控過程。另外，在擬南芥等物種中，AtWRKY53、OsWRKY53基因分別能夠被丁香假單胞菌和稻瘟病接種誘導表達，過表達OsWRKY53水稻株系對稻瘟病的抗性明顯增強，并且低溫和鹽脅迫等非生物脅迫以及玉米紋枯病均能顯著誘導ZmWRKY53的表達［21-22，35］。本研究中還發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53基因能夠被鹽脅迫、干旱脅迫、CMV和黑脛病病原物所誘導，暗示在煙草中NtWRKY53基因很可能參與多種生物、非生物逆境的響應和調(diào)控過程。而有關利用過表達、基因編輯等手段揭示NtWRKY53基因功能方面還有待深入研究。

4 結(jié)論

通過比較基因組學的方法從普通煙草K326中克隆到NtWRKY53基因。NtWRKY53基因可編碼典型WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并且是擬南芥AtWRKY53的同源基因。而NtWRKY53是核定位的轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激活活性，NtWRKY53基因的表達具有明顯的組織和時間特異性，在衰老、落黃的煙草葉片中表達量較高。NtWRKY53基因受到鹽脅迫和干旱脅迫的誘導，參與了干旱和鹽脅迫的逆境響應。接種CMV和黑脛病后，NtWRKY53基因表達量顯著上調(diào)，NtWRKY53基因同樣也參與了相應的生物脅迫的逆境響應。