玉米低聚肽中焦谷氨酰亮氨酸(pEL)二肽的研究

陳亮，王雨晴，冀峰，李月琪，馬勇，谷瑞增*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心 北京，100015) 2(島津企業管理(中國)有限公司 北京，100020)

玉米低聚肽是以工業化濕法生產玉米淀粉過程中產生的玉米蛋白粉為原料，利用現代生物酶解技術制得的小分子短肽混合物[1-3]。與其他植物蛋白相比，玉米蛋白含有高比例的支鏈氨基酸，且在其多肽鏈中存在著不同的功能區，其功能性質可經過酶解技術被釋放，因此玉米蛋白粉是生產玉米低聚肽良好的蛋白原料。已有廣泛研究表明玉米低聚肽具有多種功能活性，包括抗氧化[4]、降血壓[5]、修復肝損傷[6]、醒酒[7-10]等方面的生理功能。

玉米蛋白粉中玉米醇溶蛋白(zein)含量最高，占比為68%[11-12]。圖1為一條來源于Uniprot蛋白數據庫的玉米醇溶蛋白alpha-zein序列，該序列含有較多的谷氨酰胺(Q)及亮氨酸(L)，并且存在11個谷氨酰胺亮氨酸(Glu-Leu，QL)的氨基酸序列組合(突出顯示)。有研究表明，位于N末端位置的谷氨酰胺殘基在水溶液中不穩定，在加熱的情況下極易被環化形成焦谷氨酸殘基[13-16]，從而形成焦谷氨酰亮氨酸(pyroGlu-Leu，pEL)。有文獻報道，堿性蛋白酶對存在于C端的亮氨酸具有酶解傾向性[17]。因此，玉米蛋白經堿性蛋白酶酶解制得的玉米低聚肽中可能存在一定量的pEL。

圖1 玉米醇溶蛋白alpha-zein的蛋白序列Fig.1 Protein sequence of alpha-zein

臨床上，抑郁癥的治療主要依賴于抗抑郁藥，而長期服用藥物則存在著巨大的副作用風險。安全有效的食物輔助治療是增強抗抑郁療效的有效手段。食物所含的多種營養因子在治療抑郁癥方面也發揮著越來越重要的作用，如部分維生素、礦物質、ω-3脂肪酸、植物黃酮等功能食品配料[18]。研究表明，短肽的N末端具有環狀結構，當C端為亮氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸殘基時，一般具有抗抑郁的生理功能，研究已證實pEL二肽具有抗抑郁活性[19-20]。

本研究利用超快速液相色譜串聯三重四級桿質譜聯用系統(ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS)考察玉米低聚肽中pEL二肽，旨在為玉米低聚肽的開發提供研究思路，并為其作為新型功能食品的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉，市售；pEL標準品(純度≥99%)，上海吉爾生化有限公司；甲酸(色譜純)，迪馬科技；乙腈(色譜純)，德國Merck公司；超純水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q純水系統制備；超濾膜(1 000 Da)，廈門福美科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LCMS-8060超快速液相色譜儀與三重四級桿質譜儀聯用系統，島津；3K15臺式高速冷凍離心機，SIGMA；XS205DU分析天平，Mettler Toledo；FlowMem-0250超濾裝置，福美科技。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米低聚肽的制備

將300 g 玉米蛋白粉與5 L去離子水混勻，經堿性蛋白酶酶解3 h(50 ℃、pH 8.0、酶底比1∶100)后，用復合蛋白酶酶解2 h(50 ℃、pH 8.0、酶底比1∶50)。充分酶解后攪拌滅酶10 min(100 ℃)，并離心15 min(3 000 r/min)，收集上清液。上清液經1 000 Da的超濾膜超濾后得到分子質量<1 000 Da的玉米低聚肽溶液，溶液經濃縮及噴霧干燥后制得粉末狀玉米低聚肽。

1.3.2 玉米低聚肽的理化分析

采用國標規定的方法測定總蛋白含量(GB 5009.5—2010)、酸溶蛋白和低聚肽含量(GB/T 22729—2008)、相對分子質量分布(GB/T 22729—2008)和氨基酸組成(GB 5009.124—2016第一法)[13-15]，總蛋白含量以干基記，換算系數為6.25。

1.3.3 pEL結構的測定

利用UHPLC-MS/MS測定玉米低聚肽的pEL結構。

超快速液相色譜條件：Inertsil ODS-3色譜柱(2.1×250 mm，5 μm)；流動相A為體積分數0.1%甲酸水溶液，流動相B為體積分數0.1%甲酸乙腈溶液；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；洗脫條件：0～15 min, 0～50% B；15～20 min, 50%～100% B；20～25 min, 100% B；25～35 min, 0% B。

質譜條件：采用電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)，正離子掃描模式,多反應監測(multiple reaction monitoring,MRM)；霧化氣流速：3.0 L/min；加熱氣流速：10 L/min；干燥氣流速：10 L/min；噴霧電壓4.5 kV；接口溫度250 ℃；加熱器溫度400 ℃；離子源溫度300 ℃；利用儀器自動優化功能對pEL進行MRM參數優化，優化后的MRM參數見表1。

表1 測定pEL的MRM優化參數Table 1 The MRM conditions of pEL

樣品前處理：將樣品用流動相A配制成200 μg/mL的溶液，混勻后離心取上清液，用0.22 μm的過濾膜過濾，制得待測樣品。

1.3.4 數據統計分析

實驗共收集5批次玉米低聚肽樣品，每組試驗重復3次。采用Excel計算不同批次樣品中pEL含量，用平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 玉米低聚肽的蛋白質、肽含量和分子質量分布

玉米低聚肽的蛋白質(干基)含量為87.70%，肽(干基)含量為82.76%。表明蛋白質和肽含量高。測定玉米低聚肽相對分子質量分布的色譜圖見圖2，分子質量分布結果見表2。

圖2 玉米低聚肽的分子質量分布色譜圖Fig.2 Chromatograph of molecular weight distribution注：圖中虛線色譜圖分別對應4種分子量標準品：細胞色素C (相對分子質量12 500)、桿菌酶(相對分子質量1 450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(相對分子質量451)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(相對分子質量189)12 500);實線色譜圖代表玉米低聚肽樣品

表2 玉米低聚肽分子質量分布結果Table 2 Molecular weight distribution of corn oligopeptide

由表2可知，玉米低聚肽分子質量主要集中在140～1 000 Da，平均分子量為461.20 Da。有研究顯示，分子質量<1 000 Da的蛋白水解物更易被人體吸收從而發揮功能活性[16-17]，因此玉米低聚肽作為小分子短肽的混合物，有被人體直接吸收和發揮功能的潛力。

2.2 玉米低聚肽的氨基酸分析

根據1.3.2所述方法測定玉米低聚肽中氨基酸組成及含量(除色氨酸)，結果如表3所示。

表3 玉米低聚肽的氨基酸組成及含量Table 3 Amino acid profile of corn oligopeptide

玉米低聚肽中氨基酸總量為85.76%，必需氨基酸含量為28.22%，占總氨基酸的32.91%。谷氨酸(谷氨酰胺)為玉米低聚肽中含量最高的氨基酸，含量為21.76%；亮氨酸僅次于谷氨酸(谷氨酰胺)，且是含量最高的必需氨基酸，含量為12.79%。N末端的谷氨酸和谷氨酰胺易形成焦谷氨酸殘基，這使得玉米低聚肽中含有pEL二肽的可能性極大。

2.3 玉米低聚肽中pEL含量的分析

對共計5個批次的玉米低聚肽進行了分析定量。經計算，5批次玉米低聚肽中pEL的含量在0.58%～0.70%，如表4所示，且批次間無顯著差異(P>0.05)。定量色譜圖如圖3所示。

表4 不同批次玉米低聚肽中pEL的含量 單位：%

a-標準品;b-玉米低聚肽樣品圖3 pEL的定量色譜圖Fig.3 Quantitative chromatogram of pEL

本研究中，玉米低聚肽中pEL的含量均在0.5%以上，這使得玉米低聚肽在新型功能食品的開發方面具有一定前景。

3 結論

玉米低聚肽中蛋白含量高且多以低聚肽的形式存在，蛋白質(干基)含量為87.70%，肽(干基)含量為82.76%。分子質量主要集中在140～1 000 Da，平均分子質量為461.20 Da。玉米低聚肽中氨基酸總量為85.76%，必需氨基酸含量為28.22%，占總氨基酸的32.91%。谷氨酸(谷氨酰胺)為玉米低聚肽中含量最高的氨基酸，含量為21.76%；亮氨酸僅次于谷氨酸(谷氨酰胺)，且是含量最高的必需氨基酸，含量為12.79%。N末端的谷氨酸和谷氨酰胺易形成焦谷氨酸殘基，這使得玉米低聚肽中含有pEL二肽的可能性極大。結構鑒定結果顯示有pEL二肽存在，且5批次玉米低聚肽中pEL的含量在0.58%～0.70%之間，批次間無顯著差異，含量穩定。

本研究通過對玉米低聚肽中具有抗抑郁的天然成分pEL二肽進行分析，為玉米低聚肽作為新型功能食品的開發提供了理論依據。