miR-223在尿毒癥腸組織的表達及對緊密連接蛋白表達的影響*

何荃 陳蕾 魏萌 魏麗敏 薛瑾虹 渠寧 劉華

(西安交通大學第一附屬醫院血液凈化科，陜西 西安 710061)

尿毒癥狀態下存在顯著的腸道屏障功能障礙(Intestinal barrier dysfunction，IBD)，已逐漸成為國內外腎臟病學領域的共識[1]。越來越多的證據顯示，IBD 引起的腸道通透性增加，會促進腸源性尿毒癥毒素入血、腸道菌群移位、加劇系統性炎癥反應，從而誘發或加重尿毒癥患者動脈粥樣硬化、營養不良、貧血等多種并發癥，嚴重威脅此類患者的生存質量及生命[2-3]。然而，尿毒癥狀態下 IBD 發病機制尚不清楚，更缺乏靶向其分子機制的干預手段。因此，深入探索尿毒癥狀態下IBD的機制，尋找行之有效的干預手段，是腎臟病學者迫在眉睫的任務。MicroRNA(miRNAs)為18-25nt的小分子RNA，可與目標mRNA的3’-UTR區域互補配對，導致翻譯的抑制或mRNA降解。研究顯示，miRNAs可通過上述機制參與眾多生理疾病過程的調控，包括腸道相關的腸粘膜炎癥反應、免疫耐受、先天免疫、腫瘤形成及腸上皮增殖、分化、凋亡等[4-8]，亦被證實與IBD相關。miR-223 是哺乳動物常見的miRNA之一, 存在于多種細胞、組織中,參與炎癥反應等過程[9]。既往研究顯示，miR-223在CKD血清中表達下調[10]，但其在尿毒癥腸組織中的表達情況及其對腸屏障功能的作用尚不清楚。因此，本研究擬通過檢測尿毒癥大鼠腸道中miR-223表達量并在體外細胞實驗中探索miR-223對腸上皮細胞緊密連接蛋白的調控作用，探討miR-223在尿毒癥腸屏障功能障礙中的可能作用及其相關機制，為治療尿毒癥相關IBD提供潛在靶點。本文通過尿毒癥大鼠及細胞體外實驗分析miR-223在尿毒癥腸上皮表達情況及其對緊密連接蛋白的調控作用，探討IBD機制和治療新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級成年健康雄性SD大鼠35只，體重180～230g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心。本實驗經西安交通大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準。大鼠在標準環境中飼養，室溫25～26℃，普通固態飼料、自來水喂養，自由攝食和飲水。隨機分為尿毒癥組20只和假手術組10只。

1.2 尿毒癥動物模型建立、分組及干預 本實驗采用5/6腎切除建立模型。一期手術切除左腎上下極各1/3，創面止血。一期手術后7～10天行二期手術，摘除右腎。假手術組，手術時僅打開腎包膜，暴露腎臟約5min后，逐層縫合切口部位。分為尿毒癥組10只，尿毒癥+益生菌組10只，同時設立假手術組10只為對照組。益生菌動物雙氣桿菌乳亞種(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis Bi-07)保存于中國西北大學生命學院微生物實驗室。凍干粉接種至改良TPY培養基復蘇后，取少量菌液再次接種至TPY培養基37℃培養16h，3000r/min離心10min后棄去上清液，PBS緩沖液稀釋細菌，麥氏比濁法將菌液1mL迅速灌胃尿毒癥+益生菌組大鼠。灌胃后給與正常飲水、飲食，每日灌胃，共持續4周，其余兩組大鼠均正常飲水飲食。

1.3 生化指標的檢測及腎臟組織病理學觀察 二期手術后第12周末處死大鼠，下腔靜脈抽取血標本5mL。留取血清檢測三組大鼠血清肌酐、尿素氮、血常規水平，委托西安交通大學第一附屬醫院檢驗科完成。取殘存腎組織，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，置于4%多聚甲醛固定液中固定，常規脫水、透明、石蠟包埋、切片，做HE染色，光鏡觀察各組組織形態學改變。

1.4 Caco2細胞的培養和分組 對數生長期生長良好的Caco2細胞接種于6孔細胞培養板，每孔2×105個細胞，于5% CO2培養箱中37℃培養過夜。轉染前2h，更換無血清MEM培養基。合成的miR-223模擬物或miR-223抑制劑用LipofectamineTM2000(上海恒飛生物科技有限公司，上海，中國)包裝。分4組：miR-223-mimics-NC組、miR-223-mimics組、miR-223-inhibitor-NC和miR-223-inhibitor組。RT-qPCR方法檢測各組ZO-1、Occludin、claudin-1 mRNA表達。根據制造商的操作規程，使用不同的轉染溶液，將細胞置于37℃的CO2培養箱中培養，6h后將混合溶液吸收并交換到正常培養基中。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測腸組織miR-223、occludin、claudin-1和ZO-1的表達 稱取凍存回腸組織100mg，以Trizol法勻漿提取總RNA，測定其濃度與含量。取5μLRNA，逆轉錄成cDNA，從GenBank中檢索出大鼠miR-223、Occludin、claudin-1、ZO-1所對應的cDNA序列。Primer5.0軟件設計出目的基因片段的引物序列。所有引物均有寶生物工程有限公司合成。miR-223引物：5′-GTCGTATC CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA CGACGGGGTATT-3′，5′-TGCGCTGTCAGTTTGT CAAAT-3′；occludin引物：5′-GACATGCCTCCACC CCCATCTGACT-3′，5′-TCTTCGCCTTCCCTGCTT TCCCCTT-3′；claudin-1引物：5′-GATGAAGTGCA AAAGATGTGGATGG-3′，5′-CA GTAGAAGGTG TTGGCTTGGGATA-3′；ZO-1引物：5′-TCATCTCC AGTCCCTTACCTTTC-3′，5′-ATG GTTTTGTCT CATCATTTCCTCA-3′。按下列反應條件在RT-qPCR擴增儀上進行擴增。50℃ 2 min，95℃ 10min；95℃ 30 sec，60℃ 30 sec，40 cycles。繪制溶解曲線，最終數據以2-△△Ct進行分析。

1.6 免疫組織化學染色 取回腸組織，中性福爾馬林固定，經酒精脫水，二甲苯透明后石蠟包埋、切片、脫蠟，置水后經3%雙氧水浸泡清除內源性過氧化物酶，微波修復，分別滴加50μL ZO-1、claudin-1(Abcam，英國)、Occludin(Thermo Fisher，美國)，室溫過夜，滴加二抗，室溫孵育30min，DAB顯色，常規脫水透明，封片；每張切片隨機選6個視野，利用KS400圖像分析系統進行陽性率分析比較。

1.7 RT-qPCR檢測Caco2細胞轉染miR-223-mimics或inhibitor后緊密連接蛋白表達 按照Trizol法提取總RNA。測定其濃度與含量。取5μLRNA，逆轉錄成cDNA，從GenBank中檢索出人Occludin、claudin-1、ZO-1所對應的cDNA序列。Primer5.0 軟件設計出目的基因片段的引物序列。所有引物均有寶生物工程有限公司合成。ZO-1引物：5′-CTAAGG GAGCACATGGTGAAGGTAA-3′，5′-GTCGGGCA GAACTTGTATATGGTTT-3′；occludin引物：5′-CT TCACCCCCATCTGACTATGT-3′，5′-GTCGGGCA GAACTTGTATATGGTTT-3′；claudin-1引物：5′-G AAGATGAGGATGGCTGTCATTGGG-3′，5′-GGT AAGAGGTTGTTTTTCGGGGAC-3′。按下列反應條件在RT-qPCR擴增儀上進行擴增。50℃ 2 min，95℃ 10min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40 cycles。繪制溶解曲線，最終數據以2-△△Ct進行分析。

1.8 Western blotting檢測Caco2細胞轉染miR-223-mimics或inhibitor后緊密連接蛋白表達 總蛋白在含有蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich，美國)的RIPA緩沖液中提取和溶解。用BSA檢測試劑盒(Pierce, Rockford IL, USA)測定蛋白濃度后，從每個樣品中提取總蛋白40 μg，用10% SDS-PAGE在70 V下分離30 min，再用110 V分離至最后，轉移至PVDF膜(Millpore, USA)。膜與一抗在4℃孵育過夜(Abcam Technology，UK：claudin-1 1∶4000；occludin 1∶1500；Thermo Fisher科學公司，美國：ZO-1，1∶1000；Abcam技術，英國：GAPDH 1∶2000)，然后與過氧化物酶結合二級抗體孵育(Boster生物技術，武漢，中國，1∶5000)，室溫1h，用增強化學發光(ECL)檢測系統(Pierce，Rockford IL，USA)檢測蛋白質條帶，并用Image J軟件進行密度測定。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況和生化指標 術后尿毒癥組(Group UR)大鼠逐漸表現活動量減少，對外界刺激反應遲鈍，喜拱背蜷縮。食物攝入量減少，且體重增長速度減緩。毛色轉黃干枯，疏松不齊，眼、耳、尾逐漸變蒼白。假手術組(Group SH)活動靈活，毛色、眼、耳及尾部均無異常變化，食量隨體重增長不斷增加，尿量無異常改變。尿毒癥組大鼠血肌酐、尿素氮、紅細胞比容較對照組顯著下降，而較尿毒癥+益生菌組(Group UP)無顯著差異，見表1。

表1 三組大鼠一般情況及實驗室指標比較

2.2 腎組織病理學改變 尿毒癥組和尿毒癥+益生菌組大鼠腎小球結構紊亂，腎小球呈局灶或彌漫性球性硬化，部分腎小球代償性增大，腎小管管腔內存在蛋白管型，腎間質見大量炎細胞浸潤，纖維組織增生。假手術組大鼠腎小球結構清晰，毛細血管袢開放，無明顯系膜增生，腎間質無炎細胞浸潤及纖維組織增生(圖1)。半定量分析顯示，與SH組相比，UR組大鼠腎小球硬化指數評分(1.70±0.31 vs.0.27±0.11，P<0.01)和腎小管間質損傷指數評分(2.33±0.16 vs.0.48±0.15，P<0.01)明顯升高，且平均腎小球直徑更大(102.30±10.09 vs.78.83±4.67，P<0.01)；UR組與UP組上述指標無差異。

圖1 不同組大鼠腎臟病理學改變(蘇木精-伊紅染色，200×)

2.3 RT-qPCR檢測腸組織中緊密連接蛋白和miR-223 mRNA的表達 與假手術組比較，尿毒癥組腸組織中miR-223 和緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA顯著降低，給予益生菌干預后可見miR-223表達較尿毒癥組顯著升高(P<0.01)，同時緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA表達也較尿毒癥組顯著升高，見表2。

表2 三組大鼠腸組織miR-223、ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA相對表達量比較

2.4 免疫組化觀察ZO-1、occludin、claudin-1表達 利用免疫組化觀察各組大鼠大鼠腸粘膜緊密連接蛋白表達及分布差異?？梢姡琒H組腸粘膜表面緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1棕色顆粒較多，粘膜表面和隱窩均有ZO-1、occludin、claudin-1分布；UR組腸上皮細胞間ZO-1、occludin、claudin-1棕色顆粒明顯減少，提示表達下降；UP組ZO-1、occludin、claudin-1表達較UR組增加，見圖2。

圖2 三組大鼠回腸ZO-1、Occludin、claudin-1表達(400×)

2.5 RT-qPCR檢測轉染miR-223-mimics或inhibitor后Caco2細胞緊密連接蛋白mRNA表達 與對照組比較轉染miR-223-mimics上調miR-223表達可以引起Caco2細胞中緊密連接occludin、claudin-1、ZO-1 mRNA表達水平升高；而轉染miR-223-inhibitor下調miR-223表達可以導致緊密連接蛋白表達下降，見表3。

表3 Caco2細胞轉染miR-223模擬物與抑制劑對緊密連接蛋白mRNA相對表達量影響

2.6 Western blotting檢測轉染miR-223-mimics或inhibitor后Caco2細胞緊密連接蛋白表達 與對照組比較轉染miR-223-mimics上調miR-223表達可以引起Caco2細胞中緊密連接occludin、claudin-1、ZO-1 蛋白表達水平升高；而轉染miR-223-inhibitor下調miR-223表達可以導致緊密連接蛋白表達下降，見圖3。

3 討論

近年來，越來越多的證據顯示慢性腎臟病(chronic renal disease，CKD)特別是終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的腸屏障功能受損[1-3]，其中一個最重要的機制是機體內尿毒癥毒素升高破壞了腸上皮緊密連接蛋白(tight junction proteins，TJPs)(如claudin-1、occludin和ZO-1)的表達[11]。TJPs作為腸屏障重要組成部分對保持腸道通透性至關重要[12]，其丟失會導致更多腸道產生的毒素進入機體，進一步加重腸屏障損傷，形成惡性循環。盡管TJPs受損在CKD中的作用被廣泛認識，但其內在分子機制仍有待探索。在本研究中，我們發現伴隨著尿毒癥大鼠腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA和蛋白水平顯著降低，miR-233的表達水平亦顯著下降；在給予益生菌干預后，miR-223表達升高，同時緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA表達亦顯著升高。進一步的體外細胞實驗顯示，應用miR-223 mimics或者miR-223 inhibitor上調或下調miR-223的表達可以調控腸上皮Caco2細胞緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA及蛋白表達水平。我們的研究提示miR-223可能通過調控尿毒癥腸上皮緊密連接蛋白參與尿毒癥相關IBD。

miR-223是一種廣泛表達的人類代謝性疾病標志物，亦被報道參與炎癥、自身免疫等病理生理過程，其在心血管疾病、癌癥中的作用已引起越來越多的關注[13]。腎臟疾病方面，先前研究表明CKD的小鼠模型及CKD晚期患者血清中miR-223下降[10]，調節CKD患者miR-223可能發揮逆轉此類患者血管鈣化的作用。在本研究中，我們首次發現尿毒癥腸上皮細胞miR-223表達下調，盡管未證實miR-223下調的機制，但根據既往文獻報道，這可能與尿毒癥毒素對miR-223的調控作用相關[14]。在本研究中，我們還發現，在使用益生菌干預后，伴隨著miR-223上調，尿毒癥中受損的腸道緊密連接蛋白表達水平亦明顯改善，這一結果提示miR-223可能與尿毒癥腸道緊密連接蛋白表達及尿毒癥相關IBD存在相關性。

既往研究顯示，miRNA不僅在胃腸道發育和生理功能中發揮重要作用，還在腸粘膜炎癥反應、免疫耐受、先天免疫、腫瘤形成及腸上皮增殖、分化、凋亡等病理過程中發揮巨大作用[4-8]。已有研究證實異常表達的miRNAs參與了結腸炎等IBD相關疾病的發病機制[15-16]，其中也包括miR-233。研究顯示，miR-223可作為結腸炎患者的一種新型生物標志物[17]，McKenna等[4]進一步證實，miR-223在實驗性結腸炎中發揮重要保護作用。鑒于尿毒癥患者有著與上述疾病相類似的腸道緊密連接蛋白受損表現，我們猜想，miR-223也可能在尿毒癥相關IBD中發揮作用。因此，我們進一步在體外細胞實驗中探索了miR-223對腸道緊密連接蛋白表達的調控作用，結果顯示，下調的miR-223可引起腸道緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA及蛋白表達水平顯著下降，反之，miR-223上調可使ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA及蛋白表達水平顯著上升。結合先前體內研究的結果，我們的研究表明miR-223可能通過對腸道緊密連接蛋白的調控參與尿毒癥相關IBD。既往研究顯示，緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的表達受NLRP3炎性小體的調控[18-20]，而miR-223則被證實可直接結合于 NLRP3 mRNA 3′-UTR 區域，導致 NLRP3 mRNA 降解、蛋白表達量下降，起到抑制NLRP3炎癥小體活性的作用[21-23]。因此，我們推測，miR-223可能通過靶向NLRP3調控緊密連接蛋白表達，但這一猜想仍需進一步體內外實驗證實。此外，本研究還發現益生菌的干預改善了尿毒癥大鼠腸組織中miR-223以及緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1的表達。這一結果也為以益生菌改善維持性血液透析患者腸道失衡和降低尿毒癥毒素的暴露[24]的學說增添了理論依據。

4 結論

本研究結果顯示，miR-223在尿毒癥大鼠腸組織中表達顯著下降，下調的miR-223可能通過下調腸上皮緊密連接蛋白參與尿毒癥相關IBD的發生發展。此外，益生菌的干預可以上調尿毒癥腸上皮miR-223的表達，并改善緊密連接蛋白的表達。