早期分泌抗原靶6及基質金屬蛋白酶9評估結核性毀損肺嚴重程度的應用價值

陸霓虹 孫婭萍 金媛 夏加偉 楊永銳

結核性毀損肺是由于結核分枝桿菌(MTB)反復感染引起的單個肺葉或單側肺廣泛性病變，常規藥物治療難以奏效，且患側肺會成為傳染源，患者容易反復發生細菌或真菌感染，導致咯血或大咯血。臨床上，結核性毀損肺的內科治療較為困難，甚至需手術切除病變肺葉，影響患者預后及生活質量[3]。如何評估結核性毀損肺，并進一步評估患者病情嚴重程度，從而尋找更有效的治療方法以改善預后，是目前該領域臨床研究的重點。為此，筆者選取結核性毀損肺患者、繼發性肺結核患者，以及健康體檢人員作為研究對象，分析早期分泌抗原靶6(early secretory antigen target-6，ESAT-6)及基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)對結核性毀損肺嚴重程度的評估價值。

對象和方法

1.研究對象：選取2018年1月至2019年1月昆明市第三人民醫院收治的55例結核性毀損肺患者(A組)，40例繼發性肺結核患者(B組)，以及同期在本院進行體檢的健康志愿者20名(C組)作為研究對象，收集研究對象實驗室檢查結果、影像學檢查結果，以及肺功能檢查結果等臨床資料。A組包括女22例(40.0%)，男33例(60.0%)；年齡范圍25～68歲，中位年齡37.0(30.0，56.0)歲。B組包括女19例(47.5%)，男21例(52.5%)；年齡范圍20～71歲，中位年齡46.0(32.3，54.8)歲。C組包括女9例(45.0%)，男11例(55.0%)；年齡范圍23～62歲，中位年齡38.0(30.8，54.3)歲。三組間性別分布及年齡差異無統計學意義(χ2=0.553，P=0.758；H=0.606，P=0.739)。本研究已通過本院倫理委員會審核(編號：2017091403)，所有研究對象均簽署知情同意書。

2.納入標準：(1)結核性毀損肺診斷標準：初治肺結核失敗或久治未愈并且反復復發，一側肺內結核病變廣泛，肺組織嚴重破壞，出現不可逆性病理改變，肺功能喪失的肺結核[4]。(2)繼發性肺結核診斷標準：參照《WS 288—2017肺結核診斷》[5]，繼發性肺結核影像學診斷排除結核性毀損肺，初治有效無復發，影像學診斷病灶有吸收及愈合。(3)排除標準：排除風濕免疫系統疾病、乙型病毒性肝炎、肝硬化、肺癌和血液系統疾病等導致免疫功能低下疾病的患者。

3.檢查方法：采集研究對象晨起空腹靜脈血6 ml，室溫靜置15～30 min后以1100×g離心15 min。血清MMP-9和ESAT-6濃度檢測按試劑盒(人MMP-9定量分析酶聯免疫檢測試劑盒購自上海巧伊生物科技有限公司；人ESAT-6酶聯免疫分析試劑盒購自英國Oxford公司)說明書進行，終止反應后置于450 nm波長的酶標儀上讀取各孔的吸光度值(A值)。以標準品的A值為橫坐標，以標準品的濃度為縱坐標繪制標準曲線，根據被檢測標本的A值及標準曲線計算相應的濃度。外周血T淋巴細胞亞群計數采用流式細胞分析儀(美國BD公司)進行檢測。

4.肺功能評估方法：采用肺功能儀(日本捷斯特公司)評估各組研究對象肺功能情況。根據通氣功能情況進行病情評估及嚴重程度分級。采用一秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、一秒率(FEV1/FVC)作為評估指標，將通氣功能障礙程度分為4級，即：輕度通氣功能障礙、中度通氣功能障礙、重度通氣功能障礙、極重度通氣功能障礙[6]。

5.統計學處理：應用SPSS 20.0軟件進行分析，偏態分布的計量資料以“中位數(四分位數)[M(Q1，Q3)]”表示，三組間差異的比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關檢驗；計數資料采用“構成比(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗；均以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.臨床特征比較：A組極重度通氣功能障礙患者比例明顯高于B組，差異有統計學意義；A組有結核球患者比例明顯高于B組，差異有統計學意義，見表1。

表1 各臨床特征在結核性毀損肺和繼發性肺結核患者中的分布情況

2.實驗室檢查結果分析：A組ESAT-6表達水平高于B組，而C組未見ESAT-6表達，三組比較差異有統計學意義。A組MMP-9表達水平高于B組和C組，三組比較差異有統計學意義。A組CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細胞計數較B、C組有不同程度下降，B組CD4+及CD3+T淋巴細胞計數較C組也有降低。具體見表2。進一步分析ESAT-6、MMP-9水平與免疫功能的相關性，所有入組的肺結核患者(A組和B組)ESAT-6的表達量為24.05(18.54，34.89) pg/ml，與CD4+T淋巴細胞計數[476.00(312.00，647.00)個/μl]和CD3+T淋巴細胞計數[599.00(456.00，762.00)個/μl]呈負相關關系(r=-0.462，P<0.01；r=-0.275，P=0.003)；MMP-9表達量為11.05(6.30,14.28) μg/ml，與CD4+和CD3+T淋巴細胞計數也呈負相關關系(r=-0.499，P<0.01；r=-0.341，P<0.01)。

A組中有結核球患者的MMP-9表達量為13.05(11.49，23.90) μg/ml，高于無結核球者的10.50(7.09，15.00) μg/ml，差異有統計學意義(U=203.500，P=0.019)；ESAT-6表達量為33.38(24.65，39.75) pg/ml，高于無結核球患者的15.98(12.18，31.09) pg/ml，差異有統計學意義(U=158.500，P<0.01)。A組中重度通氣功能障礙者ESAT-6表達水平為28.21(12.76，38.51) pg/ml，極重度通氣功能障礙者ESAT-6表達水平為32.19(20.82，36.58) pg/ml，兩者差異無統計學意義(U=307.500，P=0.241)；而A組中重度通氣功能障礙者MMP-9表達水平[10.79(7.10，12.54) μg/ml]明顯低于極重度通氣功能障礙者[17.39(12.47，33.30) μg/ml]，差異有統計學意義(U=150.000，P<0.01)。

表2 結核性毀損肺、繼發性肺結核患者及健康人實驗室檢測指標結果比較

討 論

結核性毀損肺的病變是由多重病變因素導致的，如MTB侵襲導致的病灶壞死及肺組織破壞，以及患者免疫功能低下或并發感染[7]。結核性毀損肺為繼發性肺結核發展的終末階段，具有典型的臨床特點。在本研究中，結核性肺毀損患者肺通氣功能較繼發性肺結核患者更差，這是MTB反復感染引起肺內出現廣泛而不可修復的病灶，造成通氣功能降低，甚至病側肺功能完全喪失的表現。此外，結核性毀損肺患者CT表現形式多樣，如多發空洞、狹窄性支氣管內膜結核、支氣管擴張、肺不張、廣泛纖維化等，也容易并發結核球。本研究發現，有結核球患者ESAT-6和MMP-9表達水平均升高，可能與結核球內MTB及壞死物堆積有關。

ESAT-6是MTB早期產生的分泌靶抗原，僅在致病性MTB中表達。本研究結果顯示，肺結核患者(包括結核性毀損肺患者和繼發性肺結核患者)中ESAT-6表達水平較健康志愿者明顯升高，并與患者免疫功能下降程度密切相關。因此，ESAT-6表達水平升高，可能提示肺結核活動，影響患者免疫功能，MTB破壞正常肺組織，患者更易發生結核性毀損肺。

MMP-9又稱為明膠酶B，是一種能夠特異性水解細胞外基質和基底膜的膠原酶[8-10]。在病理狀態下，MMP-9能通過降解細胞外膠原蛋白來促進腫瘤生長[11]。同時，MMP-9作為炎癥因子，可以促進炎性肉芽腫形成，加重感染[12]。本研究結果顯示，結核性毀損肺患者MMP-9表達水平較繼發性肺結核患者明顯升高，與患者免疫功能下降及病情嚴重程度均密切相關，提示MMP-9作為炎癥因子能進一步促進炎癥反應，加重肉芽腫形成，通過降解細胞外基質導致正常肺組織破壞，也是導致結核性毀損肺發生的重要因素之一。

MTB感染機體后激活免疫防御系統，反復感染后患者免疫細胞計數有不同程度降低。因此，結核性毀損肺患者免疫細胞含量減少，CD3+T淋巴細胞即成熟T細胞減少。MTB侵襲機體過程中需要大量的殺傷T淋巴細胞，即CD8+T淋巴細胞參與，因此，以輔助性T淋巴細胞即CD4+T淋巴細胞減少較明顯，符合細胞免疫過程。而ESAT-6作為毒力因子參與MTB致病，影響細胞免疫，因此，與CD3+和CD4+T淋巴細胞含量呈反比。MMP-9與CD3+和CD4+T淋巴細胞含量也呈反比，與其他文獻報道一致[13]，但MMP-9是否直接參與細胞免疫調節還有待進一步研究。

綜上所述，結核性毀損肺的發生機制目前仍未闡明，筆者初步探討了影響其發生的可能因素，發現ESAT-6及MMP-9的表達升高與結核性毀損肺進展密切相關。根據本研究結果，筆者認為監測結核性毀損肺患者ESAT-6及MMP-9表達水平可以進一步判斷其病情；同時，研發ESAT-6及MMP-9抑制劑或可改善結核性毀損肺患者嚴重程度及其預后。