醬油發酵用菌魯氏接合酵母的安全性

劉爽,張倩,杜船,周韜,趙佳豪,石磊,王春玲*

1(天津科技大學 食品科學與工程學院,天津,300000)2(天津市利民調料有限公司,天津,300000)

醬油釀造工藝主要有低鹽固態和高鹽稀態兩種[1-2]。高鹽稀態醬油由于發酵周期較長,成品醬香醇厚,其產品品質優于低鹽固態發酵醬油[3-5]。一般參與高鹽稀態醬油釀造的微生物主要有米曲霉、酵母菌和乳酸菌3大類[6-8]。米曲霉最直接的作用就是在醬油發酵過程中分泌大量酶系,對原料中的蛋白質分解具有重要作用,我國目前醬油生產常用的菌株是滬釀3.042[9-10]。在醬醪發酵階段,魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)是主要的產醇酵母菌,球擬酵母(Torulopsishalophilus)[11-12]是主要的產酯酵母菌。將魯氏接合酵母應用于醬油發酵過程中能增加醬油的醇香,對醬油風味的形成起著重要的作用。

魯氏接合酵母具有較強的耐鹽能力,是醬油發酵過程中醇類物質的主要代謝者,在代謝產生大量的高級醇、芳香雜醇類物質的同時,還能將糖類物質轉化為多元醇和糖醇類物質[13-14]。HAUCK等[15]研究顯示魯氏接合酵母代謝產生的乙醇、高級醇等物質對醬油的風味起到至關重要的作用。

雖然魯氏接合酵母作為傳統菌種用于醬油發酵已有較長的歷史,但對于魯氏接合酵母自身的安全性研究卻涉及較少,本研究通過探討菌種在醬醪汁發酵中的代謝產物、膽鹽羥化酶活性檢測、溶血實驗及耐藥性實驗對菌種本身的安全性進行初步探討,從而為傳統發酵菌株的安全性研究提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 實驗原料與培養基

氟康唑、兩性霉素B、甲氧胺-吡啶、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA)、甲醇、NaCl,北京索萊寶科技有限公司；牛黃脫氧膽酸鈉,上海吉至生化科技有限公司；伏立康唑藥敏紙片、酮康唑藥敏紙片、酮康唑藥敏紙片,北京普納科技有限公司；制霉菌素藥敏紙片、兩性霉素B藥敏紙片,杭州微生物試劑有限公司；所用培養基為酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrase,YPD)液體培養基、YPD瓊脂培養基和血瓊脂平板培養基。

1.2 菌種來源

魯氏接合酵母購自中國微生物菌種保藏中心,菌種編號為2.181,現由天津科技大學食品營養與安全國家重點實驗室菌種保藏中心存放。

1.3 儀器設備

GCMS-QP 2010 Ultra氣相色譜-質譜聯用儀,日本島津公司；MULTISKAN GO酶標儀,美瑞泰克科技(天津)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 揮發性代謝物的測定分析

采用固相微萃取-氣質聯用的方法[16]。

1.4.2 非揮發性代謝物的測定分析

采用硅烷化-氣質聯用的方法[17]。

1.4.3 膽鹽羥化酶活性實驗

在100 mL YPD培養基中加入0.5 g牛黃脫氧膽酸鈉，高壓滅菌121℃，20min，倒入培養皿。魯氏接合酵母接種在培養基上，30 ℃培養48 h，觀察菌落周圍是否存在白色沉淀。

1.4.4 溶血性實驗

魯氏接合酵母涂布在血平板培養基上,待吸收完全,30 ℃培養48 h,觀察是否出現溶血現象。

1.4.5 耐藥性實驗

藥敏實驗：采用藥敏紙片瓊脂擴散法[18]進行測定。

師：我們看出，有些立體圖形的表面包含著一些平面圖形．反之，我們也可以利用這些平面圖形來描述立體圖形．請觀察手中的四棱錐模型，描述四棱錐的特征．

最低抑菌濃度測定：參照美國臨床實驗室標準化委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS)藥敏實驗方法[19-20]。

1.5 分析方法

利用SIMCA 14.1對數據進行分析；Origin作圖分析。

2 結果與分析

2.1 魯氏接合酵母代謝產物分析

2.1.1 揮發性代謝物的測定

魯氏接合酵母是醇香型酵母,同時也能產生多種酯類、酸類物質,在醬油發酵中對于風味物質的形成有很大的貢獻[21]。由圖1可知醇類物質隨著發酵時間的增加而明顯增加。

圖1 不同時間點揮發性代謝物組成圖Fig.1 Composition of volatile metabolites at different time points

從物質種類的變化上可以看出,與空白對照相比較,在發酵過程中酯類物質逐漸增加,其中在發酵30 d左右增加最多,可能是由于乙醇的大量產生促進酯類物質生成。發酵30 d后,醇類和酯類物質成為主要揮發性物質,主要包括苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等,這些物質在醬油風味組成上具有重要地位[22-23]；其他酮、醛類物質含量在發酵過程中逐漸減少。在揮發性代謝產物分析中未檢測出有害代謝物,檢測出的醇、酸、酯、呋喃、吡嗪等物質對醬油的風味起到至關重要的作用。

由圖2可知，前20 d代謝物主要分布在第二象限,主要代謝物有二甲基吡嗪、苯乙醛、2,3-丁二酮等,后30 d主要分布在第一象限,主要代謝物有3-甲基-1-丁醇、乙酸異戊酯等,表明在發酵過程中不同時間段的代謝物有明顯差異。

圖2 不同時間段揮發性物質主成分分析Fig.2 PCA analysis of volatile substances in different time periods

2.1.2 非揮發性代謝物分析

圖3 不同時間點非揮發性代謝物組成圖Fig.3 Composition of non-volatile metabolites at different time points

由圖4可知,不同時間段的非揮發代謝產物分布在不同象限,表明魯氏接合酵母在醬醪汁中的代謝產物在不同時間段存在明顯的差異。與空白對照相比，魯氏酵母在醬汁發酵過程中會出現更多的中間代謝產物,樣品中的非揮發性酸類物質除了氨基酸,還檢測到其他酸類,包括多元酸、脂肪酸、糖酸、羥基酸等。在發酵過程中,最主要的非揮發性風味物質主要為糖類、酯類、醇類和其他酸類。

圖4 不同時間段非揮發性物質主成分分析Fig.4 Principal component analysis of volatile substances in different time periods

2.2 膽鹽羥化酶活性檢測

膽鹽羥化酶能夠水解介質中結合態的膽鹽生成非結合態膽酸。微生物的代謝活動能影響膽汁池中初級和次級膽汁鹽的比例,其直接作用就是通過膽鹽羥化酶的活性來影響的,間接作用是通過影響膽汁鹽的溶解度,所以對于腸道微生物要盡量使早期解離發生在大腸,避免腸肝循環發生紊亂，同時避免小腸的早期解離[24-25]。本實驗以空白的YPD培養基作為陽性對照,實驗結果如圖5所示。在含有5 g/mL牛黃脫氧膽酸鈉的YPD培養基上單菌落周圍沒有出現白色沉淀,說明魯氏接合酵母不產生膽鹽羥化酶。

a-含5 g/mL牛黃脫氧膽酸鈉的YPD培養單菌落; b-YPD培養單菌落圖5 含5 g/mL牛黃脫氧膽酸鈉的YPD培養基、 空白YPD培養基Fig.5 YPD medium containing 5 g/mL sodium bezoar deoxycholic acid and blank YPD medium

2.3 溶血實驗

溶血是指紅細胞破裂溶解現象,可由多種理化因素和毒素引起。如果發酵食品所用微生物具有溶血現象,會對人體造成一定危害。本實驗以金黃色葡萄球菌作為陽性對照,由圖6可知,魯氏接合酵母在血瓊脂平板培養基上正常生長且菌株周圍的瓊脂未顯示綠色亦未出現透明圈,表明沒有產生α、β溶血現象,說明魯氏接合酵母不是溶血性菌株。

a-金黃色葡萄球菌血平板; b-魯氏接合酵母血平板圖6 血平板實驗Fig.6 Blood plate test

2.4 耐藥性實驗

2.4.1 藥敏實驗

魯氏接合酵母菌對5種常用抗生素的敏感性如表1所示。魯氏接合酵母對伏立康唑、酮康唑、制霉菌素、兩性霉素B四種基本抗生素敏感；對氟康唑存在劑量依賴性,但劑量依賴性并不代表菌株對藥物具有抗性。

表1 魯氏接合酵母藥敏實驗結果Table 1 Results of Z.rouxii yeast drug sensitivity test

藥敏實驗簡便,但受多種因素的影響只能用于初步篩選敏感菌,對于抑菌圈直徑<14 mm的菌株應進一步用微量稀釋法或Etest法測定其最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)[26-27]。亦有文獻指出釀酒酵母對氟康唑有一定劑量抗性,并進一步用酵母菌稀釋法藥物敏感實驗測其MIC為2 μg/mL[28]。

2.4.2 確定最低抑菌濃度

酵母菌稀釋法藥物敏感實驗結果在判讀時依據美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) M27-A3[29],唑類藥物MIC值與陽性對照相比較應抑制80% 的真菌的生長,兩性霉素B則需要達到100%的生長抑制,其中NCCLS藥物耐藥判斷標準為兩性霉素B的MIC>4 μg/mL、氟康唑的MIC>64 μg/mL。由圖7可知,當兩性霉素β和氟康唑質量濃度分別為2 μg/mL和8 μg/mL時,魯氏接合酵母的抑制率分別達到100%和80%,其中氟康唑的質量濃度范圍為0.031～8 μg/mL,兩性霉素B為0.015～2 μg/mL。與釀酒酵母相比，魯氏接合酵母雖然對氟康唑的MIC高于釀酒酵母,但都低于NCCLS藥物耐藥判斷標準。

圖7 發酵液在不同濃度抗生素下的吸光度值Fig.7 Absorption of fermentation broth at different concentrations of antibiotics

3 結論

本實驗對傳統發酵醬油常用菌株魯氏接合酵母的安全性進行了初步探究,通過代謝分析和指標分析,在代謝產物中未檢測出有害代謝物,并顯示魯氏接合酵母是典型的醇香型酵母,能夠代謝出大量的醇類物質,對醬油的風味成分起到至關重要的作用。在含有5%的膽鹽羥化酶的YPD培養基上魯氏接合酵母菌落周圍未出現白色沉淀,說明魯氏酵母不產生膽鹽羥化酶；魯氏酵母在血平板上正常生長且未發生溶血現象,說明魯氏酵母不是溶血性菌株；初步確定了魯氏酵母對伏立康唑、酮康唑、制霉菌素、兩性霉素B四種基本抗生素敏感,對氟康唑具有劑量依賴性,同時進一步確定了兩性霉素B對魯氏酵母的MIC≤2 μg/mL,量控范圍為0.015～2 μg/mL,氟康唑對魯氏酵母的MIC≤8 μg/mL,量控范圍為0.031～8 μg/mL。本研究為進一步探究魯氏酵母的安全性奠定了基礎,也為傳統菌株的安全性提供了一定的理論依據。在后續實驗中將進一步通過動物實驗對其安全性進行探究,從而為其在傳統發酵食品中的應用安全性提供更加科學全面的理論依據。