蘋果酸-乳酸發(fā)酵細菌乙醇脅迫應答機制研究進展

蓋昱梓,孫靜嫻,黃剛,金剛

1(寧夏大學 農學院,寧夏 銀川,750021) 2 (寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川,750021) 3(葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,寧夏 銀川,750021)4 (寧夏葡萄與葡萄酒工程技術中心,寧夏 銀川,750021)

蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation,MLF)是指在葡萄酒釀造過程中,乳酸菌將L-蘋果酸分解生成L-乳酸和CO2的過程[1-3]。MLF對干紅葡萄酒和陳釀型白葡萄酒的口感、香氣及微生物穩(wěn)定性等的提升具有重要作用。MLF發(fā)生在酒精發(fā)酵結束后,此時葡萄酒中的乳酸菌受到高酒精度、低pH、高SO2等惡劣環(huán)境的脅迫。隨著全球氣候變暖的加劇,葡萄漿果的潛在酒度不斷升高[4]。酒精發(fā)酵完成后葡萄酒的高酒精度(可超過16%體積分數)成為很多產區(qū)葡萄酒能否順利進行MLF的最重要因素之一[5]。乙醇脅迫環(huán)境下乳酸菌的脅迫應答機制也越來越成為研究人員關注的焦點問題。

在乙醇脅迫條件下,乳酸菌往往表現出細胞膜完整性受損、菌體關鍵酶活性下降和正常生理代謝調控異常等。同時,乳酸菌也會通過調節(jié)細胞膜脂肪酸構成、表達脅迫耐受相關基因和調整細胞生理代謝等作為應對,進而適應乙醇脅迫的環(huán)境(圖1)。近年來,隨著基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等技術和方法的不斷發(fā)展,人們對乙醇脅迫下乳酸菌應答作用機制的研究逐漸深入。本文主要對MLF中酒球菌屬(Oenococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等常見菌屬細菌在乙醇脅迫下的應答機制進行了綜述。

圖1 乳酸菌乙醇脅迫適應性機制圖Fig.1 Diagram of the adaptation mechanism of lactic acid bacteria to ethanol stress注:表示基因誘導調控表達

1 調節(jié)細胞壁和細胞膜功能提高乙醇耐受性

細胞壁和細胞膜作為乳酸菌與乙醇環(huán)境接觸的屏障,直接影響著乳酸菌存活和MLF的順利進行。特別是對于缺乏完整細胞結構,直接由細胞膜包被的酒酒球菌(Oenococcusoeni),乙醇脅迫下的細胞膜結構調節(jié)顯得尤為重要。

1.1 細胞膜功能調節(jié)提高乙醇耐受性

細胞膜作為細胞的界面和屏障，在細胞生長、代謝、能量傳導和維持穩(wěn)定的胞內環(huán)境中起著重要作用[6]。乙醇的毒害作用往往首先作用于細胞膜，通過破壞細胞膜結構中的疏水核心使極性分子自由地通過滲透屏障，影響細胞關鍵酶活性，致使細胞膜完整性受損，通透性及流動性增強，細胞生長受到抑制，甚至死亡[7]。細胞膜結構和功能調節(jié)是乳酸菌對乙醇脅迫的常見應激防御機制。在受到乙醇脅迫后，細胞膜脂肪酸構成中不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)、飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)和環(huán)丙烷脂肪酸(cyclopropane fatty acid，CFA)含量隨著乙醇脅迫濃度和時間發(fā)生變化[3, 8]。通常脅迫后，膜脂肪酸平均碳鏈得到延長，促使酰基鏈填充，減少游離酰基鏈末端的運動，使其呈“凝膠狀”，從而保持細胞膜穩(wěn)定性[8]。乙醇脅迫后乳酸菌脂肪酸含量變化相關研究表明，盡管乙醇脅迫后植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)菌株WCFS1編碼脂肪酸生物合成(fab)基因簇表達下調，但編碼酰基載體蛋白合成酶的相關基因(acpS)和環(huán)丙烷脂肪酰基磷脂合成酶相關基因(cfa2)表達上調，通過促進膜脂肪酸碳鏈的延長和CFA的合成，可抑制乳酸菌細胞流態(tài)化作用[9-10]。YANG等[11]在L.plantarum菌株NF92中鑒定到受acrR轉錄調控的乙醇脅迫抗性基因fabZ1(3-羥基酰基-ACP脫水酶)，通過比較敲除和過表達轉錄調控基因acrR的研究表明，acrR通過正向調控脂肪酸生物合成(fab)基因簇促進脂肪酸的生物合成，過表達acrR后細胞膜中UFA和CFA含量增加，特別是克服乙醇毒性效應重要因子C18:1和cycC19:0，通過調節(jié)細胞膜流動性，提高菌株對高濃度乙醇環(huán)境的適應性。而O.oeni乙醇脅迫耐受相關研究同樣發(fā)現，在體積分數為5%的低乙醇條件下菌株膜脂肪酸中SFA含量增加，在體積分數為10%的高乙醇條件下UFA和CFA含量增加[12-13]。據報道，在高于體積分數為12%的乙醇脅迫環(huán)境下，O.oeni中香葉基香葉基焦磷酸合酶基因(ggpps)表達水平顯著提高，通過促使類異戊二烯前體流向膜穩(wěn)定劑(如類胡蘿卜素途徑)相關合成，穩(wěn)定細胞膜結構，防止細胞死亡[14]。O.oeni和L.plantarum菌株乙醇脅迫后細胞膜調控機制的相似性，也是兩者在乙醇脅迫環(huán)境下菌株活性較高的重要原因。

1.2 細胞壁功能調節(jié)提高乙醇耐受性

由交替的N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸與一種或多種氨基酸短肽交聯而成三維網狀大分子結構的肽聚糖(peptidoglycan,PG)是乳酸菌重要的細胞壁組分,以維持細胞形狀和防止?jié)B透脅迫而著稱[15-16]。YUAN等[17]將L.plantarum菌株利用Cre-lox重組技術在大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株中進行基因整合構建,鑒定插入為催化肽聚糖生物合成第1個重要步驟的編碼UDP-N-乙酰氨基葡糖烯醇丙酮酸轉移酶基因murA2及其上游基因間973 bp序列,使過表達菌株EC100乙醇耐受性較對照菌株提高4.1倍,證明乙醇脅迫下菌株murA基因表達能夠催化PG主要前體合成提高乙醇耐受性[17]。磷壁酸(teichoic acid,TA)是革蘭氏陽性菌細胞壁的特殊組分,由甘油磷壁酸和核糖醇磷壁酸組成。轉錄組分析研究表明,L.plantarum菌株WCFS1在體積分數為8%的乙醇脅迫初期磷壁酸D-丙氨酰化所需的dlt操縱子表達被誘導,隨著脅迫時間延長,參與細胞壁磷壁酸生物合成的基因tagE5、tagE6轉錄表達上調,菌株對乙醇環(huán)境的適應性增強[10]。除了表達細胞壁組分合成相關基因外,受乙醇脅迫影響,編碼具有自溶素活性的N-乙酰壁酰胺酶基因(oeoe0735、oeoe0588、oeoe1734)受到抑制表達下調,防止細胞壁的自溶作用[18]。有趣的是,乳酸菌代謝在細胞壁外或細胞表面會造成酒體渾濁、增加葡萄酒黏稠感的胞外多糖(exopoly saccharides,EPS)合成,主要是由壓力環(huán)境所引起的[19]。乙醇脅迫環(huán)境下EPS合成相關的胞外多糖生物合成蛋白(oeoe0071)、UDP-葡萄糖-6-脫氫酶(oeoe1737)等基因表達上調,通過分解代謝途徑中一定量的葡萄糖產生EPS,構成防止?jié)B透壓失調的保護因子,提高乳酸菌在葡萄酒中的存活率[20-21]。這也意味著乳酸菌細胞壁和細胞膜的改變是克服乙醇在脂質-水界面的影響所必需的。

2 細胞穩(wěn)態(tài)機制和代謝變化提高細菌乙醇耐受性

除了調節(jié)細胞壁和細胞膜結構維持細胞完整性外,乳酸菌往往通過細胞穩(wěn)態(tài)機制和代謝變化來對細胞內部酸化和跨細胞膜質子梯度消散、活性氧積累等乙醇脅迫影響做出應對,表現出增強乙醇抗性的細胞狀態(tài)[22]。

2.1 質膜結合ATP酶的激活提高乙醇耐受性

隨著乙醇濃度的增加,乳酸菌中質膜結合ATP酶激活表達,特別是質膜結合ATP酶中的H+-FoF1-ATP酶,不僅參與細胞內ATP的合成,還與ATP水解偶聯,將質子從細胞中擠出到可產生質子梯度的介質中,產生質子驅動力(proton motive force,PMF)施加到質子上,驅動需要膜結合過程的代謝。全基因組分析表明,乳酸菌中普遍存在FoF1-ATP酶基因,這對于乙醇脅迫下乳酸菌存活能量供應而言至關重要[23-24]。CONTRERAS等[25]在體積分數分別為9%和12%的乙醇培養(yǎng)環(huán)境下將O.oeni菌株PSU-1和無乙醇脅迫條件進行比較發(fā)現,由FoF1-ATP酶滿足的非生長相關維持性ATP需求分別提高了10倍和17倍,幫助表達細胞維持相關代謝[25]。除了H+-ATP酶外,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶也是分布在細胞膜上的典型巰基酶。因乙醇脅迫而消除的Na+-K+、Ca2+-Mg2+巰基會導致細胞膜的通透性增加,因此較高的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性對菌株乙醇菌株脅迫耐受是非常有益的[26-28]。LIN等[29]將O.oeni菌株SD-2a的puuE基因在L.plantarum菌株WCFS1中進行異源表達,證明puuE基因可以顯著提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,從而提高細胞膜完整性,在細菌乙醇耐受性中發(fā)揮作用。

2.2 蘋果酸和檸檬酸代謝調控提高乙醇耐受性

目前已經報道的O.oeni部分蛋白質組脅迫應激反應和代謝機制表明,乳酸菌蘋果酸代謝和檸檬酸代謝能夠消耗質子,并產生膜電位和pH梯度,在乙醇脅迫環(huán)境為菌株能量供應和細胞體內pH穩(wěn)態(tài)機制中發(fā)揮重要作用[30-31]。

在葡萄酒中乳酸菌可以攝取環(huán)境內的蘋果酸和檸檬酸參與相關代謝。蘋果酸代謝將L-蘋果酸脫羧為L-乳酸和CO2。脫羧過程中質子被消耗,調節(jié)細胞內部pH,從而保持質子電位梯度,并在細胞質膜上形成PMF,通過膜結合的FoF1-ATP酶驅動ATP合成,提高乙醇脅迫下菌株存活率[31]。轉錄組學分析表明,乙醇脅迫下與蘋果酸代謝相關mle操縱子(mleA、mleP、mleR)、MLF系統(tǒng)轉錄激活因子(oeoe1565)轉錄表達上調,幫助細菌應對乙醇脅迫[21]。而葡萄酒中檸檬酸由各種膜相關通透酶轉運進入細胞后,檸檬酸鹽在檸檬酸裂解酶復合物催化下轉化為乙酸鹽和草酰乙酸鹽；然后由草酰乙酸脫羧酶脫羧,最終生成丙酮酸和CO2,或被可溶性細胞質蘋果酸酶脫羧,從環(huán)境中獲得能量,并且產生雙乙酰等香氣化合物[32]。值得注意的是,菌株檸檬酸相關基因表達水平可能主要受培養(yǎng)環(huán)境檸檬酸誘導[21，33]。有研究將O.oeni菌株PSU-1在額外添加0.5 g/L檸檬酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng),結果表明檸檬酸代謝激活主要受乙醇影響,當存在乙醇時,檸檬酸途徑的基因操縱子cit(citC、citD、citE、citF)表達激活,響應乙醇脅迫代謝產物雙乙酰、乙酸的相關基因alsD和ackA的表達量增加,通過利用培養(yǎng)基中檸檬酸鹽進行代謝[33]。而將O.oeni菌株Elios在不含檸檬酸的體積分數為8%的乙醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,則發(fā)現檸檬酸操縱子(編碼檸檬酸轉運蛋白的基因oeoe0419和編碼檸檬酸裂解酶α亞基oeoe0423)表達下調,并且在蛋白質水平上得到一致結果[21]。

2.3 氨基酸代謝調控提高乙醇耐受性

氨基酸代謝是乳酸菌應對乙醇脅迫的又一重要途徑。在乳酸菌中,精氨酸通過脫亞氨酶途徑完全降解為鳥氨酸、NH3和CO2,提供一分子ATP,維持細胞內部pH動態(tài)平衡。研究表明,乳酸菌生長初期編碼精氨酸脫亞氨酶(ArcA)、鳥氨酸氨基甲酰基轉移酶(ArcB)和氨基甲酸酯激酶(ArcC)關鍵酶基因的arc操縱子由碳分解代謝控制蛋白(CcpA)負調控；隨著菌株生長(指數生長期或穩(wěn)定生長期),arc操縱子表達由轉錄調控因子argR、ahrC調節(jié)[34]。在表達arc操縱子的乳酸菌中,精氨酸分解代謝可以為乳酸菌適應乙醇環(huán)境和生長提供能量。DEZ等[35]將乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)菌株NZ9700在外源添加精氨酸的乙醇培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)現與正常株相比argR、ahrC基因敲除株生長速率下降,進一步轉錄組分析發(fā)現,乙醇存在下正常株參與精氨酸降解的arcA、arcB、arcD1等相關基因轉錄上調20～40倍。精氨酸合成前體之一的谷氨酸在乙醇脅迫應答中同樣具有重要作用[36-38]。轉錄組學和蛋白組學研究結果表明,體積分數為8%的乙醇脅迫后谷氨酸轉運蛋白基因(oeoe1634)的生物合成表達增加,通過脫羧生成γ-氨基丁酸以及谷氨酸-γ-丁酸逆向系統(tǒng)在環(huán)境中擠出γ-氨基丁酸作為質子動力,幫助菌株維持胞內pH動態(tài)平衡，增加潛在能源可用性[21,39]。

圖2 乙醇環(huán)境下谷胱甘肽代謝途徑[40]Fig.2 Glutathione metabolism pathway in ethanol environment[40]注：Gpo,谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase)；GSH,還原型谷胱甘肽(glutathione)；GSSG,氧化型谷胱甘肽 (glutathione disulfifide)；GshR,谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase)；Grx,谷氧還蛋白(glutaredoxin)

3 應激蛋白合成提高乙醇耐受性

當乳酸菌生存環(huán)境轉變?yōu)橐掖济{迫環(huán)境后,蛋白質表達由抑制冗余或非必需蛋白表達轉變?yōu)楹铣捎糜诘钟{迫環(huán)境的應激蛋白,參與細胞DNA和蛋白質的重組修復。乙醇脅迫后乳酸菌開始誘導應激蛋白特別是熱激蛋白(heat shock protein,HSP)表達。

HSP是較早發(fā)現的一類應激蛋白質,屬于分子伴侶蛋白質。在多種脅迫環(huán)境下,HSP都能夠阻止蛋白質聚集,并協助蛋白質重新折疊,最終發(fā)揮防止蛋白質損傷和提高脅迫耐受性的分子伴侶作用[44]。常見的HSP主要包括分子伴侶蛋白(DnaK、GroESL、DnaJ等)、蛋白酶(Clp、FstH、HtrA等)以及DNA重組修復蛋白(RecA、UvrD解旋酶等)[45]。目前由阻遏蛋白HrcA、CtsR單一或共同調控的DnaK和GroESL較多報道與乳酸菌乙醇脅迫響應相關。在O.oeni中ctsR基因被鑒定并且異源表達驗證為逆境反應基因重要表達調控因子,通過調控hsp18、clp等小熱休克蛋白基因表達,例如,O.oeni中的hsp18基因合成的Lo18蛋白,對乙醇等脅迫環(huán)境做出對應[46-47]。ZHAO等[48]將O.oeni中ctsR基因在L.plantarum菌株WCFS1中異源表達,結果表明菌株WCFS1在酸性乙醇環(huán)境下的生長性能得到提高,操縱子下游clp、groESL、dnaK和hsp等基因表達增強。L.plantarum菌株WCFS1在乙醇環(huán)境下進行培養(yǎng)后發(fā)現,受到乙醇環(huán)境影響后菌株蛋白質快速連續(xù)展開,僅僅由hrcA轉錄表達的groELS逐漸不足以維持蛋白質的正確折疊,變性和聚集的蛋白質積累到一定程度后,ctsR調節(jié)子開始激活clpP、clpE、hsp18等轉錄表達,維持正常蛋白質功能[10,49]。HSP中DNA修復蛋白通常在細胞體內外多種因素脅迫時被激活,對受損DNA進行識別和修復。在同為革蘭氏陽性菌的簡單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)菌株TCCC11037乙醇脅迫報道發(fā)現,DNA重組修復過程中關鍵蛋白基因recA和uvrD轉錄表達分別提高了2.59倍和2.57倍[50]。而在葡萄酒釀造常見乳酸菌中雖然同樣存在DNA修復蛋白,但是乙醇脅迫表達變化研究中卻鮮見報道。關于乙醇脅迫后葡萄酒釀造常見乳酸菌DNA修復蛋白表達相關機制可能仍需要進一步探究。

4 結語

對乳酸菌在乙醇脅迫環(huán)境下的應答機制研究,不僅有助于更好地了解相關菌種特性,而且為優(yōu)良菌株構建提供了理論基礎。目前,研究人員主要從維持細胞完整性、細胞內部能量供應和代謝調節(jié)、脅迫蛋白表達等方面對乳酸菌乙醇脅迫應答和適應性機制進行了研究,以了解葡萄酒中乳酸菌的乙醇脅迫適應性表達機制。然而實際上葡萄酒是多脅迫共存的復雜環(huán)境,因此如果能夠進一步認識乳酸菌多脅迫因素條件下細胞代謝的內在聯系和交叉保護機制,將對全面認識乳酸菌的逆境脅迫應答機制和更好發(fā)揮乳酸菌在葡萄酒MLF中的作用具有重要意義。相信隨著新技術的發(fā)展,人們對葡萄酒脅迫環(huán)境中脅迫應答機制的深入研究,乳酸菌脅迫應答適應性機制將得到更全面地揭示。