西瓜枯萎病拮抗菌株的篩選與鑒定

高葦 楊利娟 劉春艷 張春祥 王勇

摘 要：為了從豐富的土壤微生物資源中挖掘對西瓜枯萎病有較高防效的生防菌株，通過梯度稀釋和平板涂布法分離獲得西瓜根際土壤主要細菌，采用平板對峙培養和測定盆栽防效的方法，從中篩選出對西瓜枯萎病有較強拮抗活性的菌株，并通過菌落形態觀察、生理生化鑒定、16S rDNA和gyrA基因序列比對獲得生防菌株的分類地位。結果表明，從8份西瓜根際土壤中分離純化到182個細菌單菌落，并篩選獲得對西瓜枯萎病防效較高的3株拮抗細菌，接種30 d后盆栽防效均高于75%，與30%噁霉靈水劑防效無顯著差異。綜合形態特征、生理生化特性及序列分析結果，明確拮抗菌株JHXG0406為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis），拮抗菌株JHXG0221和XQXG0111為解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。獲得了3株對西瓜枯萎病有較好防效的菌株，具有作為生防菌劑開發應用的潛力。

關鍵詞：西瓜;枯萎病;拮抗細菌;防治效果;鑒定

中圖分類號：S651+S436.5 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）01-019-05

Screening and identification biocontrol strain to watermelon Fusarium wilt

GAO Wei， YANG Lijuan， LIU Chunyan， ZHANG Chunxiang， WANG Yong

（Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China）

Abstract： The efficient antagonistic bacteria against watermelon Fusarium wilt were screened from rhizosphere soil. The bacteria in rhizosphere soil of watermelon were isolated by gradient dilution and spread， and antagonistic strains against watermelon Fusarium wilt were screened by confront culture and pot experiment. The taxonomic status was determined by colony morphology， physiological and biochemical identification， and 16S rDNA and gyrA gene sequencing. 182 bacterial colonies were isolated and purified from 8 watermelon rhizosphere soils. Three antagonistic strains with high control effect against watermelon Fusarium wilt were obtained. The control efficacy of three strains were above 75%， with no significant difference to 30% oxamyl aqueous solutions.The antagonistic JHXG0406 strain was identified as Bacillus subtilis， JHXG0221 and XQXG0111 were identified as Bacillus amyloliquefaciens. Three strains against watermelon Fusarium wilt were obtained in this study， which have potential as biocontrol agent for application.

Key words： Watermelon; Fusarium wilt; Antagonistic bacteria; Control efficiency; Identification

西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）侵染所引起的、發生在西瓜上的病害，也是世界性范圍的病害，一旦發生，很難防治，且隨著栽培年限的增加逐年加重[1]。我國是世界上最重要的西瓜生產國和消費國[2]。近年來，隨著設施栽培的迅速發展和優勢產區的連年種植，連作障礙日益嚴重，西瓜枯萎病發病率不斷升高，對西瓜產量和品質造成了極大的影響，限制了西瓜產業的可持續發展[3-4]。選育應用抗枯萎病的西瓜品種是西瓜枯萎病最安全有效的防控途徑，但目前仍未發現對西瓜枯萎病免疫的西瓜種質資源[5-6]。砧木嫁接是生產上防治枯萎病的有效途徑，但嫁接栽培后，西瓜品質受到明顯影響[7-8]。化學防治對西瓜枯萎病防效低，極易產生抗藥性，且造成環境污染和食品安全等問題，導致化學農藥在西瓜枯萎病防治上的應用逐漸被弱化[9-10]。

以微生態調控為基礎的土傳病害生物防治具有安全、無污染等優點，在生產中日益受到重視。從根際土壤中分離出大量的拮抗菌株，將其定殖于寄主植物根際，維持根際周圍有益微生物菌群數量，可有效干擾病原菌的定殖侵染，是枯萎病等土傳病害有效防控的主要途徑[11]。關于西瓜枯萎病拮抗菌株的篩選應用已有大量研究報道[11-19]，但由于其生產應用防效不理想，西瓜枯萎病的生物防控還未得到種植者的廣泛認可。因此，篩選挖掘西瓜枯萎病有效生防資源，獲得拮抗菌株抑制作用的準確評價應用是目前首要解決的關鍵問題。筆者旨在篩選對西瓜枯萎病病原具有較高防效的生防細菌，為生防菌制劑的開發利用提供充分的菌株資源。通過平板對峙培養和盆栽活體試驗從西瓜根際土壤中篩選對西瓜枯萎病具有較強防效的拮抗菌株，并對其進行生理生化特性和分子鑒定，以期為西瓜枯萎病的有效控制提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

西瓜枯萎病病原菌XGKW01（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）由天津市植物保護研究所種苗病害研究室保存。拮抗菌株來源：從土壤中分離純化獲得182株菌株。西瓜品種為‘京欣一號，是北京市農林科學院蔬菜研究中心選育的早熟品種。對照藥劑為30%噁霉靈水劑，由山東省青島潤生農化有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 拮抗細菌分離與初篩 2017年4—6月從天津市西青、靜海等西瓜種植地采集健康植株根際土壤樣品8份，每份樣品不少于50 g，將采集的土壤樣品保存于天津市植物保護研究所種苗病害研究室，4 ℃冷藏箱中保存備用。

土壤根際細菌的分離純化：將采集的土樣放入盛有250 mL無菌水的三角瓶中，28 ℃ 120 r·min-1搖床震蕩1 h使其充分混勻后，靜置15 min，取上清液稀釋105、106和107倍，每個稀釋度取50 μL稀釋液在NA平板上涂布，28 ℃恒溫培養箱中培養48 h。48 h后挑取形態不同的單菌落，試管純化待用。

采用平板對峙培養法測定土壤中分離的182株菌株對西瓜枯萎病菌的抑制作用。在PDA平板中央接種直徑為4 mm的病原靶標菌株XGKW01，分離純化的細菌劃線接種在距XGKW01菌株20 mm的左右2點，每皿接種2個供試細菌，以不接種細菌的XGKW01平板為空白對照。25 ℃恒溫培養箱中培養5 d后，采用十字交叉法測量對照靶標病原XGKW01的菌落生長直徑及對峙培養平板的菌落直徑，并計算抑菌率。采用SPSS 19.0軟件鄧肯氏新復極差法對不同菌株對XGKW01的抑菌率進行統計分析。

抑菌率/%=

[對照病原菌菌落直徑-病原菌菌落直徑對照病原菌菌落直徑]×100

1.2.2 拮抗細菌對西瓜枯萎病苗期防效測定 將初篩獲得的16株對XGKW01抑菌率大于50%的菌株進行苗期盆栽試驗。西瓜種子催芽后播種于營養缽（口徑7 cm×高7 cm）中，每個營養缽中2株西瓜苗，在2～3片真葉期（2017年10月11日），選取長勢一致的西瓜苗進行盆栽接種試驗，試驗在天津市農科院武清創新基地植保所設施溫室中進行。試驗設18個處理，其中1至16號處理為拮抗菌株灌根處理，將各處理西瓜苗采用灌根法接種10 mL濃度為108 cfu·mL-1拮抗菌株菌懸液;17號處理為藥劑對照處理，灌根施用10 mL 30%噁霉靈水劑1 000倍液;18號為清水對照處理。每個處理3次重復，每次重復20株幼苗。各處理灌根接種拮抗菌株和化學藥劑2 h后，將其分別灌根接種10 mL 106個孢子·mL-1的XGKW01孢子懸浮液。接種 15 d（10月26日）和30 d（11月10日）后調查各處理西瓜病情指數[12]，獲得數據采用Excel 2007軟件計算防效，利用SPSS 19.0軟件采用鄧肯氏新復極差法對不同處理間的防效差異進行統計分析。

1.2.3 拮抗菌株的鑒定 對篩選獲得的西瓜枯萎病拮抗菌株進行形態學觀察、生理生化和分子生物學鑒定。將菌株于NA培養基上劃線培養，28 ℃恒溫培養24 h后，參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行生理生化測定[13]。提取拮抗菌株的基因組DNA采用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根DP302），采用細菌16s rDNA通用引物（16s-27F/ 16s-1492R）和gyrA基因序列擴增引物（gyrA-f/ gyrA-r）對提取的拮抗菌株DNA進行PCR擴增[14]，擴增獲得的產物由蘇州金唯智生物科技有限公司測序，測序結果在NCBI中進行Blast比對，并選取相似性較高的菌株，利用MEGA 6.06軟件采用鄰接法（Neighbour-Joining， NJ， bootstrap 1000）進行序列同源性分析，明確篩選到的拮抗菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選

從西瓜種植地采集的8份未發病的西瓜根際土壤中分離純化得到182個細菌單菌落，其中從靜海地區采集5份土樣，分離得到143個細菌菌落;從西青區采集3份土樣，分離得到39個細菌菌落。將分離得到的182個菌落分別與西瓜枯萎病病原菌在PDA平板上對峙培養后，篩選到16株菌株，對西瓜枯萎病菌菌絲生長的抑菌率均高于50%，其中菌株JHXG0316的抑菌率最高，為63.98%（表1）。

2.2 拮抗細菌對西瓜枯萎病的苗期防效測定

在西瓜2～3片真葉期采用苗期盆栽接種試驗評價拮抗菌株對西瓜枯萎病的防治效果。由表2可知，接種處理15 d后，清水對照的西瓜苗發病明顯，出現葉片萎蔫、枯萎等癥狀，病情指數達到30.00;而各拮抗菌劑處理的西瓜苗，病情指數為5.00～10.83，明顯低于清水對照，其中拮抗菌株JHXG0221處理的防效為83.33%，顯著高于其他拮抗菌劑處理，且與對照藥劑30%噁霉靈水劑1 000倍液處理無顯著差異;拮抗菌劑JHXG0406和XQXG0111處理的防效為80.56%和81.94%，與對照藥劑處理無顯著差異。接種處理30 d后，清水對照處理的西瓜枯萎病病情指數上升為51.25，其他各處理發病程度緩慢，病情指數擴展為10.42 ～23.75，拮抗菌株JHXG0221、JHXG0406和XQXG0111處理的防效為79.67%、77.24%和77.24%，與對照藥劑處理無顯著差異。因此，篩選到的拮抗菌株JHXG0221、JHXG0406和XQXG0111在使用濃度為108 cfu·mL-1條件下對西瓜枯萎病具有顯著的防治效果。

2.3 拮抗菌株的鑒定

拮抗菌株JHXG0221、JHXG0406和XQXG0111在NA培養基上培養24 h后，其單菌落圓形隆起，邊緣整齊，乳白色不透明，菌株JHXG0221和XQXG0111菌落邊緣有褶皺，JHXG0406菌落邊緣相對光滑。由表3可知，3株菌株均為革蘭氏陽性菌株，能夠水解淀粉和明膠，可以利用精氨酸，可以還原硝酸鹽，接觸酶反應、V-P試驗均為陽性。其中，JHXG0221和XQXG0111菌株不能利用檸檬酸鹽和賴氨酸，氧化酶反應為陽性，甲基紅反應、吲哚試驗為陰性;而菌株JHXG0406能夠利用檸檬酸鹽和賴氨酸，氧化酶反應為陰性，甲基紅反應和吲哚試驗為陽性。

以3株拮抗菌株基因組DNA為模板，對其16s rDNA進行PCR擴增，均獲得1.1 kb左右條帶，測序后獲得的堿基序列在GenBank進行比對分析，可將其確定為芽胞桿菌屬（Bacillus sp.）菌株。對3株菌株的gyrA基因進行擴增，獲得1 kb左右片段，基于測序后獲得的各菌株gyrA基因序列構建系統發育樹（圖1），發現菌株JHXG0221和XQXG0111與解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens（EF026702和HE617159）同屬于一個遺傳分支，同源性在97%以上，鑒定其為解淀粉芽胞桿菌;菌株JHXG0406和枯草芽胞桿菌B. subtilis（AY663693）同屬于一個遺傳分支，序列同源性達97%，鑒定為枯草芽胞桿菌。

3 討論與結論

芽胞桿菌是植物病害主要的生防菌株，在土傳病害生物防治中得到廣泛的開發利用[15]。目前，研究獲得的對西瓜枯萎病病原具有較強抑制作用的生防芽胞桿菌主要包括枯草芽胞桿菌（B. subtilis）、解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）、甲基營養型芽胞桿菌（B. methylotrophicus）、死谷芽胞桿菌（B. vallismortis）、多黏類芽胞桿菌（B. polymyxa）和蠟樣芽胞桿菌（B. cereus）等[16-19]。篩選獲得的許多拮抗菌株在室內與病原相互作用時雖然表現出較強的抑制作用，但實際應用中由于受到土壤條件、溫濕度差異等環境因素的影響，其防效大大降低，因此拮抗菌株資源的儲備與篩選在生物菌劑的開發應用中具有重要意義。筆者通過離體對峙培養和活體苗期試驗綜合篩選評價菌株對病原的抑制作用，獲得對西瓜枯萎病防效高、持效期長的3株菌株。其中，解淀粉芽胞桿菌JHXG0221和XQXG0111施用30 d后，對西瓜枯萎病的防效為79.67%和77.24%，高于已登記的解淀粉芽胞桿菌B1619的防效[16];枯草芽胞桿菌JHXG0406對西瓜枯萎病的防效為77.24%，高于已登記的枯草芽胞桿菌可濕性粉劑（保定市科綠豐生化科技公司產品）的防效[20]。因此，筆者獲得的3株菌株對西瓜枯萎病的防效較高，具有作為生防制劑產品開發的潛力，為西瓜枯萎病的生物防治工作的開展奠定了基礎。后續將開展系統的田間試驗，明確生防菌劑的田間應用劑量、時期及防治效果，通過深入研究生防菌的定殖力、抗病促生等作用機制，指導田間應用，為西瓜枯萎病的生物防治提供新的生防資源與技術支撐。

筆者從西瓜根際土壤中篩選獲得3株對西瓜枯萎病具有較強拮抗作用的菌株，經形態特征觀察生理生化測定及16S rDNA和gyrA基因序列比對，明確獲得的拮抗菌株JHXG0221和XQXG0111為解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens），JHXG0406為枯草芽胞桿菌（B. subtilis），其對西瓜枯萎病的防效與化學藥劑相當，具有作為生物菌劑開發應用的潛力。

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