基于網絡藥理學探析黃精干預認知障礙的可能機制▲

王 洋 李翠萍 趙紅曄 王璐璐 齊曉娟 周忠光

(1 齊齊哈爾醫學院生理教研室，黑龍江省齊齊哈爾市 161000，電子郵箱：Rachal830813@qq.com；2 黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱市 150040； 3 齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院婦科，黑龍江省齊齊哈爾市 161000； 4 齊齊哈爾醫學院解剖教研室，黑龍江省齊齊哈爾市 161000)

人口老齡化已經成為一個全球性問題[1]，人口結構的重大變化導致與年齡相關的疾病發病率急劇上升[2]。隨著年齡的增長，老年人的認知能力可以從正常的認知能力下降到主觀認知障礙，再由輕度認知障礙轉變為癡呆[3]。認知障礙給社會和公共醫療資源造成沉重負擔，而藥物是預防和治療認知障礙疾病的重要手段。中藥治療認知障礙是近年來研究的熱點[4]。黃精是百合科黃精屬植物，藥用部位為其干燥根莖。陶弘景的《名醫別錄》中記載了黃精，其歸肺、脾、腎經，是歷代健脾補腎、益氣滋陰的良藥[5]。黃精主要含甾體皂苷類、黃酮類、多糖、生物堿類及苯丙素類等成分，具有抗衰老、抗高血脂、保護神經系統、降血糖、保護心腦血管、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[6]。既往研究表明，黃精可通過調控神經細胞的凋亡、抗氧化、改善神經血管單元的微結構來影響神經系統的結構和功能，可用于治療相關神經系統疾病[7]，具有改善學習記憶等效果，但目前關于黃精能否用于防治老年癡呆及其改善認知功能障礙的有效成分、作用靶點與分子機制的研究較少見。

網絡藥理學是以系統生物學和多聚藥理學理論為基礎，利用網絡分析技術和網絡可視化揭示藥物、靶點和疾病之間復雜的生物網絡關系，預測藥理機制的新型研究模式[8]。網絡藥理學能夠檢測中藥活性成分的明確靶點并確定其功能[9]，使得中藥研究途徑由目前的“單一靶點、單一藥物”模式向新的“多靶點、多成分”模式轉變[10]。因此，本研究基于中藥網絡藥理學方法，篩選黃精治療認知障礙的生物活性成分，探討其可能的分子生物學機制。

1 材料和方法

1.1 黃精有效化合物的篩選 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；https://tcmspw.com/index.php)，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和藥物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18為閾值，篩選黃精的有效化合物。

1.2 黃精有效化合物靶點的篩選 通過TCMSP確認黃精有效成分對應的靶點。為全面預測靶點，采用SwissTargetPrediction數據庫(www.swisstargetprediction.ch)再次篩選，以補充有效化合物靶標。將TCMSP數據庫與SwissTargetPrediction數據庫預測結果進行比對，去重復值，并通過UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)進行標準名稱規范化處理。

1.3 認知障礙疾病相關靶點的預測 以“cognitive impairment”“mild cognitive impairment”“dementia”“Alzheimer′s disease”為檢索詞，分別從Therapeutic Target Database (TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、OMIM(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫獲取相關靶標，刪除重復靶點，獲得認知障礙疾病相關靶點。

1.4 黃精與認知障礙疾病的共同靶點的篩選 將篩選出的黃精有效化合物靶點和認知障礙疾病相關靶點導入Venny 2.1平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/)，得到黃精與認知障礙疾病的共同靶點。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建和可視化分析 利用STRING 11.0平臺(https://string-db.org/)構建黃精與認知障礙疾病共同靶點的蛋白質與蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。選擇物種為“Homo sapiens”，設置置信度≥0.4，構建PPI網絡。利用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制可視化交互網絡，其中，使用“Network Analyzer”插件計算網絡拓撲參數，分別以靶點作用度值(Degree)和靶點互作綜合評分(Combined-Score)調節節點大小、邊的粗細及漸變顏色，繪制PPI可視圖形。利用Circular Genome Data Visualization平臺(http://circos.ca/)將黃精有效化合物與其靶點的映射關系進行可視化。

1.6 基因本體論和京都基因和基因組百科全書富集分析 針對黃精與認知障礙疾病的共同靶點，利用Metascape數據庫(https://metascape.org/)從細胞組分、分子功能、生物進程 3個層面進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，設置P<0.01，獲取分析結果后，輸入微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)在線繪圖，獲取可視化圖形。

2 結 果

2.1 黃精的有效化合物 通過TCMSP篩選出符合標準的黃精有效化合物共12個，各化合物的相關參數見表1。黃精有效化合物的2D分子結構圖見圖1。

表1 黃精有效化合物的相關參數

圖1 黃精有效化合物的2D分子結構圖

2.2 黃精有效化合物的靶點 通過TCMSP檢索共獲得黃精靶點114個。經SwissTargetPrediction數據庫預測，共獲得預測靶點123個。將兩個數據庫的檢索結果進行比對，去除重復靶點并根據UniProt數據庫校正后，共鑒定出141個黃精有效化合物的靶點。

2.3 認知障礙疾病相關靶點的預測結果 經TTD、DrugBank、GeneCards和OMIM數據庫預測，分別獲得141個、63個、1 185個、669個與認知障礙疾病相關的靶點，去除重復靶點后最終共獲得1 880個疾病靶點，見圖2。

圖2 4個數據庫所獲疾病靶點的韋恩圖

2.4 黃精與認知障礙疾病的共同靶點及其PPI網絡 利用Venny平臺對141個黃精有效化合物靶點與1 880個認知障礙疾病靶點取交集，篩選得到66個共同靶點，即為黃精干預認知障礙的重要靶點，見圖3。利用STRING 11.0平臺構建66個共同靶點的PPI網絡圖，得到66個節點和508條連線，如圖4。利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制可視化PPI網絡圖，中心節點是度值最大的靶點，節點隨著度值減小而變小且遠離中心，見圖5；根據靶點度值(Degree)排序，排名靠前的靶點包括蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)1、CASP3、TP53、JUN、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)A、β淀粉樣前體蛋白(amyloid beta precursor protein,APP)、PTGS2、CAT、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)14、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,mTOR)等，靶點具體信息見表2。篩選出的66個共同靶點共對應黃精中的8種有效化合物，利用Circular Genome Data Visualization平臺將黃精中的8種有效化合物與66個疾病靶點的映射關系進行可視化，Circos關系圖提示5，4′-二羥基黃酮、黃芩素、薯蕷皂苷元、β-谷甾醇募集到的靶點較多，見圖6。

圖3 黃精有效化合物靶點與認知障礙疾病靶點的韋恩圖

圖4 黃精有效化合物與認知障礙疾病共同靶點的PPI網絡圖

圖5 黃精干預認知障礙的靶點的可視化圖

表2 黃精干預認知障礙的重要靶點

圖6 黃精有效化合物與疾病靶點的Circos關系圖

2.5 GO功能富集分析 黃精干預認知障礙66個的靶點主要分布在突觸、分泌顆粒內腔、神經元投射區、細胞器被膜腔、線粒體包膜、軸突、富含Ficolin-1顆粒腔、胞質無核區域、核外圍、吞噬泡等部位，見圖7A；涉及的生物學進程包括細胞對氮化合物的反應、MAPK級聯反應正調控、突觸信號、老化、血液循環、神經元死亡、肽酰絲氨酸磷酸化、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、活性氧代謝過程調節等，見圖7B；涉及的分子功能包括神經遞質受體活動、蛋白域特異性結合、銨離子結合、氧化還原酶活性、蛋白質同源二聚活性、配體門控陰離子通道活性、磷酸酶結合、轉錄因子結合等，見圖7C。

圖7 黃精干預認知障礙的靶點的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 根據P<0.01的閾值篩選出排名前20的通路，見表3。主要包括癌癥通路、神經活性配體-受體相互作用通路、5 -羥色胺通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)-AKT信號通路、內分泌抵抗通路、可卡因成癮通路、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信號通路、帕金森病相關通路、催乳素信號通路、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號通路、核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)信號通路、血管平滑肌收縮相關通路、過氧化物酶體通路等通路。見表3。

表3 黃精干預認知障礙的靶點的KEGG通路富集分析結果(排名前20)

續表3

3 討 論

認知障礙在中醫學中屬于“癡呆”的范疇，主要表現包括語言錯誤、思維遲鈍、健忘等[4]。中國現存最早的醫學著作《黃帝內經》有類似癡呆癥狀的描述。唐代醫王孫思邈在《華佗神醫密傳》中首次提出“癡呆”之名。明代醫家張景岳在《景岳全書》中闡述了癡呆的病因病機，他提出該病由郁結、不遂、思慮、驚恐等病因積漸而成，臨床表現變化多端。清代醫家王清任在《醫林改錯·腦髓說》中指出，老年肝腎虧損、腦髓失充是本病的主要原因。故本病形成以年老腎衰，腎虛不能化精，髓海失充，以至髓不能養腦，腦失滋養枯萎，萎則神機不用而發為癡呆，亦可由痰瘀實邪痹阻腦絡，清竅失養所致。治療常以補腎填精、補益氣血治其本。黃精是臨床常用的滋腎填精中藥，也是治療癡呆類疾病方劑的首選藥材。

本研究共篩選出黃精有效化合物12個及其靶點141個，與1 880個疾病靶點取交集后獲得的66個共同靶點即為黃精干預認知障礙的重要靶點，以此建立了黃精有效化合物與疾病靶點的Circos關系圖，Circos關系圖提示5，4′-二羥基黃酮、黃芩素、薯蕷皂苷元、β-谷甾醇4種有效化合物募集到的靶點較多。其中，5，4′-二羥基黃酮屬于黃酮類化合物，黃酮類化合物通過與負責記憶的大腦細胞和分子結構相互作用及減少神經退化，可有效地逆轉與年齡相關的神經認知能力下降[11]。5，4′-二羥基黃酮具有很強的抗氧化、抗炎和信號通路調節作用，對PI3K/AKT和MAPK通路均有影響；同時能夠調控海馬區促生存轉錄因子和誘導特異性基因表達，可改善動物和人類年齡相關的認知功能衰退及神經退行性疾病，因此具有抗阿爾茨海默病的作用[12]。黃芩素也是黃精中重要的黃酮類化合物之一，其在體內外實驗中均表現出強大的神經保護作用[13]。有學者認為黃芩素重建突觸可塑性和改善認知功能的神經保護作用與激活PI3K和AKT磷酸化以及抑制糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)磷酸化有關[14-15]。薯蕷皂苷元可通過增強神經遞質5-羥色胺信號通路保護海馬免受炎癥損傷[16]，同時其也具有抗氧化能力和抑制淀粉樣低聚物形成的作用[17]。β-谷甾醇治療可減輕APP/早老素基因1雙轉基因小鼠的認知缺陷和防止β淀粉樣蛋白的沉積[18]。

PPI網絡中，按度值大小排序，排在前面的靶點為AKT1、APP、MTOR、VEGFA、MAPK14等，其也是黃精干預認知障礙的關鍵靶點。AKT1是3種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2、AKT3)之一，其可調節凋亡平衡，從而抑制促凋亡細胞因子、激活抗凋亡細胞因子的活性，進而影響神經元的存活[19]。活化的AKT是GSK-3β蛋白重要的上游調控因子，AKT可通過促進GSK-3β蛋白Ser9位點磷酸化，從而抑制GSK-3β蛋白活化，并進一步降低Tau蛋白的磷酸化水平，提高阿爾茨海默病小鼠的認知功能[14]。APP可經淀粉樣代謝途徑在β分泌酶和γ分泌酶的作用下產生可溶性β淀粉樣蛋白，而β淀粉樣蛋白代謝異常與神經元退化和認知損害密切相關，也是阿爾茨海默病發病機制的核心環節[20]。mTOR是一種大型多結構域蛋白，存在于兩種不同的多蛋白復合物中(即mTORC1和mTORC2)，其被證明是神經細胞存活、分化和形態形成的關鍵因素，參與神經元的發育和成熟神經元的正常功能[21]。mTORC1是mTOR和AKT1的相關調控蛋白，下調mTORC1水平可改善不同阿爾茨海默病模型動物的學習和記憶缺陷[21]。VEGF家族在神經和血管形成過程中發揮重要作用，并參與血管生成調節、神經發生和神經元存活。研究表明，經VEGFA治療可有效地促進阿爾茨海默病模型小鼠的認知功能恢復[22]，VEGFA對阿爾茨海默病患者和具有高風險認知衰退人群具有特別的保護作用[23]。MAPK14在促炎細胞因子或物理應激等細胞外刺激下，引起細胞級聯反應，通過調節自噬可使阿爾茨海默病小鼠淀粉樣病變減少[24]。

GO功能富集分析結果顯示，黃精干預認知障礙的潛在靶點涉及多個細胞組分、分子功能和生物學過程。其中生物學過程主要涉及細胞對氮化合物的反應、MAPK級聯反應正調控、突觸信號、老化、血液循環、神經元死亡等。其中，衰老是認知衰退的主要危險因素，會導致工作記憶和執行功能下降[25]。神經元程序性死亡包括神經干細胞衰竭、細胞凋亡增加、蛋白質聚集、活性氧增加導致線粒體功能障礙、蛋白質和脂質氧化損傷、DNA損傷的積累，其是大腦衰老的關鍵[26]，因此與老年性認知功能減退的發生、發展密切相關。此外，血液循環調節過程亦影響著認知功能。腦血管疾病在認知功能障礙和癡呆的發生和發展中發揮著重要作用，這些疾病也會長期改變腦血流的調節，而正常情況下老年人的腦血流或腦循環調節也在減弱，推測由腦缺血導致的腦血流減少可能會影響衰老性認知功能減退[27]。有研究報告，Ras-MAPK通路中的基因結構突變會導致突觸可塑性缺陷，表現為以認知障礙、智力減退為特征的神經發育障礙疾病[28]。以上均表明，黃精干預認知功能障礙可能涉及多個分子生物學過程。

本研究中，網絡藥理學篩選黃精改善認知功能的主要信號通路有：神經活性配體-受體相互作用通路、5-羥色胺通路、PI3K-AKT信號通路、內分泌抵抗、cAMP信號通路、帕金森病相關通路、AMPK信號通路、NF-κB信號通路、血管平滑肌收縮相關通路。(1)神經活性配體-受體相互作用通路：在該通路中，神經遞質受體豐富多樣，涵蓋乙酰膽堿受體、單胺類遞質受體、抑制性氨基酸類遞質受體等。有學者發現，膽堿能神經支配減少是認知和神經退行性疾病特別是阿爾茨海默病患者認知能力下降的原因之一[29]。大量的動物和人體研究表明，N型乙酰膽堿配體有改善注意力、空間學習、工作記憶、識別記憶和執行功能等多個認知領域的功能[30-33]。多巴胺系統也具有調節衰老和認知能力的功能，如多巴胺D1受體(dopamine D1 receptor，DRD1)在各種大腦通路的神經傳遞中至關重要，它調節著包括自主運動、記憶、注意力和獎賞等關鍵功能。選擇性激活DRD1可為靶點治療神經退行性疾病和神經精神疾病提供新的思路[34]。γ-氨基丁酸等抑制性中間神經元受體可產生階段性抑制和緊張性抑制，從而調節神經活動，這有助于在皮層回路中建立適當的網絡動態，維持正常的認知[35]，因此γ-氨基丁酸信號改變與精神和神經疾病相關的認知缺陷相關。(2)5-羥色胺信號通路：5-羥色胺神經元支配著大腦和脊髓的大部分區域，參與廣泛的神經系統功能，在情緒和認知調節中發揮重要作用。有研究表明，5-羥色胺受體2A激動劑增強了人類的關聯學習能力，其使用劑量與認知效應的產生相關聯[36]；5-羥色胺受體1A、5-羥色胺受體2、5-羥色胺受體3、5-羥色胺受體4和5-羥色胺受體6參與調節帕金森病患者常見的認知障礙、情緒障礙[37]。(3)PI3K/AKT信號通路：PI3K/AKT信號通路被認為是神經元存活的重要信號通路，在衰老和許多神經退行性疾病中，該通路可調節神經細胞存活和突觸可塑性[28]。由胰島素受體底物激活的PI3K觸發了下游蛋白磷酸肌醇3,4,5 -三磷酸的激活，然后磷酸肌醇3,4,5 -三磷酸激活磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK)，PDK隨后將AKT召集到質膜上，并磷酸化Thr308和Ser473殘基上的AKT，完全激活的AKT進而刺激mTORC1[38]。有研究報告PI3K/AKT/mTOR級聯功能障礙參與神經精神疾病的發生與發展[39]。在PI3K/AKT/GSK-3β介導的通路中，PI3K/AKT信號的選擇性下調和GSK3β蛋白激酶活性升高與腦功能障礙的發病有關；抑制GSK3β在皮質和海馬中的過表達可逆轉嚙齒動物的認知缺陷[40]。(4)內分泌抵抗通路：近年來，認知障礙與內分泌因素相關聯越來越受到人們的關注，本研究中的信號通路富集分析結果也顯示黃精干預認知障礙涉及內分泌抵抗機制。雌激素受體位于大腦中，尤其是在與學習和記憶有關的區域，如海馬體和杏仁核，而雌激素受體1與健康老年人的認知能力下降有關[41]。(5)其他：此外，還有研究報道帕金森病相關通路、AMPK信號通路、催乳素信號通路、NF-κB信號通路與認知功能相關[42-45]。

綜上所述， 黃精中的多種化合物可能通過調節多個靶點以調控MAPK 級聯反應調控、老化、血液循環、神經元死亡等生物學過程，以及神經活性配體-受體相互作用、5-羥色胺、PI3K-AKT、內分泌抵抗等多個通路，從而發揮干預認知功能障礙的作用。黃精在改善認知功能方面具有顯著優勢，這或為擴展其藥用范圍提供了依據。然而本研究僅利用網絡藥理學方法進行預測和分析藥物治療作用的潛在分子機制，還需要進一步以細胞實驗或動物模型進行相關驗證。