不同蛋白酶制備藜麥麩皮多肽及其活性研究

林冰潔,薛鵬,2,荊金金,張若愚,季曉迎,韓彩靜,2*,張豐香,2*

1(濰坊醫學院 公共衛生學院,山東 濰坊,261053)2(濰坊市食品營養與安全重點實驗室,山東 濰坊,261053)

藜麥是1年生藜科雙子葉植物,富含蛋白質、膳食纖維、礦物質、維生素以及多酚、黃酮、皂苷等植物化學成分，被國際營養學家譽為“超級谷物”、“營養黃金”和“未來食品”[1]。長期食用具有增強耐力、降血糖、降血脂、抗腫瘤和預防心血管疾病等功效[2]。近年來,藜麥的生物活性逐漸成為研究的熱點,而藜麥蛋白及其多肽的生物活性是研究熱點之一。

藜麥多肽具有抗氧化、降血糖、降血脂、降血壓和抗癌等活性[3]。范三紅等[4]用堿性蛋白酶和風味蛋白酶對藜麥糠進行酶解,利用超濾技術分離純化藜麥糠抗氧化肽,表明分子質量為5 k～10 ku 的抗氧化肽較其他分子質量的抗氧化活性好。NONGONIERMA等[5]采用木瓜蛋白酶對藜麥蛋白進行酶解得到具有降血糖活性的肽。葉凱等[6]用胰蛋白酶酶解得到的藜麥多肽對α-淀粉酶抑制率最好(45.54%),可作為糖尿病患者的藥用添加劑。VILCACUNDO等[7]研究發現了17種藜麥多肽具有較高的抗癌能力并對3種不同細胞(Caco-2、HT-29、HCT-116)抑制率進行測定,當肽分子質量>5 ku時對結腸癌的抑制率明顯高于其他肽分子質量。REN等[8]分離到的藜麥lunasin肽,在質量濃度為0.4 g/L時對NO、TNF-α和Interlenukin-6的抑制率分別為44.77%、39.81%和33.50%,具有較強的體外消炎能力。ALUKO等[9]用堿性蛋白酶酶解藜麥蛋白，經超濾膜過濾得到IC50值分別為0.075、0.015和0.030 mg/mL的多肽,均表明藜麥多肽具有降血壓活性。

藜麥的食用過程與小麥等類似,加工過程會產生大量麩皮,其富含蛋白且營養豐富,但都作為飼料或被丟棄,沒有被深入的開發利用,造成極大浪費[10]。目前,藜麥蛋白多肽的提取工藝多采用堿溶酸沉法提取蛋白,然后進行酶水解[5]。本研究采用2次醇沉工藝可同時得到多糖和多肽,提高了藜麥麩皮的利用率。本文以第一次醇沉得到的粗蛋白為原料,研究了不同蛋白酶對所提藜麥麩皮蛋白的酶解能力以及經不同蛋白酶酶解后多肽的活性,為藜麥麩皮的開發提供理論依據,也為后續探討藜麥麩皮多肽的活性奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

藜麥麩皮,山西省靜樂縣山西億隆；牛血清蛋白、菲咯嗪(ferrozine)、酪氨酸酶、α-葡萄糖苷酶、多巴(levodopa,L-DOPA)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),Sigma 公司；中性蛋白酶Neutrase 1.5 MG、風味蛋白酶Flavourzyme 500 MG、堿性蛋白酶Alcalase 3.0 T、復合蛋白酶Protamex,諾維信生物技術有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、4-硝基苯基-α-D-呲喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,PNPG)、阿卡波糖、抗壞血酸,北京索萊寶科技有限公司；福林酚試劑,國藥集團化學試劑有限公司,其余試劑均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

臺式冷凍離心機(3-16KL),德國 Sigma 公司；數控超聲波清洗器(KQ-500DE),昆山市超聲儀器有限公司；自動凱氏定氮儀(K9840),濟南海能儀器股份有限公司；臺式酸度計(FE28),梅特勒-托利多集團；電熱恒溫鼓風干燥箱(K101-1BS),上海躍進醫療器械有限公司；紫外可見分光光度計(UV-5100B),上海元析儀器有限公司；旋轉蒸發儀(SB-1300),日本EYELA 公司；酶標儀(Thermo1510),美國賽默飛世爾科技公司；冷凍干燥機(FDU-2110),日本EYELA 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藜麥麩皮多肽制備工藝流程

藜麥麩皮蛋白多肽的提取按照圖1進行。

圖1 藜麥麩皮多肽制備工藝流程圖Fig.1 Process flow chart for preparation of quinoa husk peptides

1.3.2 藜麥麩皮蛋白分子質量的分布及氨基酸組成測定

稱取30 g藜麥麩皮于燒杯中,按照料液比1∶15(g∶mL)加入蒸餾水,超聲45 min后于4 000 r/min離心10 min,收集上清液旋蒸后加入無水乙醇溶液,使混合液乙醇的體積分數在75%～80%維持30 min以除去小分子物質,5 000 r/min離心30 min取沉淀,乙醇揮發后根據下列方法測定蛋白質的氨基酸組成和分子質量分布。

氨基酸測定：根據 GB 5009.124—2016 《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》。

分子質量分布：參考姜燕蓉等[11]的方法對藜麥麩皮蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SPS-PAGE)測定。

1.3.3 藜麥麩皮多肽的制備

取1.3.2小節的沉淀按照料液比為1∶10(g∶mL)的比例加入蒸餾水,攪拌均勻后用0.05 mol/L NaOH溶液調節pH值至酶最適pH后,加入蛋白酶[E]/[S](3 000 U/g),在最適條件(表1)下酶解3 h,期間用0.05 mol/L NaOH溶液維持反應體系的pH。

表1 藜麥麩皮蛋白酶解工藝參數Table 1 Technological parameters of enzymatic hydrolysis of quinoa husk protein

將酶解液旋蒸濃縮后加入無水乙醇溶液,使乙醇的體積分數在75%～80%并靜置30 min后,5 000 r/min下離心30 min取上清液,旋蒸濃縮后冷凍干燥獲得粗多肽粉末。

1.3.4 蛋白水解度的測定

在中性及堿性條件下采用 pH-stat 法計算蛋白水解度[12]。

1.3.5 肽得率的計算

多肽含量測定方法采用福林酚法,蛋白質含量根據 GB/T 5009.5—2016 中的凱氏定氮法測定。藜麥麩皮多肽得率按公式(1)計算：

(1)

1.4 多肽活性測定

將上述粗多肽采用DA201-C大孔吸附樹脂脫鹽后,用體積分數為80%的乙醇洗脫,除去乙醇,冷凍干燥,用于活性測定。

1.4.1 多肽α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

參照沈佳奇等[13]的方法,稍作調整。實驗分為空白、對照、樣品空白和樣品組,在96孔板中依次加入PBS緩沖液、抑制劑溶液和2.5 mmol/L PNPG底物溶液,充分混合后于37 ℃水浴10 min,取出96孔板在樣品組中加入0.3 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液充分混勻后于37 ℃水浴20 min,然后加150 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,每組試驗做3個平行。用酶標儀測量405 nm處的吸光度值,根據公式(2)計算各樣品的α-葡萄糖苷酶抑制率:

(2)

式中：AC,對照組；AB,空白組；AS,樣品組；ASB,樣品空白組。

1.4.2 酪氨酸酶抑制率的測定

稱量不同蛋白酶酶解的多肽并配制成1、5、10和20 mg/mL的樣品溶液。按表2的劑量在96孔板中依次加入藥品,最后加入酪氨酸酶溶液,搖勻,置于25 ℃恒溫反應20 min[14]。用酶標儀測量475 nm處的吸光度值,以抗壞血酸為陽性對照,每組試驗3個平行,按照按公式(3)計算酪氨酸酶抑制率：

(3)

表2 反應物添加劑量 單位：μL

1.4.3 Fe2+螯合率的測定

根據DECKER等[15]的方法改進。取1 mL樣品溶液于試管,滴加0.05 mL 2 mmol/L FeCl2溶液并用蒸餾水定容至1.90 mL,混合均勻后,再滴加0.1 mL 5 mmol/L菲咯嗪試劑,充分振蕩混合后室溫靜置10 min,于波長562 nm處測定吸光度,每組試驗3個平行。Fe2+螯合率按公式(4)計算：

(4)

1.4.4 DPPH 自由基清除率的測定

DPPH 自由基清除率的測定方法參照文獻[16]。

1.5 數據處理

每組試驗設置 3 次平行,數據表示為平均值±標準偏差,利用t檢驗進行組間差異比較,P<0.05 為差異顯著,P<0.01 為差異極顯著,采用GraphPad Prism 8.0等軟件進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 藜麥麩皮蛋白分子質量分布

對多肽提取工藝中第一次醇沉的蛋白通過12%的SDS-PAGE 凝膠電泳分析,如圖2所示。藜麥麩皮蛋白電泳圖譜共分離出3條蛋白亞基帶,根據位移標準曲線計算可知條帶主要分布在22.8 k、39.1 k、52.7 kDa。RUIZ等[17]采用堿溶酸沉法對藜麥種子進行蛋白提取,測定在不同堿性條件下提取的蛋白分子質量分布,主要條帶為6 k、33 k、38和50 kDa。在堿溶酸沉提取中,隨著提取pH值增加,高、中分子質量的蛋白質條帶會較暗,因其在較高提取pH值下,蛋白質被水解成較低分子質量的蛋白,并通過增加的疏水相互作用和分子間二硫鍵結合成不溶性聚集體,這些聚集體在進行電泳前通過離心去除,低分子質量的蛋白會更容易被提取[18]。藜麥分離出的蛋白主要由11S球蛋白和2S白蛋白(分子質量主要由8 k～9 kDa的多肽組成),本研究在提取蛋白時沒有采用堿溶酸沉法并未在較高pH值條件下提取,因此分離出來的主要是11S球蛋白,不存在較低分子質量的蛋白。

M-標準蛋白；S-藜麥麩皮蛋白圖2 藜麥麩皮蛋白電泳圖Fig.2 Electrophoretic map of quinoa husk protein

2.2 藜麥麩皮蛋白氨基酸組成

從營養學角度看,食物中蛋白質的質量與其所含有氨基酸的種類和含量有關。由表3可知,藜麥麩皮蛋白中必須氨基酸占35.17%,接近FAO/WHO標準規定的40%,因此藜麥蛋白可為氨基酸比例均衡的理想蛋白。

表3 藜麥麩皮蛋白氨基酸組成 單位：g/100 g

相關研究表明,從蛋白質中提取出的疏水性氨基酸的含量,氨基酸組成和肽序列中獨特的氨基酸位置對生物活性有很大影響。疏水性氨基酸殘基位于細胞間和C端,對抗氧化活性有重要影響且含有大量疏水氨基酸的多肽具有較強的ACE抑制活性[19]。除此之外,疏水性氨基酸殘基(如丙氨酸)還可提高酪氨酸酶抑制活性,并且丙氨酸還顯示出阻斷黑素生成的能力。含硫氨基酸(Met、Cys)還可以促進機體和腸道黏膜的生長發育,并增強腸道對營養物質的吸收。由表3可知,疏水性氨基酸占總氨基酸比例約1/3,含量較高,因此可以推斷藜麥麩皮蛋白具有多種生物活性。

2.3 不同蛋白酶對藜麥麩皮蛋白的水解

將藜麥麩皮蛋白溶液分別用堿性蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶按照表1的條件進行水解,酶與底物濃度比[E]/[S](3 000 U/g),酶解時間均為3 h。在酶解過程中水解度至關重要,因其反映蛋白質對底物的酶解能力,包括游離氨基酸和所得肽的分子質量。不同蛋白酶對藜麥麩皮蛋白的水解度如圖3所示,總的來說,隨著酶解時間增加,水解度增加。在所有蛋白酶中,堿性蛋白酶的水解程度最好,在120 min時水解度達到13%,其次為中性蛋白酶,復合蛋白酶和風味蛋白酶水解度基本一致。

圖3 不同蛋白酶的水解進程Fig.3 Hydrolysis process of different proteases

水解度越大,酶解越徹底,水解物中所含的小分子蛋白越多,多肽提取率就越高。由圖4可知,堿性蛋白酶酶解后的多肽得率達到88.88%,幾乎可以將蛋白全部水解,其水解度高于其余3種蛋白酶(圖3)。不同蛋白酶酶解蛋白的作用位點不同,堿性蛋白酶Alcalase 3.0T屬于外源酶,對羧端水性氨基酸的酶解有較強專一性,可水解藜麥麩皮蛋白中的Glu、Met、Leu、Tyr、Lys的羧端肽鍵[20]。藜麥麩皮蛋白中含有較高的谷氨酸(表3),因此堿性蛋白酶酶解徹底,可獲得大量多肽。

圖4 不同蛋白酶酶解產物的肽得率Fig.4 Peptide yield of hydrolyzed products of different proteases

2.4 多肽對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

α-葡萄糖苷酶是糖尿病發病的主要因素,是胰島素功能精細調節的關鍵酶,是延緩葡萄糖吸收和抑制餐后高血糖的靶點。因此,抑制α-葡萄糖苷酶活性是治療糖尿病的關鍵。臨床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖、伏格列糖和米格列醇,但會產生一些副作用(如腸胃脹氣、胃痛、腹瀉和肝損傷)[21]。因此,需要尋找更安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

由圖5可知,阿卡波糖隨質量濃度增加抑制作用雖不明顯,但效果很好。4種多肽在10 mg/mL和20 mg/mL質量濃度下,與陽性對照組比均有極顯著差異。4種多肽均對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，隨著質量濃度增大抑制作用增強。堿性蛋白酶肽、中性蛋白酶肽、復合蛋白酶肽和風味蛋白酶肽在10 mg/mL時抑制率分別為17.72%、22.01%、16.22%和40.48%,而在20 mg/mL時抑制率均有提高，分別為33.30%、32.45%、39.19%和81.67%,其中風味蛋白酶水解的多肽抑制效果較其他蛋白酶明顯增強且隨著質量濃度的增大抑制率增幅最大。因此可選擇風味蛋白酶肽制作α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖5 多肽對α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.5 Inhibition rate of polypeptides on α-glucosidase注：**與陽性對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)

2.5 多肽對酪氨酸酶的抑制率

酪氨酸酶是黑色素產生的關鍵酶,控制著黑素的形成過程,其活性程度對色素的沉積起主要作用。黑色素水平的增加會導致蔬菜、水果和人體皮膚的色素沉著障礙,如黃褐斑、雀斑、老年斑和惡性黑色素瘤。因此,開發和篩選有效的酪氨酸酶抑制劑在近幾年備受關注[22]。

本實驗中,測定了4種蛋白酶肽對酪氨酸酶活性的抑制作用。由圖6可知,抗壞血酸對酪氨酸酶抑制作用隨著質量濃度增大而增強。堿性蛋白酶肽、中性蛋白酶肽、復合蛋白酶肽對酪氨酸酶的抑制性也隨濃度增大而增強,而風味蛋白酶肽隨質量濃度增加增幅不明顯,基本維持在30%左右。在20 mg/mL時,除風味蛋白酶肽外其他多肽與陽性對照組無顯著性差異,說明堿性蛋白酶肽、中性蛋白酶肽、復合蛋白酶肽在最高質量濃度20 mg/mL與陽性對照組抑制效果接近。

圖6 多肽對酪氨酸酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of polypeptides on tyrosinase注：**與陽性對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)

2.6 多肽與Fe2+的螯合率

鐵是人體營養中必不可少的元素,可以通過鹽、金屬螯合劑和鐵螯合肽的形式提供。然而,金屬鹽由于其生物利用度低、吸附性差、穩定性差等特點,正在被替代。目前,許多研究表明,鐵螯合肽由于在提高生物利用度、吸收和穩定性方面的優勢,可望被用作鐵營養補充劑[23]。由圖7可知,堿性蛋白酶肽和中性蛋白酶肽與Fe2+螯合率均隨濃度增加而增強,在較高質量濃度(10和20 mg/mL)時,抑制率均大于60%。

圖7 多肽與Fe2+的螯合率Fig.7 Chelating rate of peptides with Fe2+

復合蛋白酶肽和風味蛋白酶肽與Fe2+螯合率隨質量濃度增加而減弱,復合蛋白酶肽在10 mg/mL螯合率達到最大值(66.10%),風味蛋白酶肽在各個質量濃度下與Fe2+螯合率均能達到80%以上,說明風味蛋白酶肽具有較好的Fe2+螯合能力,因此可以用風味蛋白酶酶解后的多肽制作鐵營養補充劑。

2.7 多肽對DPPH自由基的清除效果

由圖8可知,經4種蛋白酶水解后的多肽對DPPH 自由基的清除能力隨著質量濃度的升高而增大。在10 mg/mL時,中性蛋白酶酶解后的多肽對DPPH清除率達到85%,與陽性對照相比,中性蛋白酶肽和風味蛋白酶肽的清除能力較強,其余兩種蛋白酶酶解肽的清除能力較弱。

圖8 多肽對DPPH 自由基清除能力的影響Fig.8 Effect of polypeptides on scavenging ability of DPPH free radicals注：**與陽性對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)；*與陽性對照組相比具有顯著差異(P<0.05)

3 結論

本文以藜麥麩皮為原料,先采用體積分數為75%～80%的醇沉淀出大分子蛋白,經4種蛋白酶水解后,再用體積分數為75%～80%的醇沉淀法除去多糖和未水解的大分子蛋白,得到多肽,其中堿性蛋白酶對藜麥麩皮蛋白的酶解能力較強,多肽得率最高。經測定,4種蛋白酶酶解的多肽都具有良好的Fe2+螯合能力,中性蛋白酶酶解的多肽對DPPH自由基具有較強的清除能力,并隨著多肽質量濃度的增加而增加,風味蛋白酶肽和堿性蛋白酶肽分別對α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶具有較高的抑制率。本研究結果揭示了藜麥麩皮蛋白被不同蛋白酶酶解后,多肽所具有的活性程度不同,為后續研究多肽活性奠定了基礎。