lncRNA CASC19靶向miR-490-3p調控骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制*

周劍 張香 劉林 梁濤

(自貢市第三人民醫院 1.骨科；2.藥劑科，四川 自貢 643020)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是一種易發于青少年的原發于骨組織的惡性腫瘤，雖然手術聯合化療的綜合治療取得一定的進步，但其易復發且易轉移，致殘率和死亡率依然很高，治療效果不理想[1]。從分子水平研究骨肉瘤的發生和發展已成為研究熱點，全新的特異性分子靶向治療為提高骨肉瘤的治療效果和方向提供了新思路[2]。近年來，研究發現lncRNA(long non-coding RNA)在骨肉瘤中異常表達，其通過與蛋白質、mRNA、miRNA等相互作用影響骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[3]。通過研究在lncRNA骨肉瘤治療中的作用靶點可以為其治療提供一種新手段。腫瘤易感候選基因19(cancer susceptibility candidate 19，CASC19)是一種lncRNA，研究發現lncRNA CASC19在結直腸癌中高表達，可能促進結直腸癌的轉移[4]。研究發現miR-490-3p通過靶向HMGA2抑制骨肉瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡[5]。而lncRNA CASC19對骨肉瘤增殖、遷移和侵襲及其機制是否與miR-490-3p有關還尚未見報道，本實驗旨在研究lncRNA CASC19與miR-490-3p的關系及其對骨肉瘤增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤細胞系MG63、U2-OS、OS187和健康人成骨細胞hFOB1.19購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibico公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、DMSO、BCA試劑盒、PBS緩沖液購自Sigma公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購于美國BD公司；RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 骨肉瘤細胞系MG63、U2-OS、OS187和健康人成骨細胞hFOB1.19使用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養基于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養，每天換液一次，待細胞融和至80%左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染與分組 取常規培養的骨肉瘤細胞MG63用0.25 %胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細胞生長至80%融合，更換為無血清培養基同步化12 h，隨后進行轉染。轉染分為si-con組(轉染si-con)、si-CASC19組(轉染si-CASC19)、pcDNA組(轉染pcDNA)、pcDNA-CASC19組(轉染pcDNA-CASC19)、miR-con組(轉染miR-con)、miR-490-3p組(轉染miR-490-3p mimics)、si-CASC19+anti-miR-con組(共轉染si-CASC19和anti-miR-con)、si-CASC19+ anti-miR-490-3p組(共轉染si-CASC19和anti-miR-490-3p)，轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.2.3 qRT-PCR檢測miR-490-3p和CASC19表達水平 收集各組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環；60 ℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-490-3p和CASC19分別以U6和GAPDH為內參，miR-490-3p上游引物序列：5′-GCAAACAACCATTCGGCTGTC-3′；下游引物序列：5′-CGCAGGTCCGGAGTAGGT-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGT GTCAT-3′；CASC19上游引物序列：5′-GAGGAAGG CAGCACAATGATG-3′；下游引物序列：5′-CTTGCC AGTGTCTTCTCCTGA-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4 Western blot檢測蛋白的表達 收集各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃，12000 g離心15min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，5 % 脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品設3個重復。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖 在各組細胞培養至24h、48h、72h時加入20 μL(5 g/L)的MTT溶液，繼續孵育4 h；棄去多余培養基并加入150 μL DMSO振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細胞活性(%)=實驗組A值/空白對照組A值×100%。

1.2.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 在各組細胞，胰酶消化后使用無血清培養基重懸細胞，調整濃度為2×104個/mL。細胞遷移實驗：取200 μl細胞懸液接種于Transwell小室上室中，并置于含完全培養基的下室中，37 ℃、5 % CO2條件下培養24h，取出小室，去除培養基后用棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定30min，0.1%結晶紫染色10min，顯微鏡觀察并隨機選取5個視野拍照，計算結晶紫染色細胞數即為遷移細胞數。細胞侵襲實驗：以1:5比例加入RPMI 1640培養液稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室的上室，室溫下干燥后，按照細胞遷移實驗步驟操作。最后顯微鏡下觀察結晶紫染色細胞數即為侵襲細胞數。

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測CASC19對miR-490-3p的靶向調控 TargetScan數據庫顯示CASC19 3′UTR區域有miR-490-3p結合位點。構建野生型和突變型基因靶點CASC19的3′UTR-熒光素酶表達載體(WT-CASC19和MUT-CASC19)，取對數生長期乳腺癌細胞接種于24孔板(5×104個/孔)，待細胞生長至80 %融合時，用LipofectamineTM2000將WT-CASC19和MUT-CASC19組細胞分別轉染miR-con和miR-490-3p。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析，實驗重復3次。

2 結果

2.1 骨肉瘤細胞系中CASC19和miR-490-3p的表達 qRT-PCR檢測結果(圖1)顯示，與健康人成骨細胞hFOB1.19相比，骨肉瘤細胞系MG63、U2-OS、OS187中miR-490-3p的表達水平顯著降低，CASC19 的表達水平顯著升高(P< 0.05)。

圖1 骨肉瘤細胞系中CASC19和miR-490-3p的表達

2.2 干擾CASC19表達對骨肉瘤細胞MG63增殖的影響 MTT法檢測結果(圖2A)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細胞活性顯著降低(P<0.05)；qRT-PCR檢測結果(圖2B)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組CASC19 的表達水平顯著降低(P<0.05)；Western blot檢測結果(圖2C，D)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細胞MG63中CDK1、Cyclin D1表達水平顯著降低(P<0.05)。可見，干擾CASC19表達抑制骨肉瘤細胞MG63增殖。

圖2 干擾CASC19表達對骨肉瘤細胞MG63增殖的影響

2.3 干擾CASC19表達對骨肉瘤細胞MG63遷移和侵襲的影響 Transwell 法檢測結果(圖3A，B)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細胞MG63遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測結果(圖3C，D)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細胞MG63中MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。可見，干擾CASC19表達抑制骨肉瘤細胞MG63遷移和侵襲。

圖3 下調CASC19表達對骨肉瘤細胞MG63增殖、遷移、侵襲的影響

2.4 CASC19靶向調控miR-490-3p的表達 通過TargetScan數據庫預測到CASC19與miR-490-3p存在結合位點(圖4A)。熒光素酶報告基因檢測實驗結果(圖4B)顯示，轉染野生型CASC19基因表達載體WT-CASC19后，相較于miR-con組，miR-490-3p組WT-CASC19骨肉瘤細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染突變型CASC19基因表達載體MUT-CASC19后，相較于miR-con組，miR-490-3p組MUT-CASC19骨肉瘤細胞的熒光素酶活性差異不顯著。Western blot檢測結果(圖4C)顯示，相較于si-con組，si-CASC19組骨肉瘤細胞中miR-490-3p的表達水平顯著升高；相較于pcDNA組，pcDNA-CASC19組乳骨肉瘤細胞中miR-490-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)。可見，CASC19可靶向調控miR-490-3p的表達。

圖4 CASC19靶向調控miR-490-3p的表達

2.5 過表達miR-490-3p對骨肉瘤細胞MG63增殖、遷移、侵襲的影響 qRT-PCR檢測結果(圖5A)顯示，與miR-con組相比，miR-490-3p組中miR-490-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)。Western blot檢測結果(圖5B，C，E，F)顯示，與miR-con組相比，miR-490-3p組骨肉瘤細胞MG63中CDK1和CyclinD1蛋白的表達水平顯著降低，MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測結果(圖5D)顯示，與miR-con組相比，miR-490-3p組骨肉瘤細胞活性顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測結果(圖5G)顯示，與miR-con組相比，miR-490-3p組骨肉瘤細胞遷移、侵襲數顯著降低(P<0.05)。可見，過表達miR-490-3p抑制骨肉瘤細胞MG63增殖。

圖5 上調miR-490-3p表達對骨肉瘤細胞MG63增殖、遷移、侵襲的影響

2.6 miR-490-3p抑制物部分逆轉沉默CASC19表達對骨肉瘤細胞MG63增殖、遷移、侵襲的作用 qRT-PCR檢測結果(圖6A)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組中miR-490-3p的表達水平顯著升高；與si-CASC19+anti-miR-con組相比，si-CASC19+anti-miR-490-3p組中miR-490-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測結果(圖6C，D)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細胞MG63中CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平顯著降低；與si-CASC19+anti-miR-con組相比，si-CASC19+anti-miR-490-3p組骨肉瘤細胞MG63中CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結果(圖6B)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細胞活性顯著降低；與si-CASC19+anti-miR-con組相比，si-CASC19+anti-miR-490-3p組骨肉瘤細胞活性顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結果(圖6E)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細胞遷移和侵襲數量顯著降低；與si-CASC19+anti-miR-con組相比，si-CASC19+anti-miR-490-3p組骨肉瘤細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。可見，抑制miR-490-3p表達可部分逆轉沉默CASC19表達對骨肉瘤細胞MG63增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

圖6 抑制miR-490-3p表達逆轉沉默CASC19表達對骨肉瘤細胞MG63增殖、遷移、侵襲的抑制作用

3 討論

骨肉瘤在臨床骨科腫瘤中發病率最高，嚴重危害人類健康，其治療總體難度較大，隨著新的化療方式的出現，患者生存率和預后獲得了較大的改善，但骨肉瘤耐藥的出現導致其效果不佳[6]。分子靶向藥物在腫瘤治療領域發揮了重要作用，尋找可能的靶點對骨肉瘤治療提供了新途徑和前期的理論基礎[7]。長鏈非編碼RNA作為非編碼RNA的一種，其對骨肉瘤細胞的生長、增殖、遷移、侵襲以及骨肉瘤的發生、發展、耐藥性和預后具有重要的調控作用，可作為骨肉瘤發病診斷和臨床治療潛在的生物標志物[8]。研究發現CASC2在骨肉瘤中下調表達，過表達可抑制骨肉瘤細胞的增殖，遷移和侵襲[9]。CASC2通過miR-362-5p/Nf-κB調節肝細胞癌細胞的發生[10]。CASC2通過miR-18a抑制結腸癌的增殖[11]；CASC19可促進結直腸癌的轉移[4]；CASC11通過激活WNT/β-catenin通路以促進結直腸癌的生長和轉移[12]；CASC15可通過調節miR-4310/LGR5/Wnt/β-catenin信號通路促進結腸癌細胞增殖和轉移[13]；CASC15還通過靶向miR-33a-5p促進舌鱗狀細胞癌的進展[14]。本研究結果顯示，CASC19在骨肉瘤細胞中高表達，干擾CASC19表達均可抑制骨肉瘤細胞MG63增殖、遷移和侵襲；抑制CDK4、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達。

研究表明miRNA在骨肉瘤中差異性表達，miRNA可作為骨肉瘤診斷及預后的特異性無創生物學指標[15]。研究發現miR-490-3p在骨肉瘤細胞中下調表達[16]，miR-490-3p通過在骨肉瘤中靶向HMGA2來調節細胞增殖和凋亡[17]；lncRNA CCAT1通過miR-490-3p上調TGFβR1，促進TGFβ1誘導的卵巢癌細胞EMT[18]；CircSLC3A2通過miR-490-3p調節PPM1F表達在肝癌中起致癌因子的作用[19]。miR-490-3p可通過轉錄因子Smad2抑制結直腸癌細胞的侵襲、遷移的功能[20]。TTTY10通過靶向調節miR-490-3p，并通過HMGB1信號通路影響宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力[21]。本實驗結果顯示，在骨肉瘤細胞中miR-490-3p的表達水平顯著降低，過表達miR-490-3p可抑制骨肉瘤細胞MG63增殖、遷移和侵襲；抑制CDK4、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達。而且本實驗結果表明CASC19可靶向調控miR-490-3p的表達，抑制miR-490-3p表達能逆轉干擾CASC19對骨肉瘤細胞MG63增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

4 結論

干擾lncRNA CASC19可能通過上調miR-490-3p的表達抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，這為骨肉瘤的防止治提供了新的靶點。