醬油發(fā)酵用菌魯氏接合酵母的安全性

劉爽,張倩,杜船,周韜,趙佳豪,石磊,王春玲*

1(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津,300000)2(天津市利民調(diào)料有限公司,天津,300000)

醬油釀造工藝主要有低鹽固態(tài)和高鹽稀態(tài)兩種[1-2]。高鹽稀態(tài)醬油由于發(fā)酵周期較長(zhǎng),成品醬香醇厚,其產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)于低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油[3-5]。一般參與高鹽稀態(tài)醬油釀造的微生物主要有米曲霉、酵母菌和乳酸菌3大類[6-8]。米曲霉最直接的作用就是在醬油發(fā)酵過程中分泌大量酶系,對(duì)原料中的蛋白質(zhì)分解具有重要作用,我國目前醬油生產(chǎn)常用的菌株是滬釀3.042[9-10]。在醬醪發(fā)酵階段,魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)是主要的產(chǎn)醇酵母菌,球擬酵母(Torulopsishalophilus)[11-12]是主要的產(chǎn)酯酵母菌。將魯氏接合酵母應(yīng)用于醬油發(fā)酵過程中能增加醬油的醇香,對(duì)醬油風(fēng)味的形成起著重要的作用。

魯氏接合酵母具有較強(qiáng)的耐鹽能力,是醬油發(fā)酵過程中醇類物質(zhì)的主要代謝者,在代謝產(chǎn)生大量的高級(jí)醇、芳香雜醇類物質(zhì)的同時(shí),還能將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為多元醇和糖醇類物質(zhì)[13-14]。HAUCK等[15]研究顯示魯氏接合酵母代謝產(chǎn)生的乙醇、高級(jí)醇等物質(zhì)對(duì)醬油的風(fēng)味起到至關(guān)重要的作用。

雖然魯氏接合酵母作為傳統(tǒng)菌種用于醬油發(fā)酵已有較長(zhǎng)的歷史,但對(duì)于魯氏接合酵母自身的安全性研究卻涉及較少,本研究通過探討菌種在醬醪汁發(fā)酵中的代謝產(chǎn)物、膽鹽羥化酶活性檢測(cè)、溶血實(shí)驗(yàn)及耐藥性實(shí)驗(yàn)對(duì)菌種本身的安全性進(jìn)行初步探討,從而為傳統(tǒng)發(fā)酵菌株的安全性研究提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與培養(yǎng)基

氟康唑、兩性霉素B、甲氧胺-吡啶、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA)、甲醇、NaCl,北京索萊寶科技有限公司；牛黃脫氧膽酸鈉,上海吉至生化科技有限公司；伏立康唑藥敏紙片、酮康唑藥敏紙片、酮康唑藥敏紙片,北京普納科技有限公司；制霉菌素藥敏紙片、兩性霉素B藥敏紙片,杭州微生物試劑有限公司；所用培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrase,YPD)液體培養(yǎng)基、YPD瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂平板培養(yǎng)基。

1.2 菌種來源

魯氏接合酵母購自中國微生物菌種保藏中心,菌種編號(hào)為2.181,現(xiàn)由天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心存放。

1.3 儀器設(shè)備

GCMS-QP 2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津公司；MULTISKAN GO酶標(biāo)儀,美瑞泰克科技(天津)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 揮發(fā)性代謝物的測(cè)定分析

采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的方法[16]。

1.4.2 非揮發(fā)性代謝物的測(cè)定分析

采用硅烷化-氣質(zhì)聯(lián)用的方法[17]。

1.4.3 膽鹽羥化酶活性實(shí)驗(yàn)

在100 mL YPD培養(yǎng)基中加入0.5 g牛黃脫氧膽酸鈉，高壓滅菌121℃，20min，倒入培養(yǎng)皿。魯氏接合酵母接種在培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍是否存在白色沉淀。

1.4.4 溶血性實(shí)驗(yàn)

魯氏接合酵母涂布在血平板培養(yǎng)基上,待吸收完全,30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

1.4.5 耐藥性實(shí)驗(yàn)

藥敏實(shí)驗(yàn)：采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法[18]進(jìn)行測(cè)定。

師：我們看出，有些立體圖形的表面包含著一些平面圖形．反之，我們也可以利用這些平面圖形來描述立體圖形．請(qǐng)觀察手中的四棱錐模型，描述四棱錐的特征．

最低抑菌濃度測(cè)定：參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS)藥敏實(shí)驗(yàn)方法[19-20]。

1.5 分析方法

利用SIMCA 14.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；Origin作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魯氏接合酵母代謝產(chǎn)物分析

2.1.1 揮發(fā)性代謝物的測(cè)定

魯氏接合酵母是醇香型酵母,同時(shí)也能產(chǎn)生多種酯類、酸類物質(zhì),在醬油發(fā)酵中對(duì)于風(fēng)味物質(zhì)的形成有很大的貢獻(xiàn)[21]。由圖1可知醇類物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而明顯增加。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)揮發(fā)性代謝物組成圖Fig.1 Composition of volatile metabolites at different time points

從物質(zhì)種類的變化上可以看出,與空白對(duì)照相比較,在發(fā)酵過程中酯類物質(zhì)逐漸增加,其中在發(fā)酵30 d左右增加最多,可能是由于乙醇的大量產(chǎn)生促進(jìn)酯類物質(zhì)生成。發(fā)酵30 d后,醇類和酯類物質(zhì)成為主要揮發(fā)性物質(zhì),主要包括苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等,這些物質(zhì)在醬油風(fēng)味組成上具有重要地位[22-23]；其他酮、醛類物質(zhì)含量在發(fā)酵過程中逐漸減少。在揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析中未檢測(cè)出有害代謝物,檢測(cè)出的醇、酸、酯、呋喃、吡嗪等物質(zhì)對(duì)醬油的風(fēng)味起到至關(guān)重要的作用。

由圖2可知，前20 d代謝物主要分布在第二象限,主要代謝物有二甲基吡嗪、苯乙醛、2,3-丁二酮等,后30 d主要分布在第一象限,主要代謝物有3-甲基-1-丁醇、乙酸異戊酯等,表明在發(fā)酵過程中不同時(shí)間段的代謝物有明顯差異。

圖2 不同時(shí)間段揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析Fig.2 PCA analysis of volatile substances in different time periods

2.1.2 非揮發(fā)性代謝物分析

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)非揮發(fā)性代謝物組成圖Fig.3 Composition of non-volatile metabolites at different time points

由圖4可知,不同時(shí)間段的非揮發(fā)代謝產(chǎn)物分布在不同象限,表明魯氏接合酵母在醬醪汁中的代謝產(chǎn)物在不同時(shí)間段存在明顯的差異。與空白對(duì)照相比，魯氏酵母在醬汁發(fā)酵過程中會(huì)出現(xiàn)更多的中間代謝產(chǎn)物,樣品中的非揮發(fā)性酸類物質(zhì)除了氨基酸,還檢測(cè)到其他酸類,包括多元酸、脂肪酸、糖酸、羥基酸等。在發(fā)酵過程中,最主要的非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為糖類、酯類、醇類和其他酸類。

圖4 不同時(shí)間段非揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析Fig.4 Principal component analysis of volatile substances in different time periods

2.2 膽鹽羥化酶活性檢測(cè)

膽鹽羥化酶能夠水解介質(zhì)中結(jié)合態(tài)的膽鹽生成非結(jié)合態(tài)膽酸。微生物的代謝活動(dòng)能影響膽汁池中初級(jí)和次級(jí)膽汁鹽的比例,其直接作用就是通過膽鹽羥化酶的活性來影響的,間接作用是通過影響膽汁鹽的溶解度,所以對(duì)于腸道微生物要盡量使早期解離發(fā)生在大腸,避免腸肝循環(huán)發(fā)生紊亂，同時(shí)避免小腸的早期解離[24-25]。本實(shí)驗(yàn)以空白的YPD培養(yǎng)基作為陽性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。在含有5 g/mL牛黃脫氧膽酸鈉的YPD培養(yǎng)基上單菌落周圍沒有出現(xiàn)白色沉淀,說明魯氏接合酵母不產(chǎn)生膽鹽羥化酶。

a-含5 g/mL牛黃脫氧膽酸鈉的YPD培養(yǎng)單菌落; b-YPD培養(yǎng)單菌落圖5 含5 g/mL牛黃脫氧膽酸鈉的YPD培養(yǎng)基、 空白YPD培養(yǎng)基Fig.5 YPD medium containing 5 g/mL sodium bezoar deoxycholic acid and blank YPD medium

2.3 溶血實(shí)驗(yàn)

溶血是指紅細(xì)胞破裂溶解現(xiàn)象,可由多種理化因素和毒素引起。如果發(fā)酵食品所用微生物具有溶血現(xiàn)象,會(huì)對(duì)人體造成一定危害。本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌作為陽性對(duì)照,由圖6可知,魯氏接合酵母在血瓊脂平板培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)且菌株周圍的瓊脂未顯示綠色亦未出現(xiàn)透明圈,表明沒有產(chǎn)生α、β溶血現(xiàn)象,說明魯氏接合酵母不是溶血性菌株。

a-金黃色葡萄球菌血平板; b-魯氏接合酵母血平板圖6 血平板實(shí)驗(yàn)Fig.6 Blood plate test

2.4 耐藥性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 藥敏實(shí)驗(yàn)

魯氏接合酵母菌對(duì)5種常用抗生素的敏感性如表1所示。魯氏接合酵母對(duì)伏立康唑、酮康唑、制霉菌素、兩性霉素B四種基本抗生素敏感；對(duì)氟康唑存在劑量依賴性,但劑量依賴性并不代表菌株對(duì)藥物具有抗性。

表1 魯氏接合酵母藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of Z.rouxii yeast drug sensitivity test

藥敏實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便,但受多種因素的影響只能用于初步篩選敏感菌,對(duì)于抑菌圈直徑<14 mm的菌株應(yīng)進(jìn)一步用微量稀釋法或Etest法測(cè)定其最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)[26-27]。亦有文獻(xiàn)指出釀酒酵母對(duì)氟康唑有一定劑量抗性,并進(jìn)一步用酵母菌稀釋法藥物敏感實(shí)驗(yàn)測(cè)其MIC為2 μg/mL[28]。

2.4.2 確定最低抑菌濃度

酵母菌稀釋法藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果在判讀時(shí)依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) M27-A3[29],唑類藥物MIC值與陽性對(duì)照相比較應(yīng)抑制80% 的真菌的生長(zhǎng),兩性霉素B則需要達(dá)到100%的生長(zhǎng)抑制,其中NCCLS藥物耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)為兩性霉素B的MIC>4 μg/mL、氟康唑的MIC>64 μg/mL。由圖7可知,當(dāng)兩性霉素β和氟康唑質(zhì)量濃度分別為2 μg/mL和8 μg/mL時(shí),魯氏接合酵母的抑制率分別達(dá)到100%和80%,其中氟康唑的質(zhì)量濃度范圍為0.031～8 μg/mL,兩性霉素B為0.015～2 μg/mL。與釀酒酵母相比，魯氏接合酵母雖然對(duì)氟康唑的MIC高于釀酒酵母,但都低于NCCLS藥物耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)。

圖7 發(fā)酵液在不同濃度抗生素下的吸光度值Fig.7 Absorption of fermentation broth at different concentrations of antibiotics

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油常用菌株魯氏接合酵母的安全性進(jìn)行了初步探究,通過代謝分析和指標(biāo)分析,在代謝產(chǎn)物中未檢測(cè)出有害代謝物,并顯示魯氏接合酵母是典型的醇香型酵母,能夠代謝出大量的醇類物質(zhì),對(duì)醬油的風(fēng)味成分起到至關(guān)重要的作用。在含有5%的膽鹽羥化酶的YPD培養(yǎng)基上魯氏接合酵母菌落周圍未出現(xiàn)白色沉淀,說明魯氏酵母不產(chǎn)生膽鹽羥化酶；魯氏酵母在血平板上正常生長(zhǎng)且未發(fā)生溶血現(xiàn)象,說明魯氏酵母不是溶血性菌株；初步確定了魯氏酵母對(duì)伏立康唑、酮康唑、制霉菌素、兩性霉素B四種基本抗生素敏感,對(duì)氟康唑具有劑量依賴性,同時(shí)進(jìn)一步確定了兩性霉素B對(duì)魯氏酵母的MIC≤2 μg/mL,量控范圍為0.015～2 μg/mL,氟康唑?qū)︳斒辖湍傅腗IC≤8 μg/mL,量控范圍為0.031～8 μg/mL。本研究為進(jìn)一步探究魯氏酵母的安全性奠定了基礎(chǔ),也為傳統(tǒng)菌株的安全性提供了一定的理論依據(jù)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其安全性進(jìn)行探究,從而為其在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的應(yīng)用安全性提供更加科學(xué)全面的理論依據(jù)。