辣椒Capsicum annuum×Capsicum chacoense種間雜種的創制及鑒定

鐘洋敏 柴松琳 程遠 阮美穎 王榮青 葉青靜 姚祝平 周國治 萬紅建

摘 要：遠緣雜交是導入外源有效基因的主要途徑之一，種間雜交是拓寬辣椒栽培種遺傳基礎和創制種質資源的有效方式。為了拓寬栽培辣椒的遺傳基礎，增強遺傳潛力，以辣椒栽培種Capsicum annuum ‘PI194879為母本、野生種C. chacoense ‘PI639651為父本進行雜交試驗，通過形態學觀察、花粉育性觀察和SSR分子標記分析對種間雜種F1的真實性進行鑒定。結果表明：（1）種間雜種F1表型性狀與雙親有較大差異，多介于雙親之間;（2）種間雜種F1花粉活力僅為6.58%，遠低于母本的97.08%和父本的94.51%;（3）SSR分子標記擴增結果顯示，5對引物擴增的雜種F1譜帶既有父本的特征帶，又有母本的特征帶，呈共顯性，進一步在分子水平上證明了雜種F1的真實性。獲得的C. annuum和C. chacoense種間雜種不僅拓寬了栽培辣椒的遺傳多樣性，而且為利用野生辣椒C. chacoense的優異基因來改良栽培辣椒提供了理論依據。

關鍵詞：辣椒;種間雜交;表型性狀;SSR

中圖分類號：S641.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）01-024-05

Creation and identification of interspecific hybrids between Capsicum annuum and Capsicum chacoense

ZHONG Yangmin1，2， CHAI Songlin2， CHENG Yuan2， RUAN Meiying2， WANG Rongqing2， YE Qingjing2， YAO Zhuping2， ZHOU Guozhi2， WAN Hongjian2

（1. College of Horticulture， Northwest A & F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. Institute of Vegetable， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310021， Zhejiang， China）

Abstract： Distant（Interspecific and Intergeneric）hybridization is an important method for introducing exogenous elite genes into cultivated crops. In pepper， interspecific hybridization is an efficient way to broad genetic basis of cultivated species and develop the excellent germplasm. In order to expand the genetic basis of cultivated pepper and further enhance genetic potential， interspecific hybrid F1（Capsicum annuum ×C. chacoense） was created with cultivated species（C. annuum ‘PI194879-female） and wild species（C. chacoense ‘PI639651-male） in this study. To identify the authenticity of interspecific hybrids， analysis of morphological observation， pollen viability and SSR molecular markers were employed on hybrid F1 and their parents. Our results showed that（1） remarkable difference was found in agronomic traits between hybrid F1 and their parents， and majority of phenotypic traits of hybrid F1 presented intermediate values，（2）the pollen viability of interspecific hybrid F1（6.58%） was less than that of female（97.08%） and male（94.51%）， and（3） analysis of SSR markers clearly indicated that interspecific hybrid F1 had bands from the paternal and maternal accessions， which confirmed that F1 hybrid was authenticity. Here， interspecific hybrids between C. annuum and C. chacoense will not only expand genetic diversity of cultivated pepper， but also provide the basis for transferring excellent genes from C. chacoense into cultivate pepper.

Key words： Pepper; Interspecific hybridization; Morphological descriptors; SSR

辣椒是我國重要的蔬菜作物，起源于美洲熱帶地區，屬于茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum），為一年生或多年生草本植物，在全球范圍內廣泛種植[1]。辣椒栽培種、野生種的種類繁多[2]，包括5個栽培種（C. annuum、C. baccatum、C. chinense、C. frutescens、C. pubecens）和20多個野生種[3]。其中，一年生栽培辣椒（C. annuum）是我國種植面積最廣泛、品種類型最豐富的栽培種[4]，它在果實大小、形狀、氣味和顏色上與其他4個栽培種存在明顯的遺傳差異。然而，在高強度的人工選擇壓力下，C. annuum遺傳基礎漸趨狹窄，遺傳多樣性指數逐漸降低，阻礙了辣椒新品種培育的進程[5]。

多年生野生辣椒在自然選擇的長期影響下形成了極其豐富的變異類型，遺傳方面未受到人工選擇的影響，許多特異性狀沒有因為人工選擇而丟失，如抗病、抗逆和廣適應性等，這些性狀對擴大栽培辣椒的遺傳基礎具有重要意義。此外，野生辣椒也是辣椒系統發育和演化的研究載體之一，是辣椒生產可持續發展的重要遺傳基礎。辣椒屬野生種C. chacoense主要分布于南美洲，其優良特性可改良栽培品種，如抗瘡痂病、抗煙草花葉病毒（TMV）、耐熱性好、連續坐果率高等，其植株矮小，株高60～90 cm，果小，果實縱徑8～14 mm[6-7]。因此，利用C. chacoense創制種間雜種不僅能擴大栽培辣椒的遺傳基礎，而且可以將其進一步應用于辣椒品種改良。

植物種間雜交是遠緣雜交的方式之一，可以拓寬栽培種的遺傳基礎，創制新的種質資源，加快新品種的培育進程[8]。20世紀50年代以來，國內外學者就辣椒種間雜交技術開展了大量研究，獲得了種間雜種[9-11]。筆者以栽培種C. annuum ‘PI194879為母本、野生種C. chacoense ‘PI639651為父本進行種間雜交試驗，對獲得的種間雜種F1及其親本植株進行形態學觀察、花粉育性觀察和分子標記分析。研究結果將為深入開展辣椒種間優異基因的轉移與新材料的創制提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為栽培種C. annuum ‘PI194879和具有多種優良性狀的野生種C. chacoense ‘PI639651，兩者均引自美國國家種質資源實驗室。上述材料均由浙江省農業科學院蔬菜研究所經過多代自交保存。

1.2 方法

1.2.1 種間雜種F1的創制 試驗在浙江省農業科學院蔬菜所（楊渡科研創新基地）進行。2019年3月4日，將辣椒材料播種于72孔穴盤內，待幼苗生長至5葉1心時（2019年4月10日）定植于塑料大棚。試驗采用高壟覆膜栽培，雙苗定植，壟寬80 cm，株距45 cm。在開花盛期，以C. annuum ‘PI194879為母本（P1）、 C. chacoense ‘PI639651為父本（P2）進行雜交試驗，采用徒手旋花去雄法雜交后包上棉花防止傳粉，并掛牌標記，第2天上午重復授粉1次，50 d左右獲得成熟果實。為保證父本花粉的純度，在雜交前1 d的下午，用棉花包上次日要開放的花蕾，防止異交。同時，母本植株應盡量選擇生長健壯且無病蟲害的植株。

1.2.2 形態學觀察 2019年12月20日，將P1、F1和P2播種于浙江省農業科學院楊渡科研創新基地的塑料大棚內，2020年3月18日定植。隨機選取雙親及其雜種F1各8株進行形態學觀察，包括株高、始花節位、始花期、主莖色、莖絨毛、分枝性、葉柄長、葉縱徑、葉橫徑、葉形指數、葉色、花冠色、花徑、柱頭顏色、果梗長度、果縱徑、果橫徑、果形指數、果實朝向、青熟果色澤、老熟果色澤、果面光澤、單果質量共23個指標。其中葉形指數=葉縱徑/葉橫徑，果形指數=果縱徑/果橫徑，具體參照辣椒種質資源描述規范和數據標準[12]進行。

1.2.3 花粉育性觀察 利用醋酸洋紅染色法對辣椒雜種F1及其親本植株的花粉進行染色，并用顯微鏡觀察花粉活力。在辣椒的盛花期，隨機采集上午8：00—10：00的雜種F1及其親本花3朵，取少量花粉置于載玻片上，加1～2滴醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片染色20 min后吸去多余染液在顯微鏡下觀察，每朵花鏡檢5個視野，3次重復，統計花粉活力，取其平均值。

1.2.4 分子標記分析 辣椒DNA提取：采集父母本及F1新鮮幼嫩葉片50 mg，參照Paterson等[13]改良CTAB法提取DNA，用1% （m/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，并用超微量核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度，將DNA質量濃度稀釋至20～30 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存備用。

SSR標記分析：選用多態性好、條帶清晰穩定的40對SSR引物對P1、F1和P2進行SSR分子標記分析。SSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系為10 μL，其中，2×T5 Super PCR Mix（PAGE） 5 μL，正反引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 2 μL。Mix和Marker均購自北京擎科新業生物技術有限公司，PCR擴增程序為： 94 ℃ 3 min，30個循環（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）， 72 ℃ 5 min，然后4 ℃保存。采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察PCR結果，電泳緩沖液為0.5×TBE，在180 V、150 mA、50 W恒壓下電泳2.5 h。銀染方法：①電泳結束后取出凝膠用無菌水漂洗1次。②將凝膠放入硝酸銀（0.1%，m/V）染色液中搖床染色20 min，染色完成后無菌水漂洗凝膠3次。③加入由氫氧化鈉（1.5%，m/V）、硼砂（0.1%，m/V）和甲醛（0.4%，φ）組成的顯影液顯色3～5 min（搖床上晃動至可見清晰條帶時停止顯色），顯色完成后無菌水漂洗凝膠2次。④撈出包膠并拍照保存。

2 結果與分析

2.1 種間雜種F1的獲得

在浙江省農業科學院楊渡科研創新基地的自然條件下，C. annuum ‘PI194879和 C. chacoense ‘PI639651均能正常開花結果，經人工去雄雜交，雜交33朵花，授粉后50 d左右成功獲得5個F1成熟果實，種間雜交坐果率為15.2%。共得到26粒F1種子，種子飽滿度不一改，F1發芽率38%。

2.2 形態學觀察

對得到的種間雜種F1代植株及其雙親進行田間農藝性狀調查，發現雜種F1表型性狀與雙親有較大差異，多介于雙親之間（圖1～2，表1）。其中始花節位、葉縱徑、葉橫徑、花徑、果梗長度、果縱徑、單果質量都介于雙親之間，初步表明所獲雜種F1是真實的雜交種。

2.3 花粉育性觀察

利用醋酸洋紅染色法，對雙親和F1的花粉進行染色。通過顯微鏡觀察發現，雜種F1平均花粉可染率為6.58%，而親本C. annuum ‘PI194879和C. chacoense ‘PI639651的花粉可染率分別為 97.08%和 94.51%（圖3）。雜種F1的花粉可染率明顯低于雙親。

2.4 SSR分子標記分析

SSR分子標記具有多態性高、重復性好、共顯性等特點，常被用來鑒定雜種的真實性。利用40對SSR引物對父母本及雜種F1進行擴增，其中5對引物（Primer ID：3-11、4-20、5-17、11-4、12-13）在F1雜種中均擴增出2條帶，分別表現為父母本的特征帶，擴增條帶表現為雙親互補型，即在分子水平上證明了辣椒種間雜種的真實性（表2，圖4）。

3 討論與結論

具有高度抗逆境和抗病蟲害脅迫能力的作物野生近緣種常在育種中被作為優異性狀的變異來源[14-15]。1997年，據國際水稻研究所報道[16]，印度、泰國、菲律賓等國將Xa21基因（來源于非洲的長雄蕊野生稻）成功轉入栽培稻中，培育出高產且具白葉枯病廣譜抗性的品種，如‘Swarna‘Triguna‘Mahsuri‘Khao Dak Mali‘Pusa Basmati-1‘PR106等;2003年，謝一芝等[17]將甘薯栽培種與不同倍性的野生種I. trifida雜交，選育出高產抗病、抗逆性強、適應范圍廣的甘薯品種‘蘇渝303。這些研究結果證實了野生近緣種中的優良性狀已經在作物栽培種中得到廣泛的利用。

辣椒為茄科辣椒屬作物，該屬具有5個栽培種和20多個近緣野生種[3]。與辣椒栽培種相比，野生種在植株形態、葉片、花和果實等性狀上表現出極豐富的多樣性[18-20]。由于長期的人工選擇，辣椒栽培種的遺傳基礎日趨狹窄，因此，將野生種的優異基因轉移到栽培種中對辣椒新品種的選育具有重要意義。辣椒野生種C. chacoense具有抗煙草花葉病毒（TMV）、抗瘡痂病、耐熱性好、連續坐果率高等優良特性[6]。筆者以栽培種C. annuum ‘PI194879為母本、野生種C. chacoense ‘PI639651為父本進行種間雜交，創制種間雜種F1，結果可為通過有性雜交轉移野生種C. chacoense優異基因提供“橋梁”。

前人研究發現，與親本相比，作物種間雜種F1的花粉活力普遍較低。例如，1990年，王志寧等[21]發現棉屬三元和四元種間雜種的花粉活力低于雙親;2012年，王雪芬等[22]測定了南瓜屬種間雜種后代的花粉活力，結果顯示雜種F1的花粉活力為28.0%，低于母本材料的72.8%和父本材料的65.2%;2019年，Martin等[23]觀察了亞麻薺屬（Camelina microcarpa×Camelina sativa）種間雜種及其親本的花粉活力，分別為1.3%～45%、97%和90%。筆者對辣椒種間雜種F1的花粉育性進行觀察，發現其花粉活力僅為6.58%，遠低于父母本的94.51%和97.08%。這與大多數作物種間雜種F1花粉活力低于親本的情況相似。低花粉活力將直接影響F1植株產生后代的能力，為此，研究者對辣椒種間雜種F1的生殖特性進行了研究，推測可能與授粉受精時染色體易位或細胞在減數分裂過程中的異常有關[24-26]。因此，研究者通常使用秋水仙堿誘導F1植株進行染色體加倍，進一步提高花粉活力，從而增強F1植株的授粉受精能力[27]。此外，還可以采用回交法恢復雜種花粉活力，從種間雜種后代中篩選花粉活力有所恢復的單株，逐代提高雜種后代的育性[22]。

利用遠緣雜交，向栽培種C. annuum中轉移野生種的優異性狀是辣椒種質創新的重要方法。筆者以C. annuum ‘PI194879為母本、C. chacoense ‘PI639651為父本，開展了C. annuum與C. chacoense 種間雜交并成功獲得種間雜種F1，為進一步對C. chacoense優異基因的鑒定與轉移、新材料創制奠定了基礎。

參考文獻

[1] WAHYUNI Y，BALLESTER A R，TIKUNOV Y，et al.Metabolomics and molecular marker analysis to explore pepper（Capsicum sp.） biodiversity[J].Metabolomics，2013，9（1）：130-144.

[2] 賈豪，魏小春，姚秋菊，等.辣椒SSR標記種質資源遺傳多樣性的分析[J].分子植物育種，2017，15（1）：353-363.

[3] 覃成.基于栽培辣椒和野生辣椒的全基因組測序揭示辣椒屬的馴化與特異性[D].四川雅安：四川農業大學，2014.

[4] 陳學軍，方榮，周坤華，等.辣椒種質親緣關系的數量分類學研究[J].現代園藝，2009（8）：23-26.

[5] 魏家香，俞佳虹，程遠，等.辣椒種間雜交的現狀及其研究進展[J].分子植物育種，2018，16（16）：5474-5482.

[6] 孫潤生.辣椒種間雜交親和性研究及其雜種鑒定[D].南京：南京農業大學，2014.

[7] L?PEZ，P，GORZALCZANY S，ACEVEDO C， et al.Chemical study and anti-inflammatory activity of Capsicum chacoense and C. baccatum[J].Revista Brasilra De Farmacognosia，2012，22（2）：455-458.

[8] 魏家香.辣椒種間雜種創制、種間遺傳圖譜的構建和主要農藝性狀QTL定位[D].浙江金華：浙江師范大學，2018.

[9] 陳學軍，周坤華，方榮，等.辣椒C. frutescens×C. chinense種間雜種的獲得與鑒定[J].植物遺傳資源學報，2012，13（5）：907-911.

[10] 孫潤生，王述彬，刁衛平，等.辣椒C. annuum×C. chinense種間雜種的獲得及鑒定[J].華北農學報，2015，30（1）：158-161.

[11] 張凱，刁衛平，郭廣君，等.辣椒C. baccatum×C. frutescens種間雜種的獲得與鑒定[J].江西農業學報，2019，31（8）：1-5.

[12] 李錫香，張寶璽.辣椒種質資源描述規范和數據標準[M].北京：中國農業出版社，2006.

[13] PATERSON A H，BRUBAKER C L，WENDEL J F.A rapid method for extraction of cotton（Gossypium spp.） genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis [J].Plant Molecular Biology Reporter，1999，11（2）：122-127.

[14] REEM H，TOBY H.The use of wild relatives in crop improvement： a survey of developments over the last 20 years[J].Euphytica，2007，156（1/2）：1-13.

[15] OLIVIER H，HANS J，RAF A.Crop wild relatives： more common ground for breeders and ecologists[J].Frontiers in Ecology and the Environment，2012，10（3）：121-121.

[16] BRAR D S，KHUSH G S.Alien introgression in rice[J].Plant Molecular Biology，1997，35（1/2）：35-47.

[17] 謝一芝，吳紀中，戴起偉，等.甘薯近緣野生種資源的雜交親和性評價及利用[J].植物遺傳資源學報，2003，4（2）：147-150.

[18] ESHBAUGH W H.The taxonomy of the genus Capsicum（Solanaceae）[J].Journal of General Microbiology，1980，47（3）：153-166.

[19] SUDR? C P，GONCALVES L S A，RODRIGUES R，et al.Genetic variability in domesticated Capsicum spp. as assessed by morphological and agronomic data in mixed statistical analysis[J].Genetics and Molecular Research，2010，9（1）：283-294.

[20] THUL S T，LAL R K，SHASANY A K，et al.Estimation of phenotypic divergence in a collection of Capsicum species for yield-related traits[J].Euphytica，2009，168（2）：189-196.

[21] 王志寧，季道藩，許復華. 栽培棉種間二、三、四元雜種的研究Ⅱ.雜種F1減數分裂的染色體行為和花粉萌發率[J].浙江農業大學學報，1990，16（4）：35-40.

[22] 王雪芬，智海英，李永平，等.南瓜屬種間雜交后代花粉活力研究[J].天津農業科學，2012，18（5）：100-102.

[23] MARTIN S L，LUJAN-TORO B E，SAUDER C A，et al.Hybridization rate and hybrid fitness for Camelina microcarpa Andrz.ex DC（female） and Camelina sativa（L.） Crantz（Brassicaceae）（male） [J].Evolutionary applications，2019，12（3）：443-455.

[24] KUMAR O A，PANDA R C，RAJA R K G.Cytogenetic studies of the F1 hybrids of Capsicum annuum with C. chinense and C. baccatum [J].Theoretical and Applied Genetics，1987，74（2）：242-246.

[25] BARBARA P.Genetic resources and breeding of Capsicum spp. [J].Euphytica，1997，96（1）：129-133.

[26] MONTEIRO C E D S，PEREIRA T N S，CAMPOS K P D.Reproductive characterization of interspecific hybrids among Capsicum species[J].Crop Breeding and Applied Biotechnology，2011，11（3）：241-249.

[27] ANDERSON J A，MOUSSET-DE?CLAS C，WILLIAMS E G，et al.An in vitro chromosome doubling method for clovers（Trifolium spp.） [J].Genome，1991，34（1）：1-5.