α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE在畢赤酵母中的表達(dá)及應(yīng)用

葉德曉,黃佳俊,盧宇靖,林育成,李慧靈,譚景航,周金林*

1(佛山市匯騰生物技術(shù)有限公司,廣東 佛山,528225)2(廣東金駿康生物技術(shù)有限公司,廣東 佛山,528225)

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC 3.2.1.40)是一類能從各種天然糖苷化合物中釋放末端α-L-鼠李糖苷的糖苷水解酶[1]。在動物、植物和微生物中均有發(fā)現(xiàn),具有廣泛的底物特異性,能水解α-1、α-1,2、α-1,3、α-1,4和α-1,6連接的鼠李糖苷,少部分能水解2個鼠李糖苷連接的糖苷鍵[2]。α-L-鼠李糖苷酶一直被應(yīng)用于各個領(lǐng)域[3]。如食品業(yè)中柑桔類果汁的去苦、飲料風(fēng)味改善、藥物中間體的生產(chǎn)及改性、增加酒的香氣、生產(chǎn)鼠李糖和其他天然產(chǎn)物[3]。

糖基化在黃酮類化合物、萜類化合物、皂苷類化合物和酚酸等天然產(chǎn)物中是很普遍的自然現(xiàn)象,由于糖苷的種類、數(shù)量和連接位置的不同,許多天然糖苷化合物表現(xiàn)出不同的生物活性和溶解性,甚至在具有相同母核結(jié)構(gòu)的化合物中也是如此[4-5]。天然產(chǎn)物的糖基化會影響其在食品和醫(yī)藥行業(yè)上的應(yīng)用,例如橙皮苷和新橙皮苷具有相同的母核結(jié)構(gòu),兩者的區(qū)別在于鼠李糖基和葡萄糖基的連接方式不一樣,橙皮苷屬于α-1,6連接,新橙皮苷屬于α-1,2連接,由于鼠李糖基的連接方式不一樣導(dǎo)致兩者的溶解性存在較大差異,新橙皮苷在水中的溶解性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于橙皮苷,兩者在鼠李糖苷酶的水解下生成橙皮素單葡萄糖苷,更易被小腸吸收,從而提高黃酮類化合物在人體的生物利用率[6]。生物酶法水解對含鼠李糖苷的天然化合物具有高效、專一、溫和等特點(diǎn),對天然化合物的生物轉(zhuǎn)化具有巨大的應(yīng)用潛力和開發(fā)前景。

目前,商業(yè)化來源的α-L-鼠李糖苷酶制劑一般來源于黑曲霉和青霉菌,原始菌株來源發(fā)酵得到的α-L-鼠李糖苷酶不易純化,且含有葡萄糖苷酶、半乳糖糖苷酶等其他水解酶,在應(yīng)用生產(chǎn)中容易產(chǎn)生副產(chǎn)物,不利于產(chǎn)物的純化和生產(chǎn)。利用基因工程手段,將α-L-鼠李糖苷酶基因進(jìn)行克隆得到基因重組菌,將其進(jìn)行表達(dá),分離純化得到α-L-鼠李糖苷酶,能有效地將α-L-鼠李糖苷酶應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)中。本研究將來源于Aspergillusnidulans菌株的α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE在畢赤酵母細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),得到純度高,專一性好的鼠李糖苷酶AnRhaE,能有效地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

克隆宿主大腸桿菌Top10、畢赤酵母KM71H和畢赤酵母GS115、表達(dá)載體pPIC9K均購買自Invitrogen公司,pPIC9K-AnRhaE為本研究構(gòu)建保存。所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基和BMMY培養(yǎng)基。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

限制性內(nèi)切酶SalⅠ、NotⅠ、EcoRⅠ、Lysis buffer、DNA Markers，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、2×PCR Master Mix、引物和其余實(shí)驗(yàn)用到試劑均為國產(chǎn)分析，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

HCB-1300V型超凈工作臺,海爾；BIO-RAD MicroPulser 型電轉(zhuǎn)儀、Biorad T-100型PCR儀,BIO-RAD公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀,Agilent Technologies Inc.；ZQLY-300S型恒溫?fù)u床,上海知楚儀器有限公司；BPC-70型生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SZB-20型制冰機(jī),上海析達(dá)儀器有限公司；LDZM-80KCS型滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；H1850R型高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 序列分析

由CAZy(http://www.cazy.org)數(shù)據(jù)庫[7],獲知8個已鑒定的3D結(jié)構(gòu)的α-L-鼠李糖苷酶及其PDB和GenBank序列號。經(jīng)GenBank序列號在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲知其氨基酸序列,利用Clustalx軟件進(jìn)行氨基酸多重序列比對,最后利用MEGA7軟件基于Neighbor-joining制作鼠李糖苷酶分子進(jìn)化樹[8]。

1.2.2 基因克隆

根據(jù)AnRhaE在NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的GenBank序列信息,利用密碼子偏好性在線分析網(wǎng)站對AnRhaE在畢赤酵母細(xì)胞中密碼子的偏好性進(jìn)行分析,對其DNA序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,依據(jù)優(yōu)化結(jié)果交由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行合成AnRhaE基因,分別將合成的AnRhaE基因無縫克隆至pPIC9K載體上,轉(zhuǎn)化至Top10大腸桿菌,經(jīng)卡那霉素篩選候選克隆子,使用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒pPIC9K-AnRhaE。

以質(zhì)粒pPIC9K-AnRhaE為模板,通用引物5′AOX-GACTGGTTCCAATTGACAAGC和3′AOX-GCAAATGGCATTCTGACATCC,反應(yīng)條件是94 ℃下預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定,將PCR鑒定正確的質(zhì)粒送去生工生物(上海)有限公司測序,將測序正確的命名為Top10-pPIC9K-AnRhaE。

1.2.3 重組畢赤酵母的構(gòu)建和異源表達(dá)

將測序正確的Top10-pPIC9K-AnRhaE菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pPIC9K-AnRhaE,利用限制性內(nèi)切酶SalⅠ線性化pPIC9K-AnRhaE,經(jīng)回收試劑盒回收后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩⒄债叧嘟湍副磉_(dá)操作手冊制備畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞和畢赤酵母KM71H感受態(tài)細(xì)胞,-80 ℃保存?zhèn)溆谩⒕€性化的pPIC9K-AnRhaE質(zhì)粒載體按照畢赤酵母表達(dá)操作手冊的電轉(zhuǎn)化方法分別轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母GS115和畢赤酵母KM71H中。在含1 g/L G418的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后,挑選單菌落使用Lysis Buffer裂解后進(jìn)行PCR鑒定,分別以引物AnF-ATGTCGCTGTCAATTTCTGG和AnR-TCAACCGAGCGTACTCTCAAA進(jìn)行PCR鑒定,反應(yīng)條件是94 ℃下預(yù)變性10 min；98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸3 min,30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將鑒定正確的陽性克隆命名為GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE。

分別接種GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基30 ℃活化培養(yǎng)20 h,按照體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種于裝有50 mL BMGY培養(yǎng)基中,30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)OD600到2～6。室溫條件下3 000×g離心5 min,收集菌體,用50 mL BMMY(pH 6.0)重懸菌體,28 ℃ 200 r/min誘導(dǎo)表達(dá),每24 h向培養(yǎng)基中添加終體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇,維持誘導(dǎo)條件。誘導(dǎo)表達(dá)5 d,4 ℃ 12 000×g離心收集菌體,上清液即為粗酶液。取樣品進(jìn)行SDS-PAGE,檢測AnRhaE在畢赤酵母中的異源表達(dá)情況。

1.2.4 發(fā)酵罐的高密度培養(yǎng)

挑取GS115-pPIC9K-AnRhaE單菌落于YPD培養(yǎng)基中,30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h。將種子液按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基(40 g/L甘油,基礎(chǔ)鹽類,PTM鹽類)中30 ℃培養(yǎng),通氣量4.4 L/min,初始轉(zhuǎn)速800 r/min,用氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為5左右[9]。當(dāng)發(fā)酵20～30 h,甘油耗盡,溶氧值(dissolved oxygen,DO)下降為0后又回升時,設(shè)定DO值為30%,并設(shè)置補(bǔ)甘油與溶氧聯(lián)動,當(dāng)DO值大于30%時,進(jìn)行補(bǔ)加甘油。甘油補(bǔ)料培養(yǎng)至濕菌體質(zhì)量濃度達(dá)到200～300 g/L時停止,待甘油消耗完后饑餓0.5～1 h,DO上升后,設(shè)置補(bǔ)甲醇與溶氧聯(lián)動,當(dāng)DO值大于30%,進(jìn)行補(bǔ)加含12 mL/L PTM的甲醇,調(diào)整轉(zhuǎn)速為900 r/min,溫度為28 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)至最佳時間后,停止發(fā)酵,離心收集AnRhaE酶液。

1.2.5 活性和底物分析

為檢測AnRhaE在不同溫度(30～75 ℃)和pH(3～10)下的活性。以柚苷為底物,分別加入反應(yīng)緩沖液(pH 3～10),混勻；再加入AnRhaE酶液到混合后的溶液中,不同溫度(30～75 ℃)下進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后滅酶；結(jié)果用HPLC檢測。

為檢測AnRhaE對自然底物特異性,以柚苷二氫查耳酮、柚苷、蘆丁、新橙皮苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷為底物,分別加入pH 5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,混勻；再加入AnRhaE酶液到混合后的溶液中,55 ℃恒溫反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后滅酶；結(jié)果用HPLC檢測(空白對照為緩沖液加底物)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

檢索CAZy數(shù)據(jù)庫,AnRhaE屬于GH78家族,具有861個氨基酸殘基,預(yù)測理論分子質(zhì)量為95.2 kDa,等電點(diǎn)pI值為4.76,具有11個糖基化位點(diǎn),經(jīng)SignalP 4.1預(yù)測無信號肽序列[10],包含4個超家族保守結(jié)構(gòu)域。

AnRhaE(CCB96437.1)與6個GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶的序列比對結(jié)果如下：與來源于AspergillusterreusCCF 3059的AtRha(AFH54529.1)[11]序列相似性為69.16%；與來源于StreptomycesavermitilisMA-4680=NBRC 14893的SaRha78A(BAC68538.1)[12]序列相似為39.3%；與來源于Dictyoglomusthermophilum的DtRha(ACI19983.1)[13]序列相似性為31.24%；與來源于Bacillussp.GL1的RhaB(BAB62315.1)[14]序列相似性為29.45%；與來源于BacteroidesthetaiotaomicronVPI-5482的BtRh78a(AAO76108.1)[15]序列相似性為23.94%；與來源于KlebsiellaoxytocaKCTC 1686的KoRha(AEX05711.1)[16]序列相似性為18.22%。AnRhaE與2個GH106家族的α-L-鼠李糖苷酶的序列比對結(jié)果如下：與來源于BacteroidesthetaiotaomicronVPI-5482的BtRh106a(AAO76093.1)[17]序列相似性為23.02%；與來源于Novosphingobiumsp. PP1Y的RhaP(CCA90848.1)[18]序列相似性為20.00%。根據(jù)序列比對結(jié)果,AnRhaE與AtRha相似高,可以進(jìn)行同源建模,進(jìn)而預(yù)測AnRhaE的3D結(jié)構(gòu)和相關(guān)生物學(xué)功能。

與上述的6個GH78家族已知3D結(jié)構(gòu)的α-L-鼠李糖苷酶進(jìn)行多重序列比對,結(jié)果顯示Trp111、Phe396、Arg397、Asp458、Trp468、Gly470、Asp471、Leu493、Asp577、Trp580、Leu703、Trp736、Glu737、Ser755、His758和Gly807的氨基酸殘基高度保守。經(jīng)過與AtRha(PDB：6 gsz)的3D結(jié)構(gòu)比較分析[19],推測Trp215、Ser216和Asn370與底物結(jié)合口袋相關(guān),Asp458、Arg462、Glu465、Asp471、Trp524、Tyr579、Trp578、Phe693、Met753和His758與底物結(jié)合方面起到重要作用,Glu464和Glu737在生物催化活性上發(fā)揮重要作用。AnRhaE與6個GH78家族和2個GH106家族已知3D結(jié)構(gòu)的α-L-鼠李糖苷酶多重序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖1),結(jié)果表明AnRhaE屬于GH78家族,且與AtRha進(jìn)化關(guān)系相近,屬于一個進(jìn)化分支,兩者生物活性和結(jié)構(gòu)比較接近。

圖1 AnRhaE系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Neighbour-Joining tree showing the phylogenetic relationships of AnRhaE

2.2 基因克隆

將合成的AnRhaE基因利用無縫克隆技術(shù)連入pPIC9K載體中，將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌Top10中。圖2-a是挑選陽性克隆培養(yǎng)后使用AOX引物進(jìn)行菌液PCR鑒定的結(jié)果,可以得到約2 800 bp大小的片段。選取鑒定正確的陽性單克隆送去生工生物工程(上海)股份有限公司測序,比對后確認(rèn)是正確克隆。對構(gòu)建成功的重組菌命名為Top10-pPIC9K-AnRhaE,保留菌種,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。培養(yǎng)Top10-pPIC9K-AnRhaE,提取質(zhì)粒,如圖2-b。

a-M-DNA Makers；1～6-陽性克隆PCR;b-M-DNA Makers；1-pPIC9K-AnRhaE質(zhì)粒圖2 pPIC9K-AnRhaE克隆鑒定及質(zhì)粒提取Fig.2 PCR identification of clones and plasmid of pPIC9K-AnRhaE

2.3 重組表達(dá)畢赤酵母菌構(gòu)建及表達(dá)

將質(zhì)粒pPIC9K-AnRhaE經(jīng)SalI線性化后,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115和KM71H中。經(jīng)含G418抗生素的YPD平板生長2～3 d后,挑選單菌落用裂解液進(jìn)行裂解后,分別以AnF和AnR為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定,得到的陽性重組表達(dá)菌株分別命名為GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE。

圖3為重組畢赤酵母菌液PCR鑒定結(jié)果。圖3-a結(jié)果顯示GS115-pPIC9K-AnRhaE陽性菌株在在2 600 bp左右出現(xiàn)目的基因條帶,結(jié)果表明AnRhaE基因?qū)崿F(xiàn)與畢赤酵母GS115基因組成功整合。圖3-b結(jié)果顯示KM71H-pPIC9K-AnRhaE陽性菌株在2 600 bp左右出現(xiàn)目的基因條帶,結(jié)果表明AnRhaE基因?qū)崿F(xiàn)與畢赤酵母KM71H基因組成功整合。

a-GS115-pPIC9K-AnRhaE PCR鑒定(M-DNA Makers；1～6-重組克隆子);b-KM71H-pPIC9K-AnRhaE PCR鑒定(M-DNA Makers；1～4-重組克隆子PCR)圖3 pPIC9K-AnRhaE重組畢赤酵母鑒定Fig.3 PCR identification of recombinant Pichia pastoris

將重組表達(dá)菌株GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE進(jìn)行培養(yǎng),再經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,分離得到酶液。取樣品進(jìn)行SDS-PAGE,檢測AnRhaE在畢赤酵母中的異源表達(dá)情況,結(jié)果如圖4所示。

M-Mark；1-畢赤酵母空白對照；2-KM71H-pPIC9K-AnRhaE表達(dá)酶液；3-GS115-pPIC9K-AnRhaE表達(dá)酶液圖4 重組畢赤酵母表達(dá)α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE for the expression of recombinant AnRhaE

由圖4可知,重組畢赤酵母菌KM71H和GS115在130 kDa上有明顯的條帶,AnRhaE的理論分子質(zhì)量為95.2 kDa,實(shí)際分子質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于理論值,推測是由于AnRhaE具有較多糖基化位點(diǎn),在畢赤酵母細(xì)胞中進(jìn)行糖基化的緣故。重組畢赤酵母表達(dá)AnRhaE的條帶單一,表達(dá)較好,其中GS115宿主菌表達(dá)量要高于KM71H,因此后續(xù)表達(dá)AnRhaE酶采用重組表達(dá)菌株GS115-pPIC9K-AnRhaE。

2.4 發(fā)酵罐的高密度培養(yǎng)

由圖5可知,重組GS115-pPIC9K-AnRhaE畢赤酵母的高密度培養(yǎng)分為3個階段：發(fā)酵前期(Ⅰ)、甘油補(bǔ)料培養(yǎng)(Ⅱ)和甲醇補(bǔ)料誘導(dǎo)培養(yǎng)(Ⅲ)。發(fā)酵前期在培養(yǎng)25 h后甘油耗盡,DO值下降為0后又回升至62%,濕菌體質(zhì)量為114.5 g/L。進(jìn)入甘油補(bǔ)料培養(yǎng)階段繼續(xù)增加生物量,甘油補(bǔ)料17 h后濕菌體質(zhì)量濃度為279.5 g/L,停止甘油補(bǔ)料,饑餓處理0.5 h。進(jìn)入甲醇補(bǔ)料后,重組菌開始誘導(dǎo)表達(dá)AnRhaE,甲醇補(bǔ)料103 h后重組菌發(fā)酵趨于穩(wěn)定,濕菌體質(zhì)量濃度為359.5 g/L。發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)相對于搖瓶培養(yǎng),菌體密度更大,所生產(chǎn)的AnRhaE也更多,與搖瓶相比提升了約50倍。

圖5 重組畢赤酵母表達(dá)AnRhaE發(fā)酵曲線Fig.5 Fermentation curve of recombinant P.pastoris expression of AnRhaE

2.5 活性分析

為檢測AnRhaE在不同溫度(30～75 ℃)和pH(3～10)下的活性,以柚苷為底物進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)后的溶液用HPLC檢測。結(jié)果表明,溫度為45～55 ℃時酶活力高,60 ℃時酶活力降低了一半,65 ℃下酶活力急劇下降,75 ℃基本無酶活力(圖6-a)。pH 4.5～pH 8時的酶活性穩(wěn)定,活性較高,pH 3時幾乎無活性,pH 4時具有90%左右的活性,pH 9和pH 10時酶活降到一半以下,AnRhaE的最適pH為5(圖6-b)。AnRhaE酶對pH的耐受范圍較廣,在弱酸性和弱堿性仍具有較高活性,可以較好的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。

圖6 溫度和pH值對AnRhaE的影響Fig.6 Effect of temperature and pH on AnRhaE

2.6 底物特異性分析

以柚苷二氫查耳酮、柚苷、蘆丁、新橙皮苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷為底物,反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC進(jìn)行檢測，其結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，AnRhaE能將柚苷二氫查耳酮水解為三葉苷,將柚苷水解為普魯寧,將蘆丁水解為異槲皮素,將新橙皮苷水解為橙皮素單葡萄糖苷,將橙皮苷水解為橙皮素單葡萄糖苷,朝藿定C水解為淫羊藿苷,但是不能進(jìn)一步水解淫羊藿苷。上述底物中屬于α-1,2糖苷鍵連接的底物有柚苷二氫查耳酮、柚苷和新橙皮苷,屬于α-1,6糖苷鍵連接的底物有蘆丁和橙皮苷,而朝藿定C屬于2個鼠李糖苷的連接,淫羊藿苷屬于α-1糖苷鍵。根據(jù)這些結(jié)果,AnRhaE水解α-1,2、α-1,6和2個鼠李糖苷連接的底物,具有廣泛的底物,在工業(yè)生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用價值和前景。

圖7 AnRhaE底物檢測Fig.7 Activities for different substrates

根據(jù)反應(yīng)速度、底物與酶比和生成產(chǎn)物的量,AnRhaE對α-1,2糖苷鍵連接的底物具有較高的活性,而對α-1,6糖苷鍵連接的底物活性較差,特別是橙皮苷,只能水解部分生成橙皮素單葡萄糖苷,對朝藿定C的活性較好,能將朝藿定C完全水解生成淫羊藿苷。

3 討論與結(jié)論

本研究以A.nidulans的α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE為目標(biāo),對其氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其具有861個氨基酸殘基,有糖基化位點(diǎn),無信號肽序列,有4個保守超家族結(jié)構(gòu)域。序列比對發(fā)現(xiàn)AnRhaE與來源于A.terreusCCF 3059的AtRha相似性較高達(dá)到69.19%,序列比對結(jié)果顯示有16個氨基酸殘基高度保守,3D建模顯示Trp215、Ser216和Asn370與底物結(jié)合口袋相關(guān),Glu464和Glu737在生物催化活性上發(fā)揮重要作用。

通過密碼子優(yōu)化、分子克隆技術(shù)和電轉(zhuǎn)化技術(shù)將AnRhaE重組于畢赤酵母GS115和KM71H中,成功構(gòu)建重組表達(dá)菌株GS115-pPIC9K-AnRhaE和KM71H-pPIC9K-AnRhaE,經(jīng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵后分別得到AnRhaE酶,SDS-PAGE電泳顯示AnRhaE在GS115的表達(dá)量高于KM71H,GS115更有利于生產(chǎn)AnRhaE酶。將GS115-pPIC9K-AnRhaE在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng),最終濕菌體質(zhì)量濃度達(dá)到359.5 g/L,AnRhaE酶與搖瓶相比增加了約50倍。AnRhaE酶在溫度為45～55 ℃時酶活力高,最適溫度為55 ℃；pH 4.5～pH 8時酶活性穩(wěn)定,最適pH為5；AnRhaE酶對pH的耐受范圍較廣,在弱酸性和弱堿性仍具有較高活性,可以較好地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。AnRhaE水解α-1,2、α-1,6和2個鼠李糖苷連接的底物,具有廣泛的底物,包括柚苷二氫查耳酮、柚苷、蘆丁、新橙皮苷、橙皮苷和朝藿定C等天然產(chǎn)物,但是AnRhaE對α-1,2糖苷鍵連接的底物具有較高的活性,而對α-1,6糖苷鍵連接的底物活性較差,對朝藿定C的活性較好,能將朝藿定C完全水解生成淫羊藿苷,因此AnRhaE酶在天然產(chǎn)物之間的轉(zhuǎn)化具有較好的應(yīng)用價值和前景。