α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE在畢赤酵母中的表達及應用

葉德曉,黃佳俊,盧宇靖,林育成,李慧靈,譚景航,周金林*

1(佛山市匯騰生物技術有限公司,廣東 佛山,528225)2(廣東金駿康生物技術有限公司,廣東 佛山,528225)

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC 3.2.1.40)是一類能從各種天然糖苷化合物中釋放末端α-L-鼠李糖苷的糖苷水解酶[1]。在動物、植物和微生物中均有發現,具有廣泛的底物特異性,能水解α-1、α-1,2、α-1,3、α-1,4和α-1,6連接的鼠李糖苷,少部分能水解2個鼠李糖苷連接的糖苷鍵[2]。α-L-鼠李糖苷酶一直被應用于各個領域[3]。如食品業中柑桔類果汁的去苦、飲料風味改善、藥物中間體的生產及改性、增加酒的香氣、生產鼠李糖和其他天然產物[3]。

糖基化在黃酮類化合物、萜類化合物、皂苷類化合物和酚酸等天然產物中是很普遍的自然現象,由于糖苷的種類、數量和連接位置的不同,許多天然糖苷化合物表現出不同的生物活性和溶解性,甚至在具有相同母核結構的化合物中也是如此[4-5]。天然產物的糖基化會影響其在食品和醫藥行業上的應用,例如橙皮苷和新橙皮苷具有相同的母核結構,兩者的區別在于鼠李糖基和葡萄糖基的連接方式不一樣,橙皮苷屬于α-1,6連接,新橙皮苷屬于α-1,2連接,由于鼠李糖基的連接方式不一樣導致兩者的溶解性存在較大差異,新橙皮苷在水中的溶解性遠遠大于橙皮苷,兩者在鼠李糖苷酶的水解下生成橙皮素單葡萄糖苷,更易被小腸吸收,從而提高黃酮類化合物在人體的生物利用率[6]。生物酶法水解對含鼠李糖苷的天然化合物具有高效、專一、溫和等特點,對天然化合物的生物轉化具有巨大的應用潛力和開發前景。

目前,商業化來源的α-L-鼠李糖苷酶制劑一般來源于黑曲霉和青霉菌,原始菌株來源發酵得到的α-L-鼠李糖苷酶不易純化,且含有葡萄糖苷酶、半乳糖糖苷酶等其他水解酶,在應用生產中容易產生副產物,不利于產物的純化和生產。利用基因工程手段,將α-L-鼠李糖苷酶基因進行克隆得到基因重組菌,將其進行表達,分離純化得到α-L-鼠李糖苷酶,能有效地將α-L-鼠李糖苷酶應用于生物轉化生產中。本研究將來源于Aspergillusnidulans菌株的α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE在畢赤酵母細胞中進行表達,得到純度高,專一性好的鼠李糖苷酶AnRhaE,能有效地應用于工業生產中。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養基

克隆宿主大腸桿菌Top10、畢赤酵母KM71H和畢赤酵母GS115、表達載體pPIC9K均購買自Invitrogen公司,pPIC9K-AnRhaE為本研究構建保存。所用培養基為LB培養基、YPD培養基、BMGY培養基和BMMY培養基。

1.1.2 主要實驗材料

限制性內切酶SalⅠ、NotⅠ、EcoRⅠ、Lysis buffer、DNA Markers，寶日醫生物技術有限公司；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、2×PCR Master Mix、引物和其余實驗用到試劑均為國產分析，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器和設備

HCB-1300V型超凈工作臺,海爾；BIO-RAD MicroPulser 型電轉儀、Biorad T-100型PCR儀,BIO-RAD公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀,Agilent Technologies Inc.；ZQLY-300S型恒溫搖床,上海知楚儀器有限公司；BPC-70型生化培養箱,上海一恒科學儀器有限公司；SZB-20型制冰機,上海析達儀器有限公司；LDZM-80KCS型滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；H1850R型高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 序列分析

由CAZy(http://www.cazy.org)數據庫[7],獲知8個已鑒定的3D結構的α-L-鼠李糖苷酶及其PDB和GenBank序列號。經GenBank序列號在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲知其氨基酸序列,利用Clustalx軟件進行氨基酸多重序列比對,最后利用MEGA7軟件基于Neighbor-joining制作鼠李糖苷酶分子進化樹[8]。

1.2.2 基因克隆

根據AnRhaE在NCBI數據庫中公布的GenBank序列信息,利用密碼子偏好性在線分析網站對AnRhaE在畢赤酵母細胞中密碼子的偏好性進行分析,對其DNA序列進行密碼子優化,依據優化結果交由通用生物系統(安徽)有限公司進行合成AnRhaE基因,分別將合成的AnRhaE基因無縫克隆至pPIC9K載體上,轉化至Top10大腸桿菌,經卡那霉素篩選候選克隆子,使用質粒提取試劑盒抽提質粒pPIC9K-AnRhaE。

以質粒pPIC9K-AnRhaE為模板,通用引物5′AOX-GACTGGTTCCAATTGACAAGC和3′AOX-GCAAATGGCATTCTGACATCC,反應條件是94 ℃下預變性1 min；98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,30個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定,將PCR鑒定正確的質粒送去生工生物(上海)有限公司測序,將測序正確的命名為Top10-pPIC9K-AnRhaE。

1.2.3 重組畢赤酵母的構建和異源表達

將測序正確的Top10-pPIC9K-AnRhaE菌在LB培養基中培養,利用質粒提取試劑盒提取質粒pPIC9K-AnRhaE,利用限制性內切酶SalⅠ線性化pPIC9K-AnRhaE,經回收試劑盒回收后于-20 ℃保存備用。參照畢赤酵母表達操作手冊制備畢赤酵母GS115感受態細胞和畢赤酵母KM71H感受態細胞,-80 ℃保存備用。將線性化的pPIC9K-AnRhaE質粒載體按照畢赤酵母表達操作手冊的電轉化方法分別轉化進畢赤酵母GS115和畢赤酵母KM71H中。在含1 g/L G418的YPD培養基中培養2 d后,挑選單菌落使用Lysis Buffer裂解后進行PCR鑒定,分別以引物AnF-ATGTCGCTGTCAATTTCTGG和AnR-TCAACCGAGCGTACTCTCAAA進行PCR鑒定,反應條件是94 ℃下預變性10 min；98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸3 min,30個循環；72 ℃延伸7 min。將鑒定正確的陽性克隆命名為GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE。

分別接種GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE到YPD液體培養基30 ℃活化培養20 h,按照體積分數為1%的接種量接種于裝有50 mL BMGY培養基中,30 ℃ 200 r/min培養OD600到2～6。室溫條件下3 000×g離心5 min,收集菌體,用50 mL BMMY(pH 6.0)重懸菌體,28 ℃ 200 r/min誘導表達,每24 h向培養基中添加終體積分數為0.5%的甲醇,維持誘導條件。誘導表達5 d,4 ℃ 12 000×g離心收集菌體,上清液即為粗酶液。取樣品進行SDS-PAGE,檢測AnRhaE在畢赤酵母中的異源表達情況。

1.2.4 發酵罐的高密度培養

挑取GS115-pPIC9K-AnRhaE單菌落于YPD培養基中,30 ℃ 200 r/min培養24 h。將種子液按體積分數為1%的接種量接種至發酵培養基(40 g/L甘油,基礎鹽類,PTM鹽類)中30 ℃培養,通氣量4.4 L/min,初始轉速800 r/min,用氨水調節培養基的pH為5左右[9]。當發酵20～30 h,甘油耗盡,溶氧值(dissolved oxygen,DO)下降為0后又回升時,設定DO值為30%,并設置補甘油與溶氧聯動,當DO值大于30%時,進行補加甘油。甘油補料培養至濕菌體質量濃度達到200～300 g/L時停止,待甘油消耗完后饑餓0.5～1 h,DO上升后,設置補甲醇與溶氧聯動,當DO值大于30%,進行補加含12 mL/L PTM的甲醇,調整轉速為900 r/min,溫度為28 ℃進行誘導培養,誘導至最佳時間后,停止發酵,離心收集AnRhaE酶液。

1.2.5 活性和底物分析

為檢測AnRhaE在不同溫度(30～75 ℃)和pH(3～10)下的活性。以柚苷為底物,分別加入反應緩沖液(pH 3～10),混勻；再加入AnRhaE酶液到混合后的溶液中,不同溫度(30～75 ℃)下進行反應；反應結束后滅酶；結果用HPLC檢測。

為檢測AnRhaE對自然底物特異性,以柚苷二氫查耳酮、柚苷、蘆丁、新橙皮苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷為底物,分別加入pH 5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,混勻；再加入AnRhaE酶液到混合后的溶液中,55 ℃恒溫反應；反應結束后滅酶；結果用HPLC檢測(空白對照為緩沖液加底物)。

2 結果與分析

2.1 序列分析

檢索CAZy數據庫,AnRhaE屬于GH78家族,具有861個氨基酸殘基,預測理論分子質量為95.2 kDa,等電點pI值為4.76,具有11個糖基化位點,經SignalP 4.1預測無信號肽序列[10],包含4個超家族保守結構域。

AnRhaE(CCB96437.1)與6個GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶的序列比對結果如下：與來源于AspergillusterreusCCF 3059的AtRha(AFH54529.1)[11]序列相似性為69.16%；與來源于StreptomycesavermitilisMA-4680=NBRC 14893的SaRha78A(BAC68538.1)[12]序列相似為39.3%；與來源于Dictyoglomusthermophilum的DtRha(ACI19983.1)[13]序列相似性為31.24%；與來源于Bacillussp.GL1的RhaB(BAB62315.1)[14]序列相似性為29.45%；與來源于BacteroidesthetaiotaomicronVPI-5482的BtRh78a(AAO76108.1)[15]序列相似性為23.94%；與來源于KlebsiellaoxytocaKCTC 1686的KoRha(AEX05711.1)[16]序列相似性為18.22%。AnRhaE與2個GH106家族的α-L-鼠李糖苷酶的序列比對結果如下：與來源于BacteroidesthetaiotaomicronVPI-5482的BtRh106a(AAO76093.1)[17]序列相似性為23.02%；與來源于Novosphingobiumsp. PP1Y的RhaP(CCA90848.1)[18]序列相似性為20.00%。根據序列比對結果,AnRhaE與AtRha相似高,可以進行同源建模,進而預測AnRhaE的3D結構和相關生物學功能。

與上述的6個GH78家族已知3D結構的α-L-鼠李糖苷酶進行多重序列比對,結果顯示Trp111、Phe396、Arg397、Asp458、Trp468、Gly470、Asp471、Leu493、Asp577、Trp580、Leu703、Trp736、Glu737、Ser755、His758和Gly807的氨基酸殘基高度保守。經過與AtRha(PDB：6 gsz)的3D結構比較分析[19],推測Trp215、Ser216和Asn370與底物結合口袋相關,Asp458、Arg462、Glu465、Asp471、Trp524、Tyr579、Trp578、Phe693、Met753和His758與底物結合方面起到重要作用,Glu464和Glu737在生物催化活性上發揮重要作用。AnRhaE與6個GH78家族和2個GH106家族已知3D結構的α-L-鼠李糖苷酶多重序列比對后構建系統發育進化樹(圖1),結果表明AnRhaE屬于GH78家族,且與AtRha進化關系相近,屬于一個進化分支,兩者生物活性和結構比較接近。

圖1 AnRhaE系統發育進化樹Fig.1 Neighbour-Joining tree showing the phylogenetic relationships of AnRhaE

2.2 基因克隆

將合成的AnRhaE基因利用無縫克隆技術連入pPIC9K載體中，將連接后的重組質粒轉化進大腸桿菌Top10中。圖2-a是挑選陽性克隆培養后使用AOX引物進行菌液PCR鑒定的結果,可以得到約2 800 bp大小的片段。選取鑒定正確的陽性單克隆送去生工生物工程(上海)股份有限公司測序,比對后確認是正確克隆。對構建成功的重組菌命名為Top10-pPIC9K-AnRhaE,保留菌種,以備后續實驗使用。培養Top10-pPIC9K-AnRhaE,提取質粒,如圖2-b。

a-M-DNA Makers；1～6-陽性克隆PCR;b-M-DNA Makers；1-pPIC9K-AnRhaE質粒圖2 pPIC9K-AnRhaE克隆鑒定及質粒提取Fig.2 PCR identification of clones and plasmid of pPIC9K-AnRhaE

2.3 重組表達畢赤酵母菌構建及表達

將質粒pPIC9K-AnRhaE經SalI線性化后,電轉化至畢赤酵母GS115和KM71H中。經含G418抗生素的YPD平板生長2～3 d后,挑選單菌落用裂解液進行裂解后,分別以AnF和AnR為引物進行菌落PCR鑒定,得到的陽性重組表達菌株分別命名為GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE。

圖3為重組畢赤酵母菌液PCR鑒定結果。圖3-a結果顯示GS115-pPIC9K-AnRhaE陽性菌株在在2 600 bp左右出現目的基因條帶,結果表明AnRhaE基因實現與畢赤酵母GS115基因組成功整合。圖3-b結果顯示KM71H-pPIC9K-AnRhaE陽性菌株在2 600 bp左右出現目的基因條帶,結果表明AnRhaE基因實現與畢赤酵母KM71H基因組成功整合。

a-GS115-pPIC9K-AnRhaE PCR鑒定(M-DNA Makers；1～6-重組克隆子);b-KM71H-pPIC9K-AnRhaE PCR鑒定(M-DNA Makers；1～4-重組克隆子PCR)圖3 pPIC9K-AnRhaE重組畢赤酵母鑒定Fig.3 PCR identification of recombinant Pichia pastoris

將重組表達菌株GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE進行培養,再經甲醇誘導表達后,分離得到酶液。取樣品進行SDS-PAGE,檢測AnRhaE在畢赤酵母中的異源表達情況,結果如圖4所示。

M-Mark；1-畢赤酵母空白對照；2-KM71H-pPIC9K-AnRhaE表達酶液；3-GS115-pPIC9K-AnRhaE表達酶液圖4 重組畢赤酵母表達α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE for the expression of recombinant AnRhaE

由圖4可知,重組畢赤酵母菌KM71H和GS115在130 kDa上有明顯的條帶,AnRhaE的理論分子質量為95.2 kDa,實際分子質量遠遠大于理論值,推測是由于AnRhaE具有較多糖基化位點,在畢赤酵母細胞中進行糖基化的緣故。重組畢赤酵母表達AnRhaE的條帶單一,表達較好,其中GS115宿主菌表達量要高于KM71H,因此后續表達AnRhaE酶采用重組表達菌株GS115-pPIC9K-AnRhaE。

2.4 發酵罐的高密度培養

由圖5可知,重組GS115-pPIC9K-AnRhaE畢赤酵母的高密度培養分為3個階段：發酵前期(Ⅰ)、甘油補料培養(Ⅱ)和甲醇補料誘導培養(Ⅲ)。發酵前期在培養25 h后甘油耗盡,DO值下降為0后又回升至62%,濕菌體質量為114.5 g/L。進入甘油補料培養階段繼續增加生物量,甘油補料17 h后濕菌體質量濃度為279.5 g/L,停止甘油補料,饑餓處理0.5 h。進入甲醇補料后,重組菌開始誘導表達AnRhaE,甲醇補料103 h后重組菌發酵趨于穩定,濕菌體質量濃度為359.5 g/L。發酵罐高密度培養相對于搖瓶培養,菌體密度更大,所生產的AnRhaE也更多,與搖瓶相比提升了約50倍。

圖5 重組畢赤酵母表達AnRhaE發酵曲線Fig.5 Fermentation curve of recombinant P.pastoris expression of AnRhaE

2.5 活性分析

為檢測AnRhaE在不同溫度(30～75 ℃)和pH(3～10)下的活性,以柚苷為底物進行反應,反應后的溶液用HPLC檢測。結果表明,溫度為45～55 ℃時酶活力高,60 ℃時酶活力降低了一半,65 ℃下酶活力急劇下降,75 ℃基本無酶活力(圖6-a)。pH 4.5～pH 8時的酶活性穩定,活性較高,pH 3時幾乎無活性,pH 4時具有90%左右的活性,pH 9和pH 10時酶活降到一半以下,AnRhaE的最適pH為5(圖6-b)。AnRhaE酶對pH的耐受范圍較廣,在弱酸性和弱堿性仍具有較高活性,可以較好的應用于工業生產中。

圖6 溫度和pH值對AnRhaE的影響Fig.6 Effect of temperature and pH on AnRhaE

2.6 底物特異性分析

以柚苷二氫查耳酮、柚苷、蘆丁、新橙皮苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷為底物,反應產物用HPLC進行檢測，其結果如圖7所示。結果顯示，AnRhaE能將柚苷二氫查耳酮水解為三葉苷,將柚苷水解為普魯寧,將蘆丁水解為異槲皮素,將新橙皮苷水解為橙皮素單葡萄糖苷,將橙皮苷水解為橙皮素單葡萄糖苷,朝藿定C水解為淫羊藿苷,但是不能進一步水解淫羊藿苷。上述底物中屬于α-1,2糖苷鍵連接的底物有柚苷二氫查耳酮、柚苷和新橙皮苷,屬于α-1,6糖苷鍵連接的底物有蘆丁和橙皮苷,而朝藿定C屬于2個鼠李糖苷的連接,淫羊藿苷屬于α-1糖苷鍵。根據這些結果,AnRhaE水解α-1,2、α-1,6和2個鼠李糖苷連接的底物,具有廣泛的底物,在工業生產中具有較好的應用價值和前景。

圖7 AnRhaE底物檢測Fig.7 Activities for different substrates

根據反應速度、底物與酶比和生成產物的量,AnRhaE對α-1,2糖苷鍵連接的底物具有較高的活性,而對α-1,6糖苷鍵連接的底物活性較差,特別是橙皮苷,只能水解部分生成橙皮素單葡萄糖苷,對朝藿定C的活性較好,能將朝藿定C完全水解生成淫羊藿苷。

3 討論與結論

本研究以A.nidulans的α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE為目標,對其氨基酸序列進行分析發現其具有861個氨基酸殘基,有糖基化位點,無信號肽序列,有4個保守超家族結構域。序列比對發現AnRhaE與來源于A.terreusCCF 3059的AtRha相似性較高達到69.19%,序列比對結果顯示有16個氨基酸殘基高度保守,3D建模顯示Trp215、Ser216和Asn370與底物結合口袋相關,Glu464和Glu737在生物催化活性上發揮重要作用。

通過密碼子優化、分子克隆技術和電轉化技術將AnRhaE重組于畢赤酵母GS115和KM71H中,成功構建重組表達菌株GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE,經甲醇誘導發酵后分別得到AnRhaE酶,SDS-PAGE電泳顯示AnRhaE在GS115的表達量高于KM71H,GS115更有利于生產AnRhaE酶。將GS115-pPIC9K-AnRhaE在5 L發酵罐中進行高密度發酵培養,最終濕菌體質量濃度達到359.5 g/L,AnRhaE酶與搖瓶相比增加了約50倍。AnRhaE酶在溫度為45～55 ℃時酶活力高,最適溫度為55 ℃；pH 4.5～pH 8時酶活性穩定,最適pH為5；AnRhaE酶對pH的耐受范圍較廣,在弱酸性和弱堿性仍具有較高活性,可以較好地應用于工業生產中。AnRhaE水解α-1,2、α-1,6和2個鼠李糖苷連接的底物,具有廣泛的底物,包括柚苷二氫查耳酮、柚苷、蘆丁、新橙皮苷、橙皮苷和朝藿定C等天然產物,但是AnRhaE對α-1,2糖苷鍵連接的底物具有較高的活性,而對α-1,6糖苷鍵連接的底物活性較差,對朝藿定C的活性較好,能將朝藿定C完全水解生成淫羊藿苷,因此AnRhaE酶在天然產物之間的轉化具有較好的應用價值和前景。