誘餌受體3及腫瘤壞死因子配體相關分子1A在CD4和CD8雙陰性T細胞治療裸鼠胰腺癌種植瘤中的作用

陳炯 胡丕波 鄔高華 周海波

1安徽醫科大學附屬省立醫院普外科，合肥 230001；2中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)普外科，合肥 230001

近年來免疫療法成為癌癥治療手段中最有前景的方法之一，其中過繼免疫療法被認為可改善腫瘤治療效果。過繼免疫療法是通過體外大量擴增患者自身免疫細胞，然后回輸到體內，輔助人體原有的免疫系統，達到治療癌癥的效果[1-3]。雙陰性T細胞(double negative T cell，DNT細胞)是指CD3+CD4-CD8-T細胞，在人類自身免疫反應、移植排斥反應以及炎癥反應中均起到重要作用[4]。有研究發現DNT細胞同樣具有抗腫瘤作用[5]。誘餌受體3(decoy receptor 3, DcR3)是腫瘤壞死因子受體超家族成員，表達于多種免疫細胞，例如NK細胞、CD8+T細胞，可以與靶細胞表面的腫瘤壞死因子配體相關分子1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule 1A, TL1A)結合，輔助免疫細胞誘導靶細胞凋亡[6]。本研究構建胰腺癌裸鼠皮下種植瘤模型，靜脈輸注體外擴增的DNT細胞，觀察DNT細胞對胰腺癌種植瘤的治療效果，探討DcR3和TL1A在其中所起的作用。

材料與方法

胰腺癌細胞株SW1990購自中科院上海細胞庫，復蘇后采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液(美國Hyclone公司)培養于37℃、5%CO2培養箱中，2～3 d更換培養基，適時傳代。18只雄性BALB/c裸鼠購自上海史來克實驗動物公司，4～5周齡，體重20～22 g。所有裸鼠均飼養于無菌環境中。

按照抗體吸附法[7,8]分離提純DNT細胞。取健康志愿者外周血15 ml，加入CD4、CD8去除液各750 μl，室溫靜置20 min，將血液緩慢加入裝有15 ml淋巴細胞分離液(天津灝洋公司)的離心管中，保持液面界面，室溫下1 200 r/min離心20 min(離心半徑4 cm)。吸取中間白色云霧層細胞，兩次洗滌后以200 r/min離心5 min(離心半徑4 cm)，用RPMI1640培養液重懸細胞，將1×105/ml細胞加入到OKT3(美國 eBioscience公司)包被的6孔板中，依次加入2.5 μl IL-2和IL-4(美國 eBioscience 公司)后，置于37℃ 、5% CO2培養箱中培養，2～3 d更換培養液，適時傳代。12～13 d可收獲足量細胞，按課題組前期實驗方法[9]用流式細胞儀測定DNT細胞純度。

取對數生長期SW1990細胞，制成單細胞懸液(1.5×107/ml)，接種于裸鼠右側腋皮下(100 μl/只)，待腫瘤最大徑達0.5 cm時，將裸鼠隨機分為對照組、吉西他濱治療組和DNT細胞治療組，每組6只。對照組不做處理，吉西他濱治療組經鼠尾靜脈注射吉西他濱(50 mg/kg)，DNT細胞治療組經鼠尾靜脈注射DNT細胞懸液(1×108個細胞/ml，100 μl/只)。每天觀察小鼠狀況。飼養至第50天時頸椎脫位法處死裸鼠，取下種植瘤，測量體積和重量。腫瘤體積[V(cm)3]=1/2×長徑(cm)×短徑(cm) ×短徑(cm)。

取部分瘤組織剪碎，充分研磨，采用RIPA裂解液抽提細胞總蛋白，BCA法對蛋白濃度進行定量，調整濃度后常規行蛋白質免疫印跡法檢測DcR3和TL1A蛋白表達，以β-actin作為內參。DcR3、TL1A抗體購于英國Abcam公司，工作濃度均為1∶500。最后ECL發光，X線片曝光、顯影、定影。采用凝膠圖像軟件分析系統掃描，以目的條帶與內參條帶的灰度值比作為蛋白相對表達量。

將瘤組織充分剪碎研磨，加入1 ml Trizol(美國Thermo公司)，按照試劑盒說明書提取瘤組織總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。然后以cDNA為模板進行擴增，以GAPDH為內參，實驗重復3次。DcR3引物正向序列為5′-CAGACGTGCAACGACCTGAC-3′，反向序列為5′-TGGGACCTGCATCCTCAC-3′；TL1A引物正向序列為5′-CGGGGAGACGACCAAACAAG-3′，反向序列為5′-AAGGAGAACGTGGCCCCAAGGTA-3′；GAPDH引物正向序列為5′-CAAGGCTGTGGGCAAGGT-3′，反向序列為5′-GGAAGGCCATGCCAGTGA-3′。擴增參數為95℃預變性3 min，95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸40 s，循環40次。采用公式2-△△ct計算DcR3和TL1A mRNA的表達量。

取石蠟包埋的瘤體組織，切片，脫蠟水化，按照TUNEL凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司)說明書操作。滴加經過免疫染色洗滌液稀釋后的蛋白酶K(20 ng/ml)作用20 min，滴加免疫染色固定液固定30 min，滴加免疫染色強力通透液室溫靜置5 min。滴加TUNEL檢測液50 μl，37℃恒溫箱中靜置60 min，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，通過凋亡細胞半定量分析計算凋亡率。

結 果

DNT細胞從外周血中分離培養，細胞數量為1×105/ml，經過添加IL-2、IL4的培養液培養13 d左右，細胞數量達到5×106/ml，DNT細胞純度>90%。

DNT細胞治療組種植瘤體積和重量分別為(670.28±124.54)mm3、(225.60±10.76)mg；吉西他濱治療組分別為(604.60±179.16)mm3、(222.68±8.73)mg；對照組分別為(1738.80±391.39)mm3、(265.07±10.76)mg(圖1)。DNT細胞治療組和吉西他濱治療組的種植瘤體積、重量均小于對照組，差異有統計學意義(t值分別為6.37、7.17，6.45、7.49，P值均<0.01)，而DNT細胞治療組和吉西他濱治療組之間的種植瘤體積、重量的差異均無統計學意義(t值分別為0.74、0.60，P值分別為0.48、0.56)。

圖1 對照組(1)、DNT細胞治療組(2)和吉西他濱治療組(3)種植瘤標本

DNT細胞治療組、吉西他濱治療組、對照組DcR3蛋白表達量分別為0.56±0.02、0.57±0.03、0.39±0.04，DNT細胞治療組和吉西他濱治療組均高于對照組，差異均有統計學意義(t值分別為8.99、8.80，P值均<0.001)，而DNT細胞治療組和吉西他濱治療組間的差異無統計學意義(t=0.49，P=0.64)。DNT細胞治療組、吉西他濱治療組、對照組TL1A蛋白表達量分別為0.41±0.03、0.40±0.05、0.81±0.05，DNT細胞治療組和吉西他濱治療組均顯著低于對照組，差異均有統計學意義(t值分別為18.04、14.82，P值均<0.001)，而DNT細胞治療組和吉西他濱治療組間的差異無統計學意義(t=0.46，P=0.65，圖2)。

圖2 對照組(1)、DNT細胞治療組(2)、吉西他濱治療組(3)種植瘤組織DcR3、TL1A蛋白表達

DNT細胞治療組、吉西他濱治療組、對照組DcR3 mRNA的表達量分別為3.74±0.19、3.40±0.39、0.92±0.05，DNT細胞治療組及吉西他濱治療組均高于對照組，差異有統計學意義(t值分別為34.94、15.40，P值均<0.001)，而DNT細胞治療組和吉西他濱治療組間的差異無統計學意義(t=1.95，P=0.08)。DNT細胞治療組、吉西他濱治療組和對照組TL1A mRNA表達量分別為0.83±0.11、0.79±0.08、1.70±0.36，DNT細胞治療組及吉西他濱治療組均顯著低于對照組，差異均有統計學意義(t值分別為5.69、6.08，P值均<0.001)，而DNT細胞治療組和吉西他濱治療組間的差異無統計學意義(t=0.73，P=0.48)。

DNT細胞治療組、吉西他濱治療組和對照組的細胞凋亡率分別為(53.2±11.2)%、(56.2±8.6)%、(10.3±3.2)%，DNT細胞治療組和吉西他濱治療組的細胞凋亡率顯著高于對照組，差異均有統計學意義(t值分別為9.00、12.28，P值均<0.001，圖3)，而DNT細胞治療組和吉西他濱治療組間細胞凋亡率差異無統計學意義(t=0.52，P=0.61)。

圖3 對照組(3A、3B)、DNT細胞治療組(3C、3D)、吉西他濱治療組(3E、3F)細胞凋亡的明場圖(3A、3C、3E)及熒光(3B、3D、3F)對比圖(TUNEL，×100)

討 論

免疫治療是近年來逐漸走進人們視野的一種新型的治療方法，癌癥的過繼免疫治療更是引起了全世界研究者的廣泛關注，參與過繼免疫治療的各種人體免疫細胞被深入研究，其中調節性T細胞群在腫瘤免疫應答的調節中起到了關鍵作用。本課題組所研究的DNT細胞最初被發現也正是因為其參與了免疫應答的過程。人體中大多數T細胞都呈CD4和CD8陽性表達，兩種表面分子均呈陰性表達的T細胞僅占總細胞數的1%～5%。CD8陽性T細胞、NK T細胞以及γδ T細胞的抗腫瘤作用已經被廣泛研究[10-12]，然而關于DNT細胞在抗腫瘤中應用的報道較少，尤其是在實體腫瘤中的研究。本課題組采用目前最先進的抗體吸附法在體外擴增DNT細胞，并將其注射入胰腺癌細胞種植瘤裸鼠體內，結果發現DNT細胞可以顯著延緩胰腺癌種植瘤的生長，且DNT細胞治療組種植瘤細胞凋亡率較對照組明顯增高。更有意義的是，DNT細胞對胰腺癌種植瘤的治療效果與作為陽性對照組的臨床常用化療藥吉西他濱的差異并無統計學意義，提示將DNT細胞免疫治療胰腺癌用于臨床具有一定的可能性。

DNT細胞的抗腫瘤作用雖然被越來越多的學者關注，但是其具體機制尚不清楚。DcR3是腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族成員，它最初是在癌細胞中被發現。與大多數TNFR成員不同，DcR3缺乏跨膜結構域，且可在血清和細胞培養液中檢測到[13]。其配體TL1A同樣也是TNF超家族成員，由174個氨基酸構成，主要高表達于內皮細胞[14]。有研究報道DcR3-TL1A是一種新的免疫信號通路，它在炎癥性腸病、關節炎等疾病中發揮重要的作用[15]。本研究發現DcR3蛋白和mRNA在DNT細胞治療組的表達明顯高于對照組，而TL1A蛋白和mRNA的表達與DcR3表達情況相反，因此DNT細胞可能是通過上調胰腺癌細胞DcR3表達和下調TL1A表達來產生治療作用的。有研究指出TLIA蛋白可以提高T細胞免疫活性，從而進一步增強與靶細胞的免疫反應[16]。Chen等[17]也發現經過人工上調DcR3蛋白表達后，T細胞對胰腺癌的免疫治療作用明顯增加。本研究的結論與他們一致。另外，本研究發現DNT細胞對DcR3和TL1A調節能力與化療藥吉西他濱相似，兩者是否均通過介導DcR3-TL1A途徑抑制胰腺腫瘤生長有待進一步證實。

綜上所述，本研究證明了DNT細胞在體內對裸鼠胰腺癌種植瘤生長有明顯的抑制作用，其效果與臨床常用化療藥吉西他濱相似，DcR3-TL1A可能參與了DNT細胞的抑癌作用機制，這為DNT細胞過繼免疫治療胰腺癌的臨床應用提供了一定的實驗及理論基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突