D-阿洛酮糖及其合成研究進展

賈東旭,孫晨奕,彭晨,柳志強*,李勉,王紅艷,陳凱茜,程新平,陳德水

1(浙江工業(yè)大學(xué) 浙江省生物有機合成技術(shù)研究重點實驗室,浙江 杭州,310014) 2(浙江華康藥業(yè)股份有限公司,浙江 開化,324032)

日常生活中最常見的食用糖有白糖、紅糖、冰糖,主要成分均為蔗糖。蔗糖甜味純正、口感好、成本低,在食品行業(yè)中常被用作甜味劑。但是,過多攝入蔗糖會導(dǎo)致肥胖、血糖升高,尤其不適合糖尿病人食用。隨著人們對飲食健康的日漸重視,亟需開發(fā)作為蔗糖替代品的新型碳水化合物。

稀有糖[1]是一類天然存在于自然界、含量稀少的糖,能夠改善特殊人群的飲食健康,可作為蔗糖甜味劑的完美替代。按照碳原子數(shù)目分類,稀有糖主要有丁糖類、戊糖類、己糖類和庚糖類等,構(gòu)象上又分為L型和D型,其中D型己酮糖——D-阿洛酮糖(D-psicose)因口感和生理作用突出而備受關(guān)注。

D-阿洛酮糖分子量為180.16,熔點為96 ℃,易溶于水,甜度約為蔗糖的70%,在結(jié)構(gòu)上與D-果糖的C-3位存在差異。不同于傳統(tǒng)甜味劑,當(dāng)D-阿洛酮糖被攝入人體后,70%會通過尿液或糞便直接排出,產(chǎn)生的能量僅為等量蔗糖的0.3%[2],無消化負(fù)擔(dān),對人體不構(gòu)成健康威脅。此外,D-阿洛酮糖還具有多種保健功能,效果最顯著的是降血糖血脂作用,D-阿洛酮糖通過增強能量代謝,促進人體餐后脂肪氧化[3]；其次為預(yù)防肥胖作用,D-阿洛酮糖可顯著誘導(dǎo)胰高血糖素樣肽-1受體釋放,激活迷走神經(jīng)傳入信號,減少食物攝入,從而控制健康體重[4]；另外還有清除自由基實現(xiàn)抗氧化[5]和神經(jīng)保護[6]等作用。美國食品藥品管理局已于2011年將D-阿洛酮糖批準(zhǔn)為一般認(rèn)為安全級別食品,但由于D-阿洛酮糖在自然界中含量極少,其高效制備成為大規(guī)模推廣應(yīng)用的瓶頸。本文主要闡述了國內(nèi)外合成D-阿洛酮糖的研究進展,旨在拉動國內(nèi)D-阿洛酮糖的研究浪潮,為其工藝技術(shù)革新提供新思路,從而推動天然甜味劑的功能探索與應(yīng)用。

1 化學(xué)合成法

早期的D-阿洛酮糖化學(xué)合成法包括關(guān)環(huán)轉(zhuǎn)換合成法[7]、選擇性醇醛縮合合成法[8]等,后續(xù)開發(fā)的方法有催化加氫法、加成反應(yīng)法、Ferrier重排法[9]等。例如,SOENGAS等[10]采用Kiliani ascension-acetonation反應(yīng),獲得己酮糖總體產(chǎn)率為40%；方志杰等[11]先利用糖酸內(nèi)酯與二碘甲烷反應(yīng)得到1-脫氧碘代酮糖,再在堿性條件進行水解反應(yīng)得到酮糖中間體,對羥基進行選擇性保護及脫保護后合成D-阿洛酮糖。盡管化學(xué)合成法可以制備D-阿洛酮糖,但這些方法存在經(jīng)濟性差、環(huán)境污染嚴(yán)重、立體選擇性不足等問題,不能夠成為制備D-阿洛酮糖的主流方法。

2 生物轉(zhuǎn)化法

生物轉(zhuǎn)化法指利用機體內(nèi)的一種或多種酶催化底物生成目標(biāo)化合物的過程。與化學(xué)法相比,生物轉(zhuǎn)化具有諸多優(yōu)勢：高區(qū)域選擇性和立體選擇性,能精確進行特定位置修飾；通常單步反應(yīng)即可獲得目的產(chǎn)物,避免了保護和脫保護步驟,適用于制備復(fù)雜的化合物；反應(yīng)條件溫和、活性高、使用劑量低,無需有毒試劑,環(huán)境相容性好。因此,利用自然界中大量存在的天然原料,以生物酶為催化劑制備D-阿洛酮糖,不僅有利于降低工業(yè)化生產(chǎn)成本,而且符合當(dāng)下綠色環(huán)保的生產(chǎn)原則,為合成D-阿洛酮糖指明了方向。

2.1 生物酶的來源及性質(zhì)

D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase,DPE,EC 5.3.1.3)是一種典型的己酮糖3-差向異構(gòu)酶,可以催化D-果糖的C-3位置的差向異構(gòu)化制備D-阿洛酮糖(圖1)。1993年,IZUMORI等[12]從Pseudomonassp.ST-24中首次發(fā)現(xiàn)DPE,其除了催化D-果糖和D-阿洛酮糖間的轉(zhuǎn)化,還能催化其他單糖間轉(zhuǎn)化。2005年,KIM等[13]從Agrobacteriumtumefaciens中分離得到DPE,該酶在中溫50 ℃、弱堿性pH 8.0、底物質(zhì)量濃度為700 g/L的條件下,轉(zhuǎn)化率達到32.9%。此后,學(xué)者們陸續(xù)從Ruminococcussp.[14]、Clostridiumbolteae[15]、Arthrobacterglobifoemis[16]等微生物中分離得到不同的DPE。隨著越來越多微生物基因組數(shù)據(jù)的公布,目前National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫注釋的DPE序列已有400余條,但是大部分序列的性質(zhì)并未得到研究。截至目前,已明確性質(zhì)及功能的DPE見表1,其中,除了Doreasp. CAG317 DPE的最適pH為弱酸性,C.bolteaeATCC BAA613 DPE和FlavonifractorplautiiDPE為中性外,其余均為嗜弱堿酶；金屬離子可穩(wěn)定DPE構(gòu)象,其最適離子通常是Mn2+或Co2+；大多數(shù)酶在低于50 ℃的條件下具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖1 DPE異構(gòu)化D-果糖和D-阿洛酮糖Fig.1 Epimerization of D-fructose and D-psicose using DPE

表1 不同微生物來源DPE及其酶學(xué)性質(zhì)比較Table 1 Summary of DPEs from different microorganisms and comparison of their properties

嗜熱酶最適反應(yīng)溫度高、熱穩(wěn)定性好,高溫下催化效率高、底物專一性強、不易受雜菌污染等優(yōu)點,耐熱性DPE成為當(dāng)前酶源挖掘的研究熱點。報道的D-阿洛酮糖中,Doreasp.CAG317 DPE的最適溫度高達70 ℃,催化活力與效率也高于同類酶,其報道的酶活力達到803.5 U/mg[17],高于嗜中溫A.tumefaciensATCC 33970 DPE在最適條件下的酶活力8.89 U/mg[13],為工業(yè)推廣帶來希望。

2.2 DPE的結(jié)構(gòu)及催化機制解析

目前,A.tumefaciensDPE(PDB：2HK1)、C.cellulolyticumH10 DPE(PDB：3VNK)和A.globiformisM30 DPE(PDB：5ZFS)的晶體結(jié)構(gòu)得到解析(圖2)。晶體結(jié)構(gòu)表明DPE為對稱的多聚體結(jié)構(gòu),拓?fù)鋵W(xué)角度上看,每個亞基都屬于TIM-barrel fold,由8個重復(fù)的β-strand/α-helix組成,其中l(wèi)oop β6-α6參與催化過程。D-果糖以線性形式通過狹窄通道進入催化位點,在開鏈狀態(tài)下實現(xiàn)異構(gòu)化過程。A.tumefaciensDPE的催化機理稱為氫化物轉(zhuǎn)移反應(yīng)[24](圖3),在催化過程中,D-果糖C-3位于Glu150和Glu244中間,活性位點的氨基酸殘基與D-果糖的C-1、C-2、C-3相互作用促進C-3去質(zhì)子化,產(chǎn)生一個順式烯二酸中間產(chǎn)物,中間體的氧陰離子O-2與金屬離子和帶正電荷的Arg215相穩(wěn)定,隨后,Glu150指導(dǎo)C-3重排,形成D-阿洛酮糖。在逆反應(yīng)中,催化始于Glu150移除C-3位的質(zhì)子,并遵循與正向反應(yīng)基本相同的立體化學(xué)機制[25]。隨著研究的不斷深入,越來越多科研工作者成功解析到DPE不同氨基酸位點的功能。KIM等[26]發(fā)現(xiàn)A.tumefaciensDPE與D-果糖O-6位結(jié)合的氨基酸殘基位點Ile66被其他氨基酸替代后,底物親和力隨之上升或下降,表明Ile66也參與了底物識別。張黎麗等[27]通過序列比對篩選Ruminococcussp.DPE底物結(jié)合的關(guān)鍵位點,Tyr6Ile的kcat/Km降低了99%以上,圓二色譜分析二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)Tyr6與D-果糖的O-6形成氫鍵,并與Glu244位置相鄰,Tyr6Ile打斷了氫鍵并且消除了芳香環(huán)的疏水作用,證實Tyr6是影響底物結(jié)合與催化能力的保守位點。上述實例表明,與果糖O-6位點結(jié)合的DPE氨基酸殘基通常影響DPE催化底物的能力。

圖2 DPE的晶體結(jié)構(gòu)Fig.2 Crystal structure of DPE

圖3 A.tumefaciens DPE催化機理Fig.3 Catalytic mechanism of A.tumefaciens DPE[25]

2.3 DPE的分子改造

2.3.1 提高DPE催化效率

天然DPE熱穩(wěn)定性較差、催化效率有待提高,需要采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)開展分子改造。當(dāng)前分子改造策略主要包括理性設(shè)計和定向進化,理性設(shè)計利用分子建模和分子對接技術(shù),在掌握蛋白結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的基礎(chǔ)上,找到底物與酶分子的結(jié)合位點或底物通道區(qū)域,分析底物與酶分子間的相互作用力和空間位阻,從這2方面入手對酶分子進行改造。定向進化則是在人為體系內(nèi)對酶分子做大量隨機突變,需要借助于高通量篩選方法獲得正向突變體。2種方法適用條件不同,需根據(jù)實際情況選擇或組合使用。ZHU等[28]對StaphylococcusaureusDPE做同源建模,并與底物分子對接,發(fā)現(xiàn)Val105位點存在空間位阻,構(gòu)建的Val105Ala突變體對D-果糖的相對活性提高了68%。ZHU等[29]對C.bolteaeDPE進行自適應(yīng)分子動力學(xué)模擬和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)分析,構(gòu)建Tyr68Ile/Gly109Pro突變體,使Phe248和Trp114的苯環(huán)與底物延展方向平行,形成穩(wěn)定的開放通道,降低了底物和酶的結(jié)合自由能,從而促進酶促反應(yīng)進行。

2.3.2 提高DPE熱穩(wěn)定性

對于吸熱反應(yīng),升高溫度可使反應(yīng)物活化分子數(shù)增多,增強分子間有效碰撞[30]。鑒于此,糖異構(gòu)化過程常采用升高溫度的方法來提高反應(yīng)速率加快產(chǎn)物生成。但是,過高的反應(yīng)溫度會加速非酶促褐變,生成副產(chǎn)物,綜合考慮,糖異構(gòu)化的反應(yīng)溫度設(shè)置于60～75 ℃為宜。目前多數(shù)報道的DPE在60～75 ℃下進行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時,熱穩(wěn)定性仍達不到理想狀態(tài)。因此,提升DPE的熱穩(wěn)定性成為當(dāng)務(wù)之急。CHOI等[31]采用易錯PCR隨機突變的方法構(gòu)建A.tumefaciensDPE突變體Ile33Leu/Ser213Cys,最適溫度達到75 ℃,50 ℃下酶半衰期提高了29.9倍。ZHANG等[32]以定點突變方法構(gòu)建C.bolteaeDPE突變體Tyr68Ile/Gly109Pro,其Km從游離酶的59.8 mmol/L降低至49.1 mmol/L,55 ℃下酶的半衰期從游離酶的156 min提高到260 min,酶的底物親和力也同時提高。ZHANG等[33]根據(jù)Doreasp.CAG317 DPE多聚界面區(qū)域定位突變位點,構(gòu)建Phe154Tyr/Glu191Asp/Ile193F突變體,差示掃描量熱法測試發(fā)現(xiàn)其Tm比野生型提高17.54 ℃。MAO等[34]依據(jù)B-factor選點構(gòu)建RhodopirellulabalticaDPE Leu144Phe突變體,測定突變體50%殘余酶活力時發(fā)現(xiàn),突變體能承受的熱孵育溫度較原始酶提高了22 ℃,結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)是因為突變體形成了新的疏水鍵。總之,雖然在DPE的熱穩(wěn)定性提高方面取得一定進展,但仍未滿足工業(yè)化所需的最佳水平,可繼續(xù)通過在多聚體表面構(gòu)建新的鏈間氫鍵,增強芳香族堆積相互作用,構(gòu)建新的二硫鍵等方式提高DPE的高溫?zé)岱€(wěn)定性。

2.4 多酶偶聯(lián)催化法制備D-阿洛酮糖

微生物體內(nèi)多酶體系在催化過程中表現(xiàn)出高效率和高度協(xié)調(diào)性,為構(gòu)建多酶反應(yīng)體系優(yōu)化生物催化過程提供了借鑒。根據(jù)多酶偶聯(lián)體系所用酶的來源不同,可以分為自偶聯(lián)反應(yīng)和種間偶聯(lián)反應(yīng)2類[35]。自偶聯(lián)反應(yīng)體系是指利用同一微生物體內(nèi)的多個酶實現(xiàn)酶反應(yīng)的偶聯(lián),或是把不同來源的酶重組表達在同一菌株中實現(xiàn)細胞內(nèi)的反應(yīng)偶聯(lián)。種間偶聯(lián)反應(yīng)體系是指在異種微生物之間構(gòu)建多個酶反應(yīng)的偶聯(lián)。MEN等[36]首次將葡萄糖異構(gòu)酶和Ruminococcussp.5_1_39BFAA DPE偶聯(lián)于EscherichiacoliBL21(DE3)中,搭建DPE自偶聯(lián)反應(yīng)體系,添加1 mmol/L Mg2+提高葡萄糖異構(gòu)酶活性,以F42高果糖漿為底物制備得到135 g/LD-阿洛酮糖,反應(yīng)混合產(chǎn)物可投入飲料作為甜味劑使用,可改善傳統(tǒng)高果糖漿對人體帶來的腹部脂肪堆積負(fù)擔(dān)。高雅慧等[37]利用磷酸甘油氧化酶、過氧化氫酶、磷酸酶YqaB和L-1-磷酸鼠李樹膠糖醛縮酶實現(xiàn)種間偶聯(lián)反應(yīng),以經(jīng)濟底物3-磷酸甘油作為前體降低了反應(yīng)成本,采用“一鍋四酶法”一步反應(yīng)同時得D-山梨糖和D-阿洛酮糖,2種單糖的總產(chǎn)率達到36%。韓文佳等[38]采用種間偶聯(lián)方式,在反應(yīng)體系中同時加入不同宿主表達的DPE和L-鼠李糖異構(gòu)酶,共同參與反應(yīng)催化D-果糖生成D-阿洛酮糖和D-阿洛糖,兩者加酶量的比例為1∶10,于60 ℃、pH 9.0下反應(yīng)10 h,兩者產(chǎn)量分別達到5.12和2.04 g/L,將果糖轉(zhuǎn)化為含有功能性稀有糖的高附加值混合糖液。采用多酶偶聯(lián)時需要綜合考慮幾種酶的性質(zhì),選取相對合適的反應(yīng)條件以實現(xiàn)多種產(chǎn)物同時生產(chǎn)效率最大化。

2.5 食品級表達系統(tǒng)構(gòu)建

從安全角度考慮,選擇食品級安全的菌株表達DPE具有重要意義。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)分別經(jīng)歐盟食品安全局和美國食品藥品管理局認(rèn)證為食品級宿主菌,不含內(nèi)毒素,具有培養(yǎng)條件相對簡單、生長迅速、能高效分泌目的蛋白等特點,是用于食品酶表達的優(yōu)良宿主。賈敏等[39]將C.bolteaeDPE轉(zhuǎn)入B.subtilisWB800感受態(tài)細胞,實現(xiàn)DPE首次在食品級宿主B.subtilis中表達,為拓寬D-阿洛酮糖的表達系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。HE等[40]先構(gòu)建丙氨酸消旋酶缺陷型宿主B.subtilis1A751,再采用3個重復(fù)P43啟動子增強C.scindensATCC 35704 DPE表達,以300 g/L果糖為底物,8 g/L凍干酶粉催化反應(yīng)1 h,轉(zhuǎn)化率達到20%；隨后把C.scindensATCC 35704 DPE的C端與錨定蛋白CotZ融合,表達于B.subtilisWB800表面,30 g/L孢子可將500 g/L果糖生物轉(zhuǎn)化制備85 g/LD-阿洛酮糖。CHEN等[41]利用木糖誘導(dǎo)啟動子PxylA調(diào)控Ruminococcussp.5_1_39BFAA DPE在B.subtilis1A751中表達,獲得最佳表達水平,7.5 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵可得2.6 g/L DPE,而且發(fā)現(xiàn)該DPE可自發(fā)分泌到胞外,提高了體系中可溶性DPE的含量。YANG等[42]在C.glutamicum中同時表達PaenibacillussenegalensisDPE、C.cellulolyticumDPE和Ruminococcussp. DPE,實現(xiàn)同工酶盒式反應(yīng),D-阿洛酮糖時空產(chǎn)量達到353 g/(L·h),與表達單個DPE相比,催化效率提高了16.4倍。綜上所述,采用食品級表達宿主生產(chǎn)的DPE具有可靠的食品安全性,還可以獲得較高的蛋白表達量。其中,B.subtilis表達系統(tǒng)是實現(xiàn)制備D-阿洛酮糖的首選表達系統(tǒng)。

2.6 固定化技術(shù)連續(xù)制備D-阿洛酮糖

固定化酶指通過物理或化學(xué)的方法將水溶性的酶結(jié)合或包埋在一定的固定化載體上,從而形成一種不溶性的、可重復(fù)使用的酶制劑。固定化酶具有催化活性穩(wěn)定和便于儲存的特點,可通過離心、過濾等簡單操作從反應(yīng)體系中分離,有利于連續(xù)催化。LIM等[43]將A.tumefaciensDPE固定在Duolite A568 beads上,以700 g/LD-果糖為底物,最終底物轉(zhuǎn)化率為29.6%,向轉(zhuǎn)化體系中加入硼酸,能夠形成D-阿洛酮糖與硼酸的復(fù)合物,從反應(yīng)中移除了產(chǎn)物,促使異構(gòu)化正向進行,最終D-阿洛酮糖產(chǎn)量提高至441 g/L。YOSHIHARA等[44]把A.globiformisM30 DPE固定到IRA 96SBHG離子交換樹脂上,每升固定化酶能制備215 kgD-阿洛酮糖,是當(dāng)前獲得D-阿洛酮糖的最高產(chǎn)量。TSENG等[45]將C.cellulolyticumDPE和油脂素N端融合,再將融合蛋白重構(gòu)于人造油體中實現(xiàn)固定化,連續(xù)轉(zhuǎn)化5批次,固定化酶仍保留50%以上初始酶活。LI等[46]利用陰離子交換樹脂D301制備固定化Ruminococcussp.5_1_39BFAA DPE,分批反應(yīng)10批次后,仍維持在70%以上初始酶活力。孫帆等[47]用硅藻土-海藻酸鈉對重組C.cellulolyticumH10 DPE細胞進行固定化,連續(xù)反應(yīng)7個批次,仍保持81%初始酶活力。PATEL等[48]將AgrobacteriumtumefaciensDPE的N端和酵母Smt3蛋白融合,形成Smt3-DPE復(fù)合體固定至Fe3O4磁性納米顆粒上,連續(xù)10次異構(gòu)化D-果糖,仍舊維持90%的初始酶活力,是目前為止操作穩(wěn)定性最高的固定化方法。需要指出的是,與固定化轉(zhuǎn)氨酶制備西他列汀[49]及固定化葡萄糖異構(gòu)酶制備高果糖漿[50]相比,當(dāng)前DPE固定化技術(shù)還處于實驗室研究水平,開發(fā)高效、經(jīng)濟的DPE固定化方法仍將是今后的重要研究方向。

3 研究展望

隨著對D-阿洛酮糖生理功能研究和臨床試驗探索的逐步深入,研究人員不斷發(fā)現(xiàn)其在降血糖降血脂、抗氧化和神經(jīng)保護等方面的極大潛力,因此制備食品安全級D-阿洛酮糖具有巨大市場應(yīng)用價值。當(dāng)前研究著重在酶的篩選與挖掘,表達體系建立、酶性能提升及強化異構(gòu)化過程等方面開展研究。建立高底物濃度、高轉(zhuǎn)化率、高生產(chǎn)強度的D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺,實現(xiàn)技術(shù)創(chuàng)新仍需繼續(xù)開展如下研究：(1)以第二代測序技術(shù)構(gòu)建微生物基因組數(shù)據(jù)庫,從中篩選更廣闊的嗜熱DPE；(2)采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造酶分子結(jié)構(gòu),提高DPE催化能力和應(yīng)用穩(wěn)定性,使其適應(yīng)復(fù)雜物化環(huán)境,提升工業(yè)應(yīng)用潛能；(3)開發(fā)食品級宿主,實現(xiàn)DPE在食品級宿主中的異源表達,建立符合食品安全的生物合成技術(shù)平臺；(4)建立高強度發(fā)酵技術(shù),強化生物催化體系、創(chuàng)制工業(yè)化固定化技術(shù),實現(xiàn)生物制備及轉(zhuǎn)化工藝的全方位立體性技術(shù)提升,使D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化達到事半功倍的效果。開展上述技術(shù)研發(fā)對于填補國內(nèi)功能性糖自主生產(chǎn)的空白具有深遠影響。