初次與再次動靜脈內(nèi)瘺術血液透析患者血管TGF-β1/Smad3的表達及臨床意義*

舒英 殷俊 陳媛媛 金驪珠 楊波 張彤彤 崔馳

(西南交通大學附屬醫(yī)院·重慶醫(yī)科大學附屬成都第二臨床學院·成都市第三人民醫(yī)院 1.腎內(nèi)科；2.病理科；3.實驗醫(yī)學部；4.血管外科，四川 成都 610031)

終末期腎病(End stage renal disease, ESRD)是危害我國民眾健康的常見重大疾病，血液透析(Hemodialysis, HD)是治療該病的最常見方式。我國HD患者人數(shù)逐年攀增，截止2019年底已達71萬。血透通路是保證HD順利進行的先決條件，自體動靜脈內(nèi)瘺(Arteriovenous fistula, AVF)是公認的首選長期通路，是HD患者的生命線。但高達15%～50%的AVF術后成熟不良[1-4]，嚴重影響患者生活質(zhì)量和生存率。血管內(nèi)膜增生(intimal hyperplasia，IH)是AVF成熟不良的主要原因，細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)蓄積是IH的主要病理表現(xiàn)[5-7]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)/Smad3信號通路是最重要的ECM及纖維化調(diào)節(jié)因子[8]。TGF-β1/Smad3信號通路可能與AVF成熟不良密切相關，但目前鮮有報道。本研究采用前瞻性隊列研究，比較TGF-β1/Smad3在初次及再次AVF術HD患者靜脈血管的表達差異，并結合相關臨床參數(shù)，探討影響瘺AVF成熟的危險因素，為臨床防治提供新參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2017 年 6 月～2019年 6 月期間腎內(nèi)科行初次AVF術患者(A組)與再次AVF術患者(B組)擬廢棄的靜脈血管標本及相關臨床參數(shù)。其中A組48例，B組46例，兩組患者均隨訪6個月，記錄兩組患者瘺結局(成熟或未成熟)，據(jù)此分為瘺成熟組及瘺未成熟組。瘺成熟定義為：AVF術后6月內(nèi)能使用內(nèi)瘺正常透析，透析血流量>200mL/min；瘺未成熟定義為：AVF術后6月內(nèi)不能使用內(nèi)瘺透析。納入標準：①年齡≥18。②規(guī)律血液透析。③內(nèi)瘺術式為橈動脈頭靜脈端側(cè)吻合術。④簽署臨床研究知情同意書。排除標準：①限于患者血管條件，無廢棄血管標本可收集者。②未完成6個月隨訪者。本研究為前瞻性隊列研究，研究方案通過我院倫理委員會審核。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 收集并記錄所有入選患者的臨床資料，包括年齡、性別、原發(fā)病、肝腎功、電解質(zhì)、血常規(guī)、甲狀旁腺激素(iPTH)、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、術側(cè)橈動脈及頭靜脈直徑等。

1.2.2 血管標本收集、保存及檢測 收集術中擬廢棄靜脈血管標本，A組收集表觀相對正常血管標本，B組收集病變血管，長約0.5～0.8cm，放入中性福爾馬林溶液，后期行石蠟包埋及切片染色。所有標本均行常規(guī)HE染色及行TGF-β1(ABCAM，ab27969)及Smad3(ABCAM，ab52903)免疫組化染色。以TGF-β1及Smad3內(nèi)膜染色陽性面積/內(nèi)膜面積×100%，行半定量分析。

2 結果

2.1 初次與再次造瘺組兩組患者臨床參數(shù)比較 與初次造瘺組相比，再次造瘺組女性及糖尿病比例明顯更高，血鈣、血紅蛋白水平更低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 AB兩組患者臨床參數(shù)比較

2.2 初次與再次造瘺組患者血管HE染色結果 與初次造瘺組相比，再次造瘺組血管見顯著內(nèi)膜增生，平滑肌細胞增生，以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤，外膜斷裂伴出血，血管腔明顯狹窄,見圖1、圖2。

圖1 兩組患者血管橫切面HE染色比較(10×)

圖2 再造瘺組血管病變HE染色(A、B、C：10×；D:50×)

2.3 初次與再次造瘺組患者TGF-β1及Smad3免疫組化染色結果 再次造瘺組患者增生的內(nèi)膜組織見TGF-β1及Smad3表達顯著增強，見圖3。

圖3 兩組血管標本TGF-β1/Smad3免疫組化染色(10×)

2.4 術后瘺成熟組與未成熟組相關參數(shù)比較 隨訪過程中無死亡病例。與瘺成熟組比較，瘺未成熟組女性及糖尿病比例更高，橈動脈及頭靜脈更細，內(nèi)膜TGF-β1及Smad3表達水平更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 瘺成熟組與瘺未成熟組患者相關參數(shù)比較

2.5 瘺未成熟與多因素變量相關性分析 采用廣義線性模型回歸分析瘺未成熟與多因素變量之間的相關性。綜合性別、糖尿病、橈動脈直徑、頭靜脈直徑、內(nèi)膜TGF-β1及Smad3表達水平等多因素變量的相關分析顯示，內(nèi)膜TGF-β1及Smad3表達水平與瘺未成熟呈顯著正相關(P<0.05)，見表3。

表3 瘺未成熟與多因素變量相關性分析

3 討論

橈動脈-頭靜脈端側(cè)吻合術是最常見的AVF術式，該手術將肢體遠端的橈動脈-頭靜脈行端側(cè)吻合，人為造成動靜脈短路，術后頭靜脈血流量明顯增加，頭靜脈代償性擴張、管腔增大，管壁增厚，靜脈逐漸動脈化，即瘺逐漸成熟。成熟的內(nèi)瘺其自然血流量>500mL/min，穿刺段靜脈內(nèi)徑≥5mm，距皮深度<6mm[9]。但臨床上高達15%～50%患者AVF術后內(nèi)瘺成熟不良。探索內(nèi)瘺成熟不良的發(fā)病機制及危險因素，促進內(nèi)瘺成熟，有重要的臨床意義。

內(nèi)瘺成熟不良的機制十分復雜，目前認為影響內(nèi)瘺成敗的兩個關鍵因素是[10-12]：IH和血管向外重構(Outward remodelling，OR)。IH的核心表現(xiàn)是ECM過度沉積、細胞過度增生、細胞因子過度表達，導致管壁增厚，管腔狹窄；OR的核心表現(xiàn)是管腔擴張，伴血管彈性膜和ECM的降解及支架重組。IH導致的管腔狹窄和OR導致的管腔擴張共同決定AVF的成敗，即血管內(nèi)膜過度增生和/或血管向外擴張不足則內(nèi)瘺成熟不良。TGF-β/Smad信號通路是TGF-β參與細胞增殖、分化、遷移、ECM沉積及組織纖維化最經(jīng)典的信號通路，同時被認為是最重要的ECM及纖維化調(diào)節(jié)因子[8，13-14]。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)使血管內(nèi)彈力膜及基質(zhì)降解及血管支架重構，利于血管向外擴張重構[15]。研究發(fā)現(xiàn)：TGF-β1/Smad3信號通路作用于膠原啟動區(qū)促進膠原合成及ECM堆積，促進腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展[16]；TGF-β1/Smad3信號通路參與血管纖維化[17]；TGF-β1與冠狀動脈內(nèi)膜增厚及平滑肌細胞增生密切相關[18]；TGF-β通過下調(diào)MMPs基因表達抑制MMPs功能[19]。上述研究提示，TGF-β1在內(nèi)瘺成熟不良中扮演壞家伙的角色，其促進ECM合成及細胞增殖而加重內(nèi)膜增生，抑制MMPs生成而不利于向外重構。本研究中，再次內(nèi)瘺組血管(即原先瘺失功的病變血管)見顯著內(nèi)膜增生、管腔狹窄，增生的內(nèi)膜組織見TGF-β1/Smad3表達明顯增強；進一步隨訪分析發(fā)現(xiàn)，不管是初次內(nèi)瘺組或再次內(nèi)瘺組，最終成熟不良組的瘺血管其內(nèi)膜TGF-β1/Smad3表達較瘺成熟組顯著增加，且經(jīng)影響瘺成熟的多因素校正后TGF-β1/Smad3表達增加與瘺成熟不良仍顯著正相關，提示TGF-β1/Smad3信號通路的過度活化不利于內(nèi)瘺成熟。這為后期研究瘺成熟不良發(fā)病機制及防治手段提供了新啟發(fā)。

尿毒癥患者常合并鈣磷代謝紊亂，且與血管及心瓣膜鈣化密切相關。故鈣磷代謝紊亂可能與患者瘺不良結局相關。肖友文等[20]研究發(fā)現(xiàn)，維持性血液透析患者血管厚度與血清PTH水平密切相關，高PTH是患者血管增厚的獨立危險因素。但本研究中，初次內(nèi)瘺與再次內(nèi)瘺組比較，瘺成熟組與瘺未成熟組比較，血PTH水平均無顯著性差異。提示鈣磷代謝對AVF的影響十分復雜，尚需進一步研究。

本研究進一步發(fā)現(xiàn)，女性、基礎糖尿病、橈動脈及頭靜脈內(nèi)徑細是影響HD患者瘺成熟的危險因素。姚娬斌等[21]研究也發(fā)現(xiàn)血管條件與AVF功能密切相關，良好的血管條件是保障AVF功能的重要基礎，糖尿病及老年是AVF失功的危險因素。Jeong S[22]也曾報道，合并糖尿病的血透患者，其死亡率及內(nèi)瘺失功率明顯增加，這與糖尿病患者合并高血壓、血脂代謝紊亂、冠心病及外周血管疾病比例更高相關。這提示，重視血糖血壓血脂的綜合管理，內(nèi)瘺術前加強手臂的鍛煉以改善橈動脈及頭靜脈管徑，或可提高內(nèi)瘺成熟率。我們的研究尚存在不足，如樣本量較小、隨訪時間較短，關于TGF-β1/Smad3信號通路研究尚不夠深入。后期可設計大樣本量、長程隨訪的前瞻性臨床研究，設計TGF-β1/Smad3信號通路干預措施的動物模型，深入探討TGF-β1/Smad3信號通路在AVF失功中的作用機制及靶向調(diào)控。

4 結論

動靜脈內(nèi)瘺血管內(nèi)膜TGF-β1/Smad3信號通路的過度活化不利于內(nèi)瘺成熟，這或可成為干預內(nèi)瘺失功的新靶點；女性、基礎糖尿病、橈動脈及頭靜脈內(nèi)徑細是影響HD患者瘺成熟的危險因素，強化血糖血壓血脂的綜合管理及加強內(nèi)瘺術前手臂鍛煉，或可提高內(nèi)瘺成熟率。