稀少糖家族新成員—L-木酮糖的生物制備研究進展

徐錚,劉雅知,潘森皓,李光耀

(南京工業大學 食品與輕工學院 材料化學工程國家重點實驗室,江蘇 南京,211816)

稀少糖是指一類在自然界中鮮有發現,僅能通過人工合成獲得的單糖、寡糖或糖醇,例如海藻糖、D-阿洛酮糖、D-塔格糖等[1-3]。稀少糖普遍具有人體益生元的功效,如控制血糖濃度、改善腸道菌群關系、不導致齲齒等[4]。因此,稀少糖能夠廣泛應用于制作功能性飲料、保健食品、原料藥等產品[5]。隨著生活水平的不斷提升,稀少糖類產品在世界范圍內受到了愈來愈多的關注。日韓、歐洲等地均推出了以稀少糖為主要活性成分的食品與保健品商品,消費者反響熱烈。然而,現有的稀少糖產品生產成本較高,在發展中國家難以大規模普及,降低這類產品的生產成本具有重要意義。生物工程技術是制備稀少糖的關鍵技術,利用酶催化或微生物細胞工廠生產稀少糖具有轉化率高、副產物少、綠色環保等優勢[6]。L-木酮糖(L-xylulose,C5H10O5,分子量150.13,CAS：527-50-4)是一種L-型戊酮糖單糖,它是肝臟中葡糖醛酸代謝途徑的中間體,用于合成D-葡糖醛酸和L-抗壞血酸；也是真菌中L-阿拉伯糖代謝途徑的中間體之一[4]。L-木酮糖也是近來研究的新型稀少糖之一,是糖苷酶的天然抑制劑,因此L-木酮糖能夠控制血糖,這表明其可能是潛在的降血糖產品[7-8]。此外,糖的構型多是以D-型為主,天然的L-型單糖極少；除L-阿拉伯糖外在自然界中難以尋覓,因此非常珍貴。L-型單糖適用于制作核苷類似物藥物,例如L-木酮糖可進一步轉化為L-木糖(L-xylose),可用于合成抗乙肝病毒化合物Clevudine(L-FMAU)等藥物,也可以用于制備藥物中間體——L-型核苷酸[9-17]。然而傳統有機化學法合成L-木酮糖或其衍生物的難度較大、得率很低,因此使用生物催化如酶催化法是最優的工藝路線[18-19],常見的包括木糖醇轉化為L-木酮糖或L-阿拉伯糖醇轉化為L-木酮糖、利用微生物細胞工廠合成L-木酮糖等幾種方法,下面分別給予綜述。

1 利用木糖醇制備L-木酮糖

利用依賴于NAD+的木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase,XDH)能夠將木糖醇直接氧化為L-木酮糖,研究表明多種芽孢桿菌具有合成此類脫氫酶的能力。1985年,DOTEN等[20]發現1株噬夏孢歐文氏菌Erwiniauredovora突變株能夠將木糖醇氧化為L-木酮糖,研究表明該菌株能夠合成木糖醇-4-脫氫酶,但不能合成L-木酮糖激酶,因此可以將木糖醇轉化為L-木酮糖且后者不會被微生物消耗。張玉寶等[21]分離篩選了1株產L-木酮糖的芽孢桿菌ZN-14,該菌株以20 g/L木糖醇為底物,在37 ℃、pH 9.0條件下催化24 h的轉化率為26.62%,進一步16S rDNA基因序列鑒定表明該菌株屬于巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium),能夠發酵木糖、乳糖、蔗糖、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇等碳源,但關鍵酶的性質未得到研究。POONPERM等[22]用蒼白芽孢桿菌BacilluspallidusY25全細胞催化了2%濃度的木糖醇,在50 ℃條件下的轉化率達到85%。進一步純化該菌株體內的木糖醇脫氫酶,酶學性質表征結果表明它的最適反應溫度為40 ℃、最適pH為10,需要輔酶NAD+,對D-蘇糖醇、木糖醇、D-艾杜糖醇均有活性。然而,該酶催化高濃度木糖醇時轉化率下降明顯,因此存在一定的缺陷。同一課題組的TAKATA等[23]克隆了B.pallidus的木糖醇脫氫酶編碼基因,全長759 bp,對應253個氨基酸殘基。將該基因連接到pQE60質粒后在大腸桿菌表達并純化,純化的重組酶大小28 kDa,最適反應溫度55 ℃、最適pH 11.0,在40 ℃孵育1 h能夠剩余66%的酶活力。反應動力學參數測定表明重組純酶對木糖醇的Km值為2.06 mmol·L-1、kcat值為165 min-1。用表達有重組酶的靜息細胞催化5%濃度木糖醇,反應24 h的轉化率為35%。AARNIKUNNAS等[24]在大腸桿菌中克隆表達了內生細菌Pantoeaananatis來源的木糖醇-4-脫氫酶,該酶編碼基因長度795 bp,其氨基酸序列與短鏈脫氫酶/還原酶家族有38～51%的相似度。該酶需要NAD+作為輔酶,催化活性隨pH上升而顯著提高,利用靜息重組大腸桿菌細胞催化木糖醇可以獲得大于80%的轉化率,在轉化液中未發現副產物D-木酮糖。USVALAMPI等[25]將P.ananatis來源的木糖醇脫氫酶表達于大腸桿菌BPT228菌株,并優化了重組菌株合成L-木酮糖的能力。結果表明,最適的反應溫度44 ℃、pH為7.5～8.0、底物木糖醇質量濃度為250～350 g/L,但此時摩爾轉化率較低,表明高底物濃度和高轉化率還無法兼得。朱雯惠等[26]嘗試了將P.ananatis來源木糖醇脫氫酶表達于枯草芽孢桿菌,由于該菌是食品級菌株,因此所生產L-木酮糖可用作保健品或食品甜味劑等。結果表明表達酶活力為5.183 U/L,在pH 10、45 ℃條件下對20 g/L木糖醇底物的轉化率為17.74%；這證明了枯草芽孢桿菌也適用于L-木酮糖制備關鍵酶的表達。

2 利用L-阿拉伯糖醇制備L-木酮糖

研究表明,真菌中存在L-木酮糖相關代謝途徑(圖1),屬于L-阿拉伯糖利用途徑中的一環[4]。

圖1 真菌中L-阿拉伯糖代謝途徑及中間體L-木酮糖Fig.1 The fungal pathway for L-arabinose utilization via L-xylulose

受此啟發,韓國建國大學的LEE課題組系統研究了L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(L-arabinitol-4-dehyrogenase,LAD),該酶可以催化L-阿拉伯糖醇為L-木酮糖。例如TIWARI等[27]克隆表達了紅褐肉座菌Hypocreajecorina來源的L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(HjLAD)于大腸桿菌BL21(DE3)菌株,重組酶最適反應pH為9.5、最適反應溫度25 ℃；酶反應動力學參數測定表明kcat值為4 200 min-1,而催化效率kcat/Km值為290 (mmol/L)-1·min-1。該酶催化僅2 h對L-阿拉伯糖醇的最高轉化率達到86%,生產強度為2.2 g/L·h,但底物質量濃度較低為5 g/L。SINGH等[28]將L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(HjLAD)以共價鍵的方式固定于二氧化硅納米顆粒上得到固定化酶,其固定化效率達到94.7%。該固定化酶的熱穩定性是游離酶的14.2倍,經過10輪催化反應可以保留94%的初始酶活力；催化L-阿拉伯糖醇為L-木酮糖的轉化率達66%(底物質量濃度30 g/L,NAD+濃度20 mmol/L),生產強度為7.9 g/L·h。該研究表明固定化酶生產L-木酮糖在技術上可行,然而固定化酶體系也存在純酶步驟繁瑣、成本高昂等問題,因此使用固定化細胞操作簡便且更為廉價。GAO等[29-30]在大腸桿菌中分別克隆和表達了HjLAD酶和SpNox酶(NADH氧化酶,Streptococcuspyogenes來源),并將2種大腸桿菌細胞固定化于海藻酸鈣微球中。結果表明這種固定化重組細胞體系可以產生L-木酮糖,其中最優的固定化細胞加載質量濃度為3.75 g/L,最高底物轉化率64%,反應7個批次后能夠殘留65%的酶活力。某些新型固定化材料也為L-木酮糖的制備提供了方法,如PATEL等[31]將HjLAD酶和SpNox酶制備成雜化納米花無機-酶固定化體系,該體系需要使用純酶、硫酸銅溶液、磷酸鹽溶液來合成酶與Cu(PO4)2·3H2O共固定化的催化體系。由于雜化納米花材料具有極高的比表面積,因此可以加速酶與底物的反應速率[32-33]。該固定化酶在外源添加低濃度NAD+(2 mmol/L)的條件下實現木糖醇到L-木酮糖的高轉化率(90.1%),且使用5個批次后能夠維持80%的酶活力；然而純酶的獲得較為繁瑣,因此該體系的實際應用還需要進一步的優化研究。

3 微生物細胞工廠生產L-木酮糖

微生物細胞工廠(microbial cell factory,MCF)是近年來興起的生物工程技術,該技術可以利用廉價碳源(葡萄糖、工業甘油、糖蜜、纖維素水解液等)來生產高附加值化工類產品,解決了酶催化反應需要酶純化等復雜步驟的問題,有利于生產總成本的大幅降低[34]。大腸桿菌作為遺傳背景清晰、分子生物學操作簡便、發酵培養技術成熟的微生物宿主,是構建微生物細胞工廠的首選宿主。近年來多個課題組成功使用大腸桿菌細胞工廠來制備木糖衍生物或選擇木糖作為出發底物,例如大腸桿菌合成木糖醇、木質酸、乙醇酸等產品[35-37]。HAN等[38]探索了大腸桿菌細胞工廠合成L-木酮糖的方法,即以葡萄糖或甘油為碳源,將外源木糖醇轉化為L-木酮糖。具體方法是利用pZE12和pCS27質粒轉化大腸桿菌MG1655菌株,共表達P.ananatis來源XDH酶和肺炎雙球菌(Streptococcuspneumoniae)來源的NOX酶從而實現胞內輔酶循環,以甘油為碳源成功提高了L-木酮糖的產量；實現了木糖醇轉化率65%,得率為0.89 gL-木酮糖/ g 木糖醇,L-木酮糖質量濃度14 g/L、總發酵時間80 h,初始甘油質量濃度12 g/L、木糖醇質量濃度22 g/L。研究還發現胞內L-木酮糖與木糖醇的比例與NAD+/NADH比例一致,補料碳源會導致該比例的下降影響L-木酮糖生成。此外敲除L-木酮糖胞內利用途徑的關鍵酶L-木酮糖激酶基因lyxK以及過表達甘油通道蛋白基因glpF均不能實現L-木酮糖產量的進一步提高,這也表明大腸桿菌合成的L-木酮糖并不會被自身所利用。如何檢測發酵液中木糖醇和L-木酮糖的濃度,避免發酵液中雜質的干擾是利用MCF體系容易遇到的問題。葛馳宇等[39]建立了C18柱(250 mm × 4.6 mm)測定發酵液中L-木酮糖和木糖醇含量的方法,使用柱溫35 ℃、流動相為V(乙腈)∶V(水)=85∶15、流速0.8 mL/min,檢測器為示差檢測器,檢測波長210 nm。該體系的檢測結果不受發酵液中其他組份的干擾,木糖醇的濃度檢測范圍為0.5～30 g/L,最低檢出限為0.18 g/L；L-木酮糖的質量濃度檢測范圍為0.3～30 g/L,最低檢出限為0.15 g/L,滿足了實際使用需求。

4 其他制備L-木酮糖的方法

多酶偶聯催化近年來成為制備稀少糖的一條新途徑,WEN等[40]研發了以L-阿拉伯糖為初始底物,通過AraA(L-阿拉伯糖異構酶)、DTE(D-塔格糖 3-差向異構酶)、RhaB(L-鼠李酮糖激酶)三個酶的依次催化作用(作者稱為scheme 1的路線B)來獲得L-木酮糖的工藝。首先由AraA酶將L-阿拉伯糖部分異構為L-核酮糖,再通過DTE酶差向異構為L-木酮糖,然而由于這2步反應均為雙向可逆的異構反應,因此總轉化率很低。作者將RhaB酶用來繼續催化L-木酮糖,生成L-木酮糖-1-磷酸,最終再脫去磷酸根,這導致該反應路線變為了不可逆反應,使得反應持續朝著產物生成的方向移動。該路線最終以91%的高轉化率得到L-木酮糖,產物純度可達99%以上；但該方法的反應體系較小,規模化應用仍有待進一步研究。綜上所述,將已發表的L-木酮糖生物制備方法總結于表1,L-木酮糖的合成路線則如圖2所示。

表1 L-木酮糖的生物制備工藝Table 1 Bio-production processes for L-xylulose

圖2 L-木酮糖與木糖醇、L-阿拉伯糖醇的結構比較及其用途Fig.2 Schematic diagram of structure comparison of L-xylulose,L-xylitol,and L-arabinol and the reported usage

5 關鍵酶催化機理

關鍵酶的催化機制研究為其改造與增產提供了可能性,然而L-木酮糖制備關鍵酶的催化機理研究較為缺乏；目前僅知TIWARI[42]利用分子建模和docking對接手段對紅褐肉座菌(H.jecorina)來源L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(LAD酶)與底物L-阿拉伯糖醇和輔因子NAD+的結合情況進行了研究,結果表明該酶活性中心內部含有一個四或五配位的鋅離子,和L-阿拉伯糖醇都通過很強的氫鍵作用結合在活性中心,而NAD+則結合在一段富含甘氨酸的“GXGXXG”序列上。在催化過程中NAD+首先與酶結合,在底物結合后NAD+使得底物去質子化,進而在鋅離子的幫助下采用氫轉移機制將L-阿拉伯糖醇氧化為L-木酮糖。

6 展望

對于工業催化而言,產物濃度是極為重要的工藝參數,關系到下游分離提取的效率及總生產成本。已發表文獻中涉及的L-木酮糖生產關鍵酶在催化高濃度底物時轉化率較低,因此不適用于要求更低成本的產業化應用。由于L-木酮糖的生產關鍵酶均為依賴NAD+的氧化酶,故輔因子NAD+的再生尤為重要,構建關鍵酶利用輔因子的胞內循環為增強底物催化效率提供了可能性,這在已發表文獻中獲得了初步探索[29]。進一步的,挖掘酶活力更高、穩定性更好的關鍵酶有利于底物轉化率和產物濃度的提升；而目前已知能夠用于L-木酮糖生產的酶源極少,是一個顯著的瓶頸問題。解決該問題的辦法有賴于基因信息庫挖掘、酶結構測定、酶工程改造、以及高通量篩選技術等[43-44]。盡管L-木酮糖的市場較小,但開發L-型稀少糖的技術仍有重要意義；尤其是在核苷酸類似物藥物開發中可以用作合成中間體,這類技術還可以為其他種類的稀少糖生物合成提供有力借鑒。目前針對L-木酮糖的研究報道仍然較少,隨著研發的不斷深入,在不久的將來L-型稀少糖的產業化制備技術有望成為該領域的又一個經典案例。