雞肉中幾種喹諾酮藥物測定方法的優化

田 沖，劉 超，陳封政，李書華，溫志國，李 駿，聶萬麗※

（1.樂山師范學院 化學與資源環境學院，四川 樂山 614000；2.樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

0 引言

喹諾酮藥物是一種含有4-喹諾酮結構的人工合成藥物。有著抗菌譜廣、不良反應少、價格便宜等優點[1]，因此廣泛用于動物和人類的感染性疾病的治療和預防[2]。對于禽類，喹諾酮藥物主要用于由敏感菌導致的呼吸道、消化道、尿道感染和增加禽類飼料轉化率[3]。在動物飼養中由于缺少相關專業知識或追求更高的經濟效益導致喹諾酮藥物在動物源性食品中殘留的問題越來越嚴重[4]。通過食用喹諾酮殘留超標的食品會造成耐藥性和毒副作用，影響人體健康[5-6]。因此，世界各國都規定了喹諾酮藥物在動物源性食品中的限量標準。

目前喹諾酮藥物常用的檢測方法有高效液相色譜法[7]、液相色譜-串聯質譜法[8]、酶聯免疫法[9]等，我國喹諾酮藥物的檢測方法主要有GB/T 20366—2006 和GB/T 21312—2007 等，這兩種國標均使用了分離能力強、選擇性高、靈敏度高的LC-MS/MS。GB/T 20366—2006 使用2%甲酸-乙腈作為提取液，提取液澄清，有利于凈化；但標曲選擇裸標，因基質效應會導致回收率偏低。GB/T 21312—2007 使用EDTAMcllvaine 緩沖液作為提取液，提取液渾濁，影響后續凈化，使凈化時間和成本增加。試驗對兩種國標進行比較并加以優化，以滿足實驗室檢測需要。

1 材料與方法

1.1 材料

乙腈、冰乙酸、正己烷、甲酸、甲醇均為色譜純；檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純；HLB 固相萃取小柱（200 mg，6 mL）。

6 種喹諾酮標準品：洛美沙星（99.4%）Dr.Ehrenstorfer GmbH；諾氟沙星（97.2%）Dr.Ehren storfer GmbH；環丙沙星（99.3%）曼哈格；培弗沙星（99.7%）stanfordchem；氧氟沙星（99.0%）曼哈格；恩諾沙星（99.4%）曼哈格。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-串聯質譜儀 DGU-20AAPI3200 AB SCIEX 公司；電子天平 FA124 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；氮吹儀 HSC-B 天津市恒奧科技發展有限公司；固相萃取儀 VM24 天津艾杰爾科技有限公司；高速冷凍離心機 TGL-16M長沙湘智離心機儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器SHA-B 常州冠軍儀器制造有限公司；數控超聲波清洗機 KQ700 昆山市超聲儀器制造有限公司；超純水機 UPT-Ⅱ-10T 四川優普超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理方法

a）按GB/T 20366—2006 進行提取和凈化，其中將提取液用量改為10 mL，飽和乙腈正己烷用量改為15 mL；均質器均質1 min 改恒溫震蕩器震蕩10 min，超聲10 min；4 000 r/min 改為10 000 r/min；分液漏斗分液后旋蒸改為40 ℃氮吹，其余不變。

b）按GB/T 21312—2007 進行提取和凈化，其中將提取液用量改為10 mL；10 000 r/min 渦旋1 min 改為恒溫震蕩器震蕩10 min，超聲10 min；過HLB 固相萃取柱前將提取液經過濕潤濾紙過濾，其余不變。

1.3.2 標準溶液的配制

標準溶液的配制：取適量喹諾酮藥物標準品用甲醇配制成1000μg/mL 標準儲備液。將標準儲備液用甲醇稀釋至1μg/mL 的混合標準中間液。

混合標準工作液：分別移取適量混合標準中間液，甲醇稀釋至系列濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL。

基質配標：取6 份5 g 陰性樣品（精確到0.01 g）按1.3.1 方法制成空白基質溶液。分別取適量混合標準中間液，用空白基質稀釋至系列濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL。

隨行加標：取6份5 g陰性樣品（精確到0.01 g），分別加入適量混合標準中間液，按1.3.1 方法提取凈化。配制成系類濃度為5 ng/ml、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL。

1.3.3 儀器條件

液相色譜條件：GB/T 20366—2006 色譜柱：Kromasil100-5-C18（3.9×150 mm）流動相：乙腈+0.2%甲酸溶液，梯度洗脫程序見表1。

表1 GB/T 20366—2006 梯度洗脫程序

流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL。

GB/T 21312—2007色譜柱：C18柱（100*2.1 mm，1.7 μm）流動相：A[40+60 甲醇乙腈溶液]；B[0.2%甲酸水溶液]梯度淋洗，梯度洗脫程序見表2。

表2 GB/T 21312—2007 梯度洗脫程序

流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量20 μL。

兩種方法質譜條件均為：離子源ESI+；離子噴霧電壓4500 v；霧化氣氮氣，30 ps；干燥氣氮氣，30 psi；離子化溫度450 ℃；碰撞氣氮氣。

2 結果與分析

2.1 檢出限和線性

分別按GB/T 20366—2006、GB/T 21312—2007規定，向3 個陰性樣品中加入適量混合標準工作液，按1.3.1 處理，不斷稀釋，以三倍信噪比所對應濃度作為兩種方法的檢出限。詳見表4。試驗比較了GB/T 20366—2006、GB/T 21312—2007 兩種方法的線性，結果見表5。

表3 喹諾酮藥物的質譜分析參數

表4 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的檢出限

表5 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的標準曲線

GB/T 20366—2006 幾種喹諾酮藥物檢出限在0.04 μg/kg～0.32 μg/kg之間；GB/T 21312—2007幾種喹諾酮藥物檢出限在0.34 μg/kg～1.67 μg/kg之間，表明GB/T 20366—2006 靈敏度高于GB/T 21312 —2007，但兩種方法均滿足檢測要求。

由表5 可知，GB/T 20366—2006 中標曲采用裸標，標曲的相關系數R ≥0.998，有較好的線性相關，而GB/T 21312—2007 標準曲線由于采用隨行加標，相關系數R 最小為0.991 最大為0.997 波動幅度較大，且線性不如GB/T 20366—2006。

2.2 精密度和加標回收率

于5 g（精確到0.01 g）陰性樣品中分別加入10 ng、20 ng、40 ng 的混合標準溶液，按1.3.1 進行處理，每個濃度設置6 個平行樣，由標準曲線計算對應回收率和相對標準偏差，詳見表6 和表7。

表6 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的回收率（r=6）

表7 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的精密度（r=6）

由表6 和表7 可知，GB/T 20366—2006 回收率為53.72%～71.30%，相對標準偏差為1.26%～ 7.69%。GB/T 21312—2007 回收率為84.37%～98.81%，相對標準偏差為1.72%～6.58%。GB/T 20366-2006 回收率較低，其中諾氟沙星回收率最低只有53.72%，可能的原因是GB/T 20366—2006 未考慮基質效應的影響，回收率較差。GB/T 21312—2007 回收率明顯高于GB/T 20366—2006。兩種國標精密度都滿足檢測要求。

2.3 基質效應

將基質配標的峰面積和裸標的峰面積通過公式ME(%)=(A/B)*100%[10]計算：

A 為裸標的峰面積；B 為基質配標的峰面積。當ME ＜100%時，基質對化合物產生抑制作用；當ME ＞100%時，基質對化合物產生增強作用；當ME=100%時，無基質效應。

試驗比較了兩種方法在濃度分別為5 ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL 的基質效應。結果見表8。

表8 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的基質效應

由表8 可知。GB/T 20366—2006、GB/T 21312—2007 均有明顯的基質效應，且不同化合物、同一不同濃度的基質效應影響不一；整體來說，GB/T 20366—2006 的基質效應較GB/T 21312—2007 小。由此可見，基質效應對LC-MS/MS 檢測喹諾酮類藥物的響應造成了不可忽視的影響，由于GB/T 21312—2007 采用隨行加標，消除了基質效應，因此回收率較高；而GB/T 20366—2006 采用裸標，忽視了基質效應，因此回收率較低。

2.4 方法的優化

雞肉中基質較為復雜，基質效應較大，GB/T 20366—2006 使用裸標導致回收率偏低，試驗改為基質配標或隨行加標，考察是否能抵消或者消除基質效應。GB/T 21312—2007 使用隨性加標的方式，線性較差，試驗考察基質配標對回收率及線性的影響；EDTA-Mcllvaine 緩沖液提取會提取出雞肉組織中的水溶性雜質和部分蛋白質導致過前處理小柱時堵塞，使用濾紙過濾后再過前處理小柱能有效避免前處理小柱堵塞。結果見表9、表10。

表9 優化后兩種方法中幾種喹諾酮藥物的回收率（r=6）

表10 優化后兩種方法中幾種喹諾酮藥物的精密度（r=6）

由表9、表10 可知，優化后，GB/T 20366—2006采用基質配標回收率在68.17%～83.77%之間，相對標準偏差在1.38%～5.47%之間；采用隨行加標，回收率在79.75%～92.88%之間，相對標準偏差在1.22%～5.41%之間，由此可見，采用基質配標和隨行加標均能提高回收率，隨行加標不僅消除了基質效應，還考慮到實驗的操作誤差，因此加標回收率更好，因此，GB/T 20366—2006 采用隨行加標作為方法的標準曲線。GB/T 21312—2007采用基質配標線性較原標準的線性好，但是回收率在70.38%～89.27%之間，不及原標準，因此GB/T 21312—2007 采用原標準的標準曲線。

3 結論

試驗通過檢出限、線性、回收率、重復性、基質效應對兩種方法進行比較。結果顯示，由于雞肉基質復雜，兩種國標均有著不可忽視的基質效應。GB/T 20366—2006 提取和凈化時間明顯較短，操作更加便捷，有著更高的靈敏度和精密度，但回收率偏低；GB/T 21312—2007 有著更高的回收率。GB/T 20366—2006 在改進之后回收率顯著提高，檢測結果更加準確。GB/T 21312—2007 改進之后，使用濾紙過濾后再過前處理小柱能有效避免前處理小柱堵塞，節約檢測時間，提高檢測效率。兩種方法在優化之后都能滿足實驗室檢測需要，因此在應用中可以根據具體的條件選擇不同優化之后的方法來獲取更好的實驗結果。