蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的重組表達(dá)與發(fā)酵條件優(yōu)化

李靜竹，胡夢(mèng)君，張建華

(上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海，200240)

植物蛋白相較動(dòng)物蛋白有較多的營(yíng)養(yǎng)素和更少的卡路里，因此近年來(lái)以植物蛋白為原料的相關(guān)食品深受健康人士的推崇[1]。然而核桃、杏仁等植物蛋白飲品在加工過(guò)程中易受pH和化學(xué)添加劑等因素的影響，從而出現(xiàn)不同程度的分層、絮凝、沉淀等現(xiàn)象[2]。盡管在偏酸性液態(tài)食品中pH與植物蛋白的pI接近是誘因之一[3]，但其主要原因是大多數(shù)植物蛋白含有大量的谷氨酰胺殘基和天冬酰胺殘基，易形成氫鍵使得蛋白質(zhì)聚集沉淀[4]，進(jìn)而影響蛋白的乳化性、氣泡性和凝膠性等功能性質(zhì)，降低產(chǎn)品品質(zhì)[5]。為有效解決植物蛋白生產(chǎn)加工中的上述難題，一般采用脫酰胺的方法對(duì)植物蛋白進(jìn)行處理。

目前，工業(yè)上廣泛采用酸堿濕熱法和酶法對(duì)植物蛋白進(jìn)行脫酰胺處理。酸法處理常會(huì)涉及高溫，易引起蛋白質(zhì)的水解，從而產(chǎn)生不良風(fēng)味,影響產(chǎn)品品質(zhì)。酶法處理可以有效脫去大豆蛋白和燕麥蛋白等植物蛋白的谷氨酰胺殘基上的氨基，提高蛋白的溶解度。常用的酶有胰凝乳蛋白酶[6]、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶[7]和肽谷氨酰胺酶等，但這些酶有一定的局限性，如轉(zhuǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶底物專一性不強(qiáng)[8],肽谷氨酰胺酶對(duì)大分子蛋白質(zhì)作用甚微[9]。因此，專一性強(qiáng)和底物特異性好的蛋白質(zhì)谷氨酰氨酶(protein-glutaminase,PG)引起了越來(lái)越多的關(guān)注。

PG最初是在2001年被日本學(xué)者YAMIGHCHI等[10]從土壤中的解脘金黃桿菌發(fā)酵液分離得到。PG一般以含有信號(hào)肽的前體形式表達(dá)，需經(jīng)酶切為分子量約20 kDa的成熟酶分子后才有活性[11]。研究發(fā)現(xiàn)PG對(duì)羥基苯氧基-谷氨酰胺-甘氨酸(Cbz-Gln-Gly)和酪蛋白等底物有脫酰胺活性[10]，且不會(huì)造成蛋白質(zhì)的水解，底物專一性很強(qiáng)，安全有效。PG對(duì)米谷蛋白[11-12]、燕麥蛋白[13]等均有良好的脫酰胺作用，且處理后其起泡性、凝膠性和溶解度等功能性質(zhì)均得到一定改善。目前PG已作為國(guó)家批準(zhǔn)的食品添加劑，但其生產(chǎn)菌解脘金黃桿菌發(fā)酵液中PG的酶活力僅為0.258 U/mL[10]，難以工業(yè)應(yīng)用，因此提高菌株產(chǎn)PG的能力非常重要。

對(duì)PG重組表達(dá)已有諸多研究，KIKUCHI等[14]置換PG信號(hào)肽，構(gòu)建谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum) pPK4:pro-mPG表達(dá)體系，表達(dá)的帶前導(dǎo)肽(leader peptide，pro)的PG經(jīng)絲氨酸蛋白酶酶切后成功獲得成熟肽(mature peptide，mPG)；汪正華等[15]通過(guò)重疊延伸PCR法合成PG的全長(zhǎng)基因，構(gòu)建BL21/pET32a(+)：mPG表達(dá)體系，經(jīng)誘導(dǎo)后得到以包涵體的形式表達(dá)的mPG，再經(jīng)變性、復(fù)性處理后測(cè)得該mPG的酶活力為0.371 U/mL。以上研究構(gòu)建的菌株或需IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，或產(chǎn)酶量不高，無(wú)法達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，構(gòu)建可以較高效表達(dá)此酶且無(wú)需誘導(dǎo)劑的表達(dá)體系尤為重要。

本文以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pHT43為表達(dá)載體，并將其誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pgrac替換為強(qiáng)組成型啟動(dòng)子P43[17-18]，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT43:pro-mPG(P43)，將其轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)[19]中，實(shí)現(xiàn)pro-mPG的胞內(nèi)可溶性表達(dá)。采用胰蛋白酶對(duì)pro-mPG酶切，獲得具有一定酶活力的成熟mPG。通過(guò)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件優(yōu)化，進(jìn)一步提高酶活。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌Top10，BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保藏;質(zhì)粒pHT43,淼靈生物有限公司;pHT43:pro-mPG(P43)為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建。

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖、氨芐西林,日本OXIDE公司；UNIQ-10質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、丙烯酰胺、3-Truecolor預(yù)染蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶KpnI和SmaI、T4連接酶、脫脂奶粉、10×TBST、異丙基-β-D巰基半乳糖苷,上海生物工程有限公司；MixPCR、核酸染料、200 bp Marker 購(gòu)自TaKara；His-tag單克隆抗體、羊抗鼠抗體、ECL顯色發(fā)光試劑盒,上海翊圣生物有限公司；其他培養(yǎng)基及有機(jī)、無(wú)機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；超純水系統(tǒng)，美國(guó)Mili-Q公司；高壓滅菌鍋，日本Tomy公司；恒溫培養(yǎng)搖床，深圳市顯控自動(dòng)化技術(shù)有限公司；微量臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，SONICS公司；超微量分光光度NanoDrop 2000c，美國(guó)Thermo Forma公司；PCR儀， Bio-Rad Laboratory；微波爐，韓國(guó)LG公司；酶標(biāo)儀，TECAN；電泳儀，Bio-Rad Laboratory；轉(zhuǎn)膜儀，Bio-Rad Laboratory；顯影儀，ChemiDoc XRS+。

1.3 方法

1.3.1 PG基因的片段合成設(shè)計(jì)及其表達(dá)載體的構(gòu)建

利用pHT43構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。選用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子P43替換pHT43上的原有的啟動(dòng)子Pgrac[20]， P43序列后緊接著pHT43中自帶的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomebinding site，RBS)和信號(hào)肽SamyQ序列，其后為編碼PG的前導(dǎo)肽和成熟肽序列(Genbank：AB046594)，并在成熟肽N端添加6個(gè)組氨酸，片段全長(zhǎng)1 359 bp，由上海派森諾基因科技公司人工合成。選擇質(zhì)粒上的KpnI和SmaI作為酶切位點(diǎn)，將合成的目的片段與被KpnI和SmaI酶切的pHT43通過(guò)T4連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT43：pro-mPG(P43)。雙酶切及酶連接體系參照韋雪芳等[21]的方法。

1.3.2 PG基因的克隆及其質(zhì)粒酶切鑒定

將重組質(zhì)粒pHT43:pro-mPG(P43)及pHT43空載分別轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中，加入600 μL的LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)1 h。取出復(fù)蘇的Top10感受態(tài)細(xì)胞并接種于含100 μg/mL氨芐西林的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.3.3 PG基因重組表達(dá)菌E.coliBL21的轉(zhuǎn)化及其陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定

將重組質(zhì)粒和空載分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法與培養(yǎng)條件同1.3.2。將復(fù)蘇液均勻涂布于含100 μg/mL氨芐西林的LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日挑取平板上的單菌落轉(zhuǎn)接至1 mL LB(含100 μg/mL氨芐西林)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。取500 μL加熱煮沸15 min，作為DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。利用生物軟件oligo設(shè)計(jì)上下游引物，分別為F2499:5’-CTTTCAGCCGACT CAAACATCA-3’；R3013:5’-GTAAGGTATAAACTTTTCAGTTGCAGA-3’。

PCR反應(yīng)體系為：菌液DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Mix master 12.5 μL，加無(wú)菌水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。將目的條帶切膠回收并測(cè)序。測(cè)序完全正確的陽(yáng)轉(zhuǎn)子-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4E.coliBL21陽(yáng)轉(zhuǎn)子的誘導(dǎo)表達(dá)與發(fā)酵液超聲處理

將重組菌和空載菌株在LB平板上劃線活化。挑取單菌落，接種于4 mL含100 μg/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。以5%接種量將上述兩種菌液分別轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中(100 μg/mL氨芐西林)，于37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至OD600為0.8左右開始計(jì)時(shí)，分別取上述菌株培養(yǎng)4、8、24 h的菌液各1 mL，4 ℃、10 000 r/min離心2 min，棄去上清，用1×PBS(pH 7.2)緩沖液洗滌菌體沉淀2次。再加入500 μL的1×PBS充分重懸菌體，將其置于冰上進(jìn)行超聲破碎(功率為40%，10 s/10次)。超聲后菌液于4 ℃、8 000 r/min 離心1 min，沉淀用1×PBS溶解。采用Nanodrop測(cè)定重組菌的超聲破碎全菌液、上清液及沉淀的蛋白濃度。

1.3.5E.coliBL21陽(yáng)轉(zhuǎn)子的SDS-PAGE分析、鎳柱純化以及Western blot驗(yàn)證

將蛋白樣品濃度調(diào)整為5～6 mg/mL，與4×SDS蛋白上樣緩沖液按體積比3∶1混合、煮沸，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳：設(shè)置恒壓80 V，待樣品中的溴酚藍(lán)到達(dá)濃縮膠與分離膠的界線時(shí)，將電壓調(diào)至120 V。采用NTA-Ni柱對(duì)蛋白樣品進(jìn)行純化，采用不同濃度的咪唑溶液(20、50、100、250 mmol/L)分步洗脫，間接取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，收集含有單一目的蛋白的洗脫液進(jìn)行脫鹽，用1×PBS(pH 7.2)緩沖液替換洗脫液中的咪唑，濃縮后通過(guò)BCA法測(cè)定其蛋白濃度。參照陳俊等[22]的方法對(duì)未經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的PAGE膠進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，恒流116 mA條件下電轉(zhuǎn)40 min。Western-blot相關(guān)操作參照HU等[23]的方法，采用ECL顯色發(fā)光試劑盒對(duì)膜進(jìn)行孵育，顯影儀自動(dòng)曝光1 min，觀察免疫印跡結(jié)果。

1.3.6 酶活測(cè)定條件確定以及酶學(xué)性質(zhì)分析

含前導(dǎo)肽的PG先用胰蛋白酶消化，消化試驗(yàn)采用何燦等[24]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，具體如下：配制不同質(zhì)量濃度的胰蛋白酶稀釋液(0.03、0.1、0.3、0.9、2.7 mg/mL)，與純化后的pro-mPG按1∶10混勻，消化不同時(shí)間(0～50 min，每間隔10 min)，進(jìn)行SDS-PAGE分析和酶活力測(cè)定。根據(jù)SDS-PAGE條帶灰度分析和酶活力測(cè)定結(jié)果確定胰蛋白酶的最佳消化時(shí)間。

酶活力測(cè)定方法在汪正華等[15]的基礎(chǔ)上進(jìn)行部分調(diào)整，將消化后的酶液與底物反應(yīng)不同時(shí)間(0～30 min，每間隔5 min)，進(jìn)行靛酚顯色，確定消化酶液與底物的最佳反應(yīng)時(shí)間。根據(jù)酶活力結(jié)果，選擇以100 μL 酶液，用0.03 mg/mL胰蛋白消化10 min，底物反應(yīng)時(shí)間20 min為酶活測(cè)定條件。

對(duì)純化的PG進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，分別在不同pH(3.5～9.5)和不同溫度(25～70 ℃)下，將mPG孵育60 min后測(cè)定酶活力，探究PG的最適酶反應(yīng)條件。

1.3.7 優(yōu)化培養(yǎng)基配方和發(fā)酵產(chǎn)酶條件

以添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的谷氨酰胺[25]的LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選用不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、山梨糖醇、甘油)替代LB中80%酵母提取物，不同氮源(牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨、安琪酵母粉、甘氨酸)替代LB中80%胰蛋白胨，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%和0.3%的金屬離子(K+、Mg2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+)[26]，探究不同碳、氮源和金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響，并選擇不同的溫度(25 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃、40 ℃)和不同的初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)分別培養(yǎng)重組菌，探究培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

酶的純化及發(fā)酵條件優(yōu)化等實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，采用prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的合成與重組載體的構(gòu)建

由于產(chǎn)PG的解脘金黃桿菌與大腸BL21親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為實(shí)現(xiàn)PG在BL21中的有效表達(dá)，本研究不使用編碼PG自身的信號(hào)肽[20,27]，而是利用大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pHT43及其本身含有的信號(hào)肽SamyQ構(gòu)建重組質(zhì)粒。圖1，為本研究構(gòu)建的重組質(zhì)粒pHT43：pro-mPG(P43)。

圖1 pHT43:pro-mPG(P43)重組質(zhì)粒圖Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmidpHT43:pro-mPG(P43)

1.2 PG基因的克隆菌和重組表達(dá)菌的轉(zhuǎn)化及鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果如圖2-a所示，泳道1為重組質(zhì)粒經(jīng)MluI酶切后得到的片段，其片段大小與預(yù)期的7 288 bp和1 827 bp相符。將疑似陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，與目的序列一致性為100%，證明成功構(gòu)建了PG基因的克隆菌株。同理，提取Top10克隆菌株的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，采用F2499/R3013引物對(duì)BL21轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖2-b所示，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照(重組質(zhì)粒)條帶大小一致，在1 300 bp附近有單一的特異性擴(kuò)增條帶，將PCR產(chǎn)物膠回收后并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，經(jīng)BLAST比對(duì)結(jié)果顯示一致性為100%，證實(shí)PG重組表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

a-pHT43：pro-mPG(P43)質(zhì)粒酶切b-陽(yáng)性菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a:M-1kbMarker，1-酶切后質(zhì)粒，2-未切割質(zhì)粒；b:M-100 bp Marker，1-陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物，2-陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D2 pHT43：pro-mPG(P43)克隆及PCR驗(yàn)證Fig.2 Verification ofpHT43:pro-mPG (P43) clone and recombinant transformant by PCR

1.3 pro-mPG的表達(dá)、純化及Western blot驗(yàn)證

對(duì)菌體破碎上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3-a所示，35 kDa上方出現(xiàn)一條帶，與DNAMAN軟件預(yù)測(cè)的pro-mPG分子量37.54 kDa相符，可能為成功表達(dá)的可溶性pro-mPG。鎳柱純化的結(jié)果如圖3-b所示，結(jié)果表明，蛋白可以被鎳柱吸附，在20 mM的咪唑下可被洗脫，且能夠與鼠抗組氨酸標(biāo)簽抗體特異性識(shí)別并產(chǎn)生免疫印跡，因此確認(rèn)該蛋白為pro-mPG。

a-pro-mPG的表達(dá)及純化b-Western blot驗(yàn)證圖a:1、2-重組菌全菌液，3-重組菌1的超聲破碎上清液，4～7-20 mmol/L咪唑洗脫液，8、9-250 mmol/L咪唑洗脫液；b:1、3-20 mmol/L咪唑洗脫液，2、4-250 mmol/L咪唑洗脫液，M-蛋白Marker圖3 菌體破碎液及鎳柱洗脫液中pro-mPG的SDS-PAGE圖及Western blot驗(yàn)證Fig.3 SDS-PAGE image and Western blot verification of pro-mPG in the disrupted cells and elute from nickel column

1.4 pro-mPG的消化及其產(chǎn)物分析

pro-mPG經(jīng)胰蛋白酶消化的結(jié)果如圖4-a 顯示，消化后出現(xiàn)兩條低分子量(約20、30 kDa)的條帶，與劉英杰報(bào)道的一致[28]。在消化時(shí)間0～50 min內(nèi)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，pro-mPG逐漸由37.54 kDa降解到20 kDa，且20 kDa處的條帶在消化10 min后灰度最深。該蛋白疑似為切割掉前導(dǎo)肽后的成熟PG酶(mPG)。酶活力測(cè)定結(jié)果表明消化10 min的PG酶活力最高為0.250 U/mL。消化10 min后的酶液經(jīng)鎳柱純化，得到單一條帶(圖4-b)，Western-blot分析發(fā)現(xiàn)該條帶同樣能與鼠抗His-tag產(chǎn)生特異性的免疫印跡反應(yīng)，確認(rèn)為mPG。

1.5 mPG的酶學(xué)性質(zhì)分析

圖5-a為不同pH條件下測(cè)定純化mPG酶活力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)pH 6.5時(shí)，酶活最高。不同溫度下的PG酶活力結(jié)果如圖5-b所示，在45 ℃條件下出現(xiàn)最高酶活力。且隨著溫度的升高，酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在70 ℃時(shí)幾乎喪失活性。

2.6 PG發(fā)酵條件優(yōu)化

2.6.1 不同碳源、氮源對(duì)工程菌產(chǎn)酶的影響

對(duì)照組采用粗酶液進(jìn)行測(cè)定，酶活力為0.417 U/mL，比純化的PG測(cè)得的酶活力高，這可能由于背景值較高以及谷氨酰胺添加的影響所致。由6-a可知，以蔗糖和麥芽糖為主要碳源的培養(yǎng)基產(chǎn)酶高于對(duì)照組，其中蔗糖組差異顯著(P<0.05)，最高酶活為0.490 U/mL，這可能是由于菌株對(duì)不同碳源的利用度不同導(dǎo)致產(chǎn)pro-mPG的量有差異。而以麥芽糖和淀粉為主要碳源的培養(yǎng)基對(duì)pro-mPG酶活力的影響不大，山梨糖醇和甘油對(duì)PG的酶活力的抑制作用顯著(P<0.05)。

a-胰蛋白酶消化pro-mPGb-消化產(chǎn)物Western blot分析a:M-蛋白Marker；1～6-胰蛋白酶消化不同時(shí)間(0、10、20、30、40、50 min)的pro-mPG；b:M-蛋白Marker 1、2-鎳柱純化后的mPG的SDS-PAGE圖，3、4-Western blot分析圖4 胰蛋白酶水解的pro-mPG的SDS-PAGE圖及Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE image and Western blot verification analysis of trypsin hydrolysis of pro-mPG

圖5 pH和溫度對(duì)PG酶活力的影響Fig.5 Effect of pH and temperature on PG activity

在以蔗糖為主要碳源的培養(yǎng)基中，考察不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖6-b所示，酵母浸粉對(duì)重組菌產(chǎn)酶影響顯著(P<0.05)，酶活在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高至0.603 U/mL。

a-碳源; b-氮源圖6 不同碳源和氮源對(duì)工程菌產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of different carbon and nitrogen sources on the pro-mPG production from engineering bacteria

2.6.2 金屬離子對(duì)工程菌產(chǎn)酶的影響

在上述最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上，考察不同濃度的金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖7所示，添加Mn2+和Ca2+均對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作用(P<0.05)，而K+、Ni2+和Mg2+對(duì)產(chǎn)酶的影響不顯著(P>0.05)，Cu2+和Fe2+的添加反而抑制了產(chǎn)酶。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的Ca2+培養(yǎng)基最高酶活力為0.760 U/mL，與對(duì)照組相比，提高了0.157 U/mL左右。

圖7 不同金屬添加量對(duì)工程菌產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of different metal additions on the production of pro-mPG from engineering bacteria

2.6.3 培養(yǎng)條件對(duì)pro-mPG酶活力的影響

25 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃、40 ℃條件下工程菌產(chǎn)PG的酶活力分別為0.333 U/mL、0.481 U/mL、0.623 U/mL、0.764 U/mL、0.640 U/mL，37 ℃為最適溫度，如圖8-a所示。不同pH條件下測(cè)得的酶活力差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明pH對(duì)工程菌產(chǎn)PG影響較小，如圖8-b所示。

圖8 溫度和pH對(duì)工程菌產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of temperature and pH on the production of pro-mPG from engineering bacteria

3 討論

目前PG已作為國(guó)家批準(zhǔn)的食品添加劑[29]，其生產(chǎn)來(lái)源仍然依賴解脘金黃桿菌[16]，但是該原始菌發(fā)酵產(chǎn)酶量少，限制了該酶的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。現(xiàn)有的工程菌過(guò)表達(dá)PG的研究，大多采用IPTG作為誘導(dǎo)劑[30]。但I(xiàn)PTG價(jià)格較昂貴，且對(duì)微生物和人體有一定毒性，故減少或避免其使用對(duì)食品酶的表達(dá)有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此，本研究采用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子P43代替pHT43本身的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pgrac，利用細(xì)菌的群體感應(yīng)表達(dá)PG，不使用IPTG，提高了目標(biāo)酶在食品中應(yīng)用的安全性。

由于PG在植物蛋白脫酰胺方面有良好的應(yīng)用前景，近年來(lái)，重組表達(dá)PG的相關(guān)研究已有一些進(jìn)展，如汪正華等[15]誘導(dǎo)表達(dá)了包涵體形式的mPG，再經(jīng)變性、復(fù)性處理后測(cè)得酶活力為0.371 U/mL。劉英杰[28]構(gòu)建的pHT43-pp/Bacillussubtilis168和pHT43-pp/BacillussubtilisDB403，在IPTG誘導(dǎo)下均可表達(dá)mPG，最終在濃縮發(fā)酵胞外液中獲得約0.700 U/mL的酶活，其菌株產(chǎn)酶量為36.84 mg/mL。本文構(gòu)建的表達(dá)菌株菌體上清液純化后質(zhì)量濃度為181.68 μg/mL，根據(jù)濃縮倍數(shù)計(jì)算出發(fā)酵液中酶量為47.19 mg/mL，比上述報(bào)道高10.39 mg/mL。盡管產(chǎn)酶量有一定的提高，但未實(shí)現(xiàn)胞外的可溶性表達(dá)。另外，本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的酶仍需要通過(guò)外界酶進(jìn)行加工，才可以釋放有活性的PG。因此，建立高效表達(dá)PG的體系是實(shí)現(xiàn)PG大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)，也是今后的研究重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子P43與pro-mPG序列連接成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT43：pro-mPG(P43)，通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法成功獲得BL21陽(yáng)性工程菌，經(jīng)PCR和基因測(cè)序驗(yàn)證正確。經(jīng)Western blot驗(yàn)證和酶活性測(cè)定，證明菌體在發(fā)酵生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期可通過(guò)群體感應(yīng)自誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，避免了IPTG的使用。通過(guò)對(duì)LB培養(yǎng)基中碳源、氮源的替換以及金屬離子的添加，將酶活力由0.417 U/mL提高至0.761 U/mL。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，酶最適反應(yīng)條件為45 ℃、pH 6.5。