miR-590在IgA腎病患者尿液及血清中的表達及臨床意義

楊永紅 張鑫 李瑩 蘇麗

(解放軍總醫院第七醫學中心腎臟病科，北京 100700)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是一種臨床較為常見的原發性腎小球疾病，以腎功能下降、蛋白尿為主要臨床表現，其進展緩慢，預后較差，對患者生存質量構成極大威脅[1]。目前，IgAN發病機制尚未完全闡明，但研究認為其發病與免疫調節、遺傳、炎癥反應、血管生成、微小RNA(microRNA，miRNA)等有關[2-3]。相關報道顯示，miRNA可在相關基因轉錄、表達中起重要調控作用，其作為診治IgAN的指標[4]。有關研究顯示，miR-590-3p作為微小RNA-590(miRNA-590，miR-590)成員之一，其在IgAN患者血清中表達上調，miR-590-3p可能參與并影響IgAN發病過程[5]。但miR-590在IgAN患者尿液中的表達情況，及其在患者尿液、血清中的水平與調節血管生成的因子的關系尚未見報道。基于此，本研究通過檢測miR-590在IgAN患者尿液、血清中的表達水平，分析其與疾病嚴重程度及調節血管生成因子的關系，以期為早期診治IgAN、評估患者病情提供一定依據。

1 臨床資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月～2020年2月本院收治的85例IgAN患者作為IgAN組，按照IgAN患者24h尿蛋白量將患者分為輕度組(尿蛋白量<1.0g，33例)、中度組(尿蛋白量1.0～3.0g，38例)、重度組(尿蛋白量>3.0g，14例)。另選取同時間段內87例體檢健康者作為對照組。IgAN診斷標準：參考《IgA腎病臨床診治指南(解讀)》關于IgAN相關判定標準進行診斷[6]。納入標準：①患者均符合IgAN診斷標準，經腎穿刺活檢術確診。②患者臨床資料均完整。③患者均知情同意。排除標準：①肝病、過敏性紫癜、系統性紅斑狼瘡所引發的繼發性IgAN。②腎臟移植者。③合并腫瘤、心腦血管疾病者。所有受試者本人或其家屬簽署知情同意書，本項研究方法符合《赫爾辛基宣言》，且經本院倫理委員會審核、批準后實施(倫理批號：10201601103)。

1.2 主要試劑與儀器 尿液miRNA純化試劑盒(貨號：NGB-29000)購自艾美捷科技有限公司，血清miRNA純化試劑盒(貨號：ALH601)購自北京百奧萊博科技有限公司，miScript Reverse Transcription Kit試劑盒(貨號：218061)購自上海北諾生物科技有限公司，TaqMan? Fast Advanced Master Mix試劑盒(貨號：4352042)購自北京祥生興業科技有限公司；人血管抑素酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)(貨號：3010034)購自北京索萊寶科技有限公司。紫外分光光度計(型號：ND 1000)購自上海在途生物科技有限公司，實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：LightCycler? 480II)購自羅氏診斷產品(上海)有限公司，酶標儀(貨號：HBS-1096A)購買于上海研卉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 收集患者入院次日、健康者體檢當日清晨空腹肘關節靜脈血、尿液標本。各收集3～4mL靜脈血、尿液于離心管中，均在4℃環境下，以4300r/min離心8min，吸取上清液置于凍存管中，于-80℃冰箱中保存，待檢。

1.3.2 qRT-PCR檢測尿液和血清中miR-590表達水平 從-80℃環境中取出適量凍存尿液、血清樣本，冰上解凍，加適量cel-miR-39用于校正尿/血清miR-590水平，根據相應miRNA純化試劑盒說明書純化miRNA。依照反轉錄miScript Reverse Transcription Kit試劑盒說明書配制反應體系，將RNA反轉錄成cDNA。最后，參考PCR試劑盒TaqMan? Fast Advanced Master Mix說明書，配反應體系，進行qPCR檢測。以2-ΔΔCT法分析尿液、血清miR-590相對表達量，ΔC=目的基因CT值-cel-miR-39 CT值。

1.3.3 ELISA法檢測尿液和血清中血管抑素水平 將人血管抑素ELISA試劑盒所攜帶的標準品配制成不同濃度的標準樣品，利用酶標儀檢測不同濃度標準品在450nm處的吸光度值，繪制標準品回歸曲線，測定待測尿液及血清樣本在450nm處的吸光度值，根據標準曲線計算尿液及血清血管抑素濃度。

2 結果

2.1 兩組一般資料對比 IgAN組中男性50例，女性35例，年齡34～64歲，平均(47.74±9.76)歲；對照組中男性48例，女性39例；年齡35～63歲，平均(47.06±9.35)歲。IgAN組、對照組性別構成、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 兩組尿液、血清miR-590、血管抑素水平比較 與對照組相比，IgAN組患者尿液、血清中miR-590、血管抑素水平均顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組尿液、血清miR-590、血管抑素水平比較

2.3 不同程度IgAN患者尿液、血清miR-590、血管抑素水平比較 與輕度組相比，中度組、重度組IgAN患者尿液miR-590、血管抑素水平均顯著升高(P<0.05)，且兩者水平隨病情加重升高越顯著；與輕度組相比，中度組、重度組IgAN患者血清miR-590、血管抑素水平均顯著升高(P<0.05)，且兩者水平隨病情加重升高越顯著，見表2。

表2 不同程度IgAN患者尿液、血清miR-590、血管抑素水平比較

2.4 IgAN患者尿液、血清miR-590表達水平與血管抑素的關系 Pearson相關性分析結果顯示，IgAN患者尿液、血清miR-590表達水平與血管抑素水平均呈正相關(r=0.479、0.472，均P<0.05)，見圖1、2。

圖1 IgAN患者尿液中miR-590表達水平與血管抑素的關系

2.5 尿液、血清miR-590、血管抑素水平對 IgAN的診斷價值 ROC曲線顯示，尿液中miR-590對IgAN診斷的曲線下面積(Area Under Curve，AUC)為0.837(95%CI:0.777～0.896)，截斷值為1.36，其靈敏度、特異度分別為76.5%、80.5%；血管抑素對IgAN診斷的AUC為0.849(95%CI:0.788～0.910)，截斷值為59.25ng/L，其靈敏度、特異度分別為78.8%、88.5%；兩者聯合對IgAN診斷的AUC為0.903(95%CI:0.859～0.947)，其靈敏度、特異度分別為82.4%、86.2%，見圖3。血清中miR-590對IgAN診斷的曲線下面積AUC為0.822(95%CI:0.760～0.884)，截斷值為1.38，其靈敏度、特異度分別為72.9%、80.5%；血管抑素對IgAN診斷的AUC為0.833(95%CI:0.770～0.896)，截斷值為60.58ng/L，其靈敏度、特異度分別為71.8%、87.4%；兩者聯合對IgAN診斷的AUC為0.910(95%CI:0.869～0.952)，其靈敏度、特異度分別為91.8%、80.5%，見圖4。

圖2 IgAN患者血清中miR-590表達水平與血管抑素的關系

圖3 尿液中miR-590、血管抑素對IgAN的診斷價值

圖4 血清中miR-590、血管抑素對IgAN的診斷價值

3 討論

IgAN是免疫球蛋白以彌漫顆粒/團狀沉積在毛細血管、腎小球系膜所引起的腎臟病理改變疾病，以腎小球硬化、腎間質纖維化、細胞外基質大量堆積、慢性炎癥、巨噬細胞、淋巴細胞浸潤為主要病理表現，常表現為急性腎炎、血尿、腎功能衰竭，嚴重危及患者健康[7]。此外，活檢穿刺法是臨床判定IgAN的最重要手段，但其操作復雜，具有創傷性，因此，需要尋找操作簡便、有效診斷IgAN、判斷病情的指標。

miRNA廣泛存在于組織、血液、尿液中，在信號轉導、細胞增殖、凋亡、遷移、炎癥反應、免疫調節、血管形成等生物學過程中發揮重要調節作用，與腎癌、狼瘡性腎炎、IgAN等關系密切[8-12]。研究發現，miR-590-5p可靶向結合相應受體，調節caspase3信號通路，進而影響腎癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲，其有望成為治療腎癌的靶標[13]。體外研究證實，miR-590-3p通過靶向結合腫瘤壞死因子受體相關因子6，進而影響脂多糖誘導的急性腎損傷及足細胞凋亡情況[14]。此外，Zhai等[4]發現miR-590-3p可能通過靶向高遷移率族蛋白B2，調節半乳糖缺陷型IgA1表達，進而影響IgAN疾病進展，miR-590-3p有助于判定疾病嚴重程度。本研究中IgAN組患者尿液、血清中miR-590水平明顯高于對照組，且miR-590表達水平隨IgAN疾病嚴重程度加重呈升高趨勢，提示尿液、血清miR-590可能與IgAN發展進程有關，其有利于評估患者病情。推測，miR-590作為miRNA家族成員，其可能通過與有關靶基因結合，調節免疫炎癥反應，影響細胞增殖、凋亡過程，從而在IgAN發展中起調控作用，但具體作用機制有待進一步研究證實。

血管抑素是纖溶酶原蛋白水解產物，其可通過抑制內皮細胞增殖、遷移，促進內皮細胞凋亡，進而在血管形成過程中發揮抑制作用[15]。研究顯示，血管抑制素在狼瘡性腎炎患者尿液中水平升高，可作為診斷狼瘡性腎炎的非侵入性指標[16]。另有研究發現，血管抑素水平升高會減少腎小管周圍毛細血管(peritubular capillary，PTC)數量，減緩血流速度，引發腎功能不全[17]。以上研究證實，血管抑素可能在腎臟疾病中起重要作用。此外，Xia等[18]發現血管抑素在IgAN患者尿液中水平顯著升高，其可能成為評估IgAN嚴重程度的靶標。本研究中IgAN組患者尿液、血清中血管抑素水平均顯著高于對照組，且其水平隨IgAN疾病加重而明顯增加，提示尿液、血清中血管抑素可能與IgAN病變進展相關，其有助于判斷患者疾病進展程度。究其原因，高水平血管抑素可能通過抑制血管內皮生長因子表達，進而抑制腎小管外周血管生成，降低血流速度；另外，高水平血管抑素可能通過引起PTC損傷，影響腎功能，從而在IgAN疾病發展中發揮作用，但具體影響機制需進一步探究證實。

本研究顯示，IgAN患者尿液、血清中miR-590表達水平與血管抑素水平均呈正相關，提示miR-590與血管抑素可能相互影響，進而協同IgAN發生發展，但具體影響機制有待深入研究。本研究中尿液、血清miR-590、血管抑素對IgAN具有一定診斷價值，但診斷效能較低，尿液及血清miR-590、血管抑素聯合診斷IgAN的AUC分別為0.903、0.910，對應靈敏度分別為82.4%、91.8%，特異度分別為86.2%、80.5%，提示無論是尿液還是血清miR-590、血管抑素聯合診斷IgAN的價值均高于單獨診斷，可更好地篩查IgAN患者。

4 結論

IgAN患者尿液、血清中miR-590表達均上調，與血管抑素有良好相關性，miR-590、血管抑素聯合診斷IgAN均有較高的價值。但未對miR-590、血管抑素相互作用機制進行深入探究，有待擴大樣本量進行深入探究。