基于核酸適配體結(jié)合納米金模擬酶用于單增李斯特菌的快速檢測

陳威風(fēng),陳薇,蔡穎,崔麗偉,郝修震*,王小紅

1(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院,河南 鄭州,450046) 2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢,430070)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)是一種能夠引起人類、家畜共患病的食源性致病菌，具有較強(qiáng)的致病性并廣泛分布于人類生存環(huán)境中,如土壤、植物、水、乳制品、肉制品、蔬菜制品等。免疫力低下人群(嬰幼兒、孕婦、中老年人)容易接觸并感染,進(jìn)而引起嘔吐、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)、敗血病等癥狀,致死率高達(dá)30%[1-3]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在較低的溫度下也能正常生長,從而增加了感染食品的機(jī)會,其危害對于冷凍食品而言較為突出[4-5]。單增李斯特菌可形成生物膜,在食品加工設(shè)施表面定居,也能在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中生存。此外,土壤中的單增李斯特菌是一種腐生菌,以腐爛的有機(jī)物為食,同時也增加了果蔬污染的風(fēng)險[6]。

目前,我國食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測主要采用分離和培養(yǎng)方法,并結(jié)合相關(guān)的顯色介質(zhì),但存在操作復(fù)雜,實驗周期長等問題[7]。近年來,基于抗體的免疫學(xué)方法[8-9]、PCR[10-11]、LAMP[12-13]和分析MIC模式的VITEK2系統(tǒng)[14]方法等已經(jīng)建立,但都具有局限性。抗體、ELISA試劑盒和RT-PCR試劑昂貴,缺乏成本效益,而VITEK2系統(tǒng)既復(fù)雜又耗時。因此,迫切需要開發(fā)更簡單、快速的方法用于單增李斯特菌的檢測。

核酸適配體是在體外合成得到的一小段DNA或RNA鏈。近年來,許多目標(biāo)物的適配體通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)在體外進(jìn)行多輪篩選、擴(kuò)增、富集得到[15-16],是一個相對穩(wěn)定、分子質(zhì)量小的化合物,易于修飾,可在體外無限合成,具有高特異性和強(qiáng)親和力等優(yōu)點。基于該優(yōu)點,核酸適配體得到了快速發(fā)展,在食品檢測中應(yīng)用廣泛,如沙門氏菌[17]、黃曲霉毒素[18]、重金屬離子[19]和瘦肉精[20]等的檢測。本文根據(jù)適配體的高度特異性,利用適配體與目標(biāo)物、納米金(gold nanoperticle,AuNPS)的相互作用及納米酶催化過氧化氫氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)發(fā)生顏色反應(yīng),建立單增李斯特菌快速檢測方法,并對方法的準(zhǔn)確度、精密度進(jìn)行評定,為單增李斯特菌快速測定提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉樣品,當(dāng)?shù)爻?TMB,鄭州萊寶實驗器材科技有限公司；過氧化氫(H2O2)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、氯金酸,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;所用實驗試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。單增李斯特菌序列：5′-ATCCATGGGGCGGAGATGAGGGGGAGGAG-GGCGGGTACCCGG-3′[21]

1.2 儀器與設(shè)備

BlueStar B紫外-可見分光光度計,北京萊伯泰科儀器股份有限公司；AE224電子分析天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；ULUP-I-10T超純水儀,四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 AuNPS的合成

采用氧化還原反應(yīng)，利用檸檬酸鹽還原氯金酸的方法制備AuNPS[22-23]。向250 mL的三口燒瓶中加入98 mL超純水和1 mL 10 g/L氯金酸溶液,于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上,設(shè)置溫度為120 ℃,加熱至沸騰后,向圓底燒瓶中迅速加入1 mL 10 g/L檸檬酸鈉溶液,觀察溶液顏色由淡黃色到灰黑色至紫紅色最后變?yōu)榫萍t色,繼續(xù)攪拌,保持溶液沸騰15 min。停止加熱,繼續(xù)攪拌冷卻至室溫,將制備的AuNPs溶液于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單增李斯特菌的檢測過程

向反應(yīng)體系中先加入30 μL 1.0 μmol/L單增李斯特菌適配體和20 μL不同濃度的菌液充分混合15 min,然后加入50 μL的AuNPs溶液,充分混合振蕩15 min后,加入20 μL 50 μg/mL的CTAB溶液,繼續(xù)振蕩15 min,隨后分別加入60 μL具有還原性的模擬酶底物TMB 和20 μL體積分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液,在37 ℃培養(yǎng)箱中充分反應(yīng)45 min后,肉眼觀察顏色變化并對其在450～750 nm范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度掃描,記錄其在最大吸收波長650 nm處的吸光值,并計算各個L.monocytogenes濃度下吸光度的差值(ΔA=A0-ALM,A0為溶液中不添加L.monocytogenes時的吸光度值,ALM為溶液中添加LM時的吸光度值)。

1.5 實際樣品測定

為驗證該檢測體系在食品中應(yīng)用的可行性,稱取25 g豬肉樣品,配制3個連續(xù)稀釋度(2.6×102、2.6×103和2.6×104CFU/mL)的單增李斯特菌菌液,吸取1 mL加入至豬肉樣品中拍打均勻,放入盛有225 mL的無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中,用均質(zhì)機(jī)拍打1～2 min,混勻。根據(jù)已建立的檢測方法,加入反應(yīng)體系中進(jìn)行檢測,同時倒平板涂布,至37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,驗證平板培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果,計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜表征

利用紫外-可見分光光度計對比色法檢測L.monocytogenes的可行性進(jìn)行考察。在反應(yīng)體系中不添加H2O2和TMB,研究AuNPS在反應(yīng)過程中的分散狀態(tài),結(jié)果如圖1-a所示。對比曲線a、c可知,測定體系中無CTAB時,AuNPs顆粒具有較強(qiáng)的表面等離子共振特性,在溶液中呈現(xiàn)分散狀態(tài),呈紅色,520 nm處有吸收峰,證明單增李斯特菌的存在不影響溶液狀態(tài)的變化；當(dāng)加入CTAB后,吸收峰從520 nm移至740 nm(曲線b),顏色呈淺藍(lán)色,證明此時AuNPs顆粒發(fā)生了聚集；加入適配體后溶液顏色變?yōu)榧t色,在520 nm處重新出現(xiàn)吸收峰(曲線d),說明此時AuNPs顆粒重新呈現(xiàn)分散狀態(tài)；而加入L.monocytogenes后,740 nm又重新出現(xiàn)了吸收峰(曲線e),顏色又變?yōu)闇\藍(lán)色,這說明AuNPs顆粒又發(fā)生了聚集。在反應(yīng)體系中加入H2O2和TMB,研究單增李斯特菌濃度與反應(yīng)體系顏色變化的關(guān)系,如圖1-b所示,AuNPs可催化H2O2氧化TMB出現(xiàn)藍(lán)色,在650 nm處有吸收峰(曲線a),對比曲線a和b可以看出單增李斯特菌適配體可以增強(qiáng)AuNPs催化能力,催化溶液顯示深藍(lán)色。對比曲線a和c可看出CTAB可誘導(dǎo)AuNPs發(fā)生聚集,在650 nm處吸光度降低,溶液呈現(xiàn)淺藍(lán)色。對比曲線d和e發(fā)現(xiàn),當(dāng)反應(yīng)體系存在L.monocytogenes時,溶液顏色變淺,吸光度值下降,這是由于L.monocytogenes與適配體特異性結(jié)合,AuNPS失去了適配體的“保護(hù)”作用,催化能力降低。此外,在無TMB(曲線f)或無AuNPs(曲線g)情況下,均不產(chǎn)生催化反應(yīng),溶液呈無色,實驗結(jié)果與上述結(jié)論一致。

a-不添加H2O2和TMB的反應(yīng)體系;b-添加H2O2和TMB的反應(yīng)體系圖1 不同條件下反應(yīng)溶液的吸收光圖譜Fig.1 The absorption spectra of the reaction solution under different conditions

2.2 實驗條件優(yōu)化

為了提高準(zhǔn)確度和靈敏度,在單增李斯特菌濃度為1.47×104CFU/mL時對實驗條件進(jìn)行優(yōu)化。本實驗對溶液中單增李斯特菌適配體濃度、CTAB質(zhì)量濃度、TMB用量、H2O2用量和反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化,探討不同條件下吸光度差值的變化,尋求最佳實驗條件。

當(dāng)DNA適配體濃度過低時,DNA適配體不能完全阻止CTAB對AuNPs模擬酶活性的團(tuán)聚作用,而當(dāng)DNA適配體濃度過高時,DNA適配體會與L.monocytogenes特異性結(jié)合,未結(jié)合完的DNA適配體會與CTAB作用,從而減小了CTAB對AuNPs的團(tuán)聚作用,故本實驗選擇1.0 μmol/L為最佳的DNA適配體濃度(圖2-a)。由圖2-b可知,CTAB最佳質(zhì)量濃度為50 μg/mL,這可能是由于CTAB質(zhì)量濃度過低時,其對AuNPs的團(tuán)聚作用較小,而過高時,適配體的加入不足以改變CTAB對AuNPs的作用力,使檢測體系的靈敏度下降。TMB和H2O2用量直接影響反應(yīng)體系的氧化程度,從而導(dǎo)致吸光度值的變化,影響測定靈敏度。根據(jù)實驗結(jié)果(圖2-b、圖2-d),選擇TMB和H2O2的最佳用量分別為為60 μL和20 μL。如圖2-e所示,隨著反應(yīng)時間的增加,吸光度差值呈現(xiàn)先增后降的趨勢,故本實驗選擇45 min為最佳反應(yīng)時間。

a-適配體濃度;b-CTAB質(zhì)量濃度;c-TMB用量;d-H2O2用量;e-反應(yīng)時間圖2 實驗條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of experimental conditions

2.3 線性范圍與檢出限

隨著單增李斯特菌濃度的不斷增高,最大吸收值不斷降低,溶液顏色依次變淺；以最大吸收波長處吸光度變化值為縱坐標(biāo),L.monocytogenes濃度對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制相關(guān)性曲線,如圖3所示,線性方程為y=0.032 1x+0.024 8,R2=0.996 3,檢出限約為5 CFU/mL。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比,該可視化檢測體系對單增李斯特菌有較靈敏的檢出限,檢測時間為1.5 h,在檢測時間和操作程序方面有絕對優(yōu)勢。與GRADY等[24]基于 RT-PCR 建立的單增李斯特菌檢測方法相比,檢出時間更短,而且不依賴昂貴的儀器,就可實現(xiàn)可視化檢測。與LIU[25]開發(fā)的基于表面增強(qiáng)拉曼散射結(jié)合重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測單增李斯特菌的方法相比,檢測時間更短,檢出限更低,而且不需要繁瑣的操作步驟。

a-光譜圖;b-校準(zhǔn)曲線圖3 不同濃度的L.monocytogenes吸收光譜圖和校準(zhǔn)曲線Fig.3 The absorption spectra of L.monocytogenes with different concentrations and the calibration curve

2.4 特異性研究

為了驗證可視化檢測L.monocytogenes的特異性,在最佳條件下,將不同濃度的L.monocytogenes菌液分別替換成濃度為1.47×103CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液Staphylococcusaureus、沙門氏菌菌液Salmonella、福氏志賀菌菌液Shigellaflexneri、大腸桿菌菌液Escherichiacoli和枯草芽孢桿菌菌液Bacillussubtilis進(jìn)行特異性實驗。由圖4可知,當(dāng)L.monocytogenes存在時,適配體會與其特異性結(jié)合,溶液的吸光度值明顯低于其他5種菌在反應(yīng)體系溶液中的吸光度值,表明所建立的方法特異性較好。

圖4 可視化檢測L.monocytogenes的特異性分析Fig.4 Visualization specificity analysis of L.monocytogenes

2.5 實際樣品檢測

為驗證該檢測體系在食品中應(yīng)用的可行性,本實驗選取豬肉樣品進(jìn)行驗證,結(jié)果如表1所示,樣品回收率為93.5%～105.4%,由此表明所建方法可以實現(xiàn)對單增李斯特菌進(jìn)行準(zhǔn)確、快速測定。

表1 豬肉樣品中單增李斯特菌的檢測Table 1 Detection of L.monocytogenes in pork samples

3 結(jié)論

本實驗以金納米粒子作為比色探針,以核酸適配體為生物識別元件,構(gòu)建了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的可視化快速檢測方法。在最佳實驗條件下,建立了可視化檢測L.monocytogenes的快速定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為y=0.032 1x+0.024 8(R2=0.996 3),檢出限約為5 CFU/mL。加標(biāo)回收率為93.5%～105.4%,標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。所建方法操作簡單,可在2 h內(nèi)根據(jù)溶液顏色變化實現(xiàn)對單增李斯特菌的快速檢測,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。