2′-巖藻糖基乳糖的生物合成菌株構(gòu)建及發(fā)酵條件研究

李晨晨,李夢(mèng)麗,江波,張濤

(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)

人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是母乳中含量?jī)H次于乳糖和脂類的第三大成分,是200多種不易消化和非營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物的復(fù)雜混合物[1-2]。其可作為益生元刺激雙歧桿菌和乳桿菌等有益菌群的生長(zhǎng)[3],作為受體類似物抑制致病微生物對(duì)結(jié)腸黏膜的黏附[4],也可作為免疫調(diào)節(jié)因子,降低免疫相關(guān)的非傳染性疾病的發(fā)生,利于嬰兒腸道正常的消化、吸收、分泌及免疫功能的建立[5],同時(shí)HMOs還可以提供大腦發(fā)育和認(rèn)知所需的潛在必需營(yíng)養(yǎng)素,有助于刺激嬰幼兒大腦發(fā)育以及改善認(rèn)知學(xué)習(xí)能力[6]。2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)作為母乳中分泌最豐富的人乳寡糖,約占總HMOs的30%[7],有研究表明其在預(yù)防瘧疾的發(fā)生有重要作用,由于其具有的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)藥價(jià)值,受到更加廣泛的關(guān)注[8]。

2′-FL的生產(chǎn)可采用化學(xué)合成、酶法合成和微生物發(fā)酵。由于微生物發(fā)酵具有條件溫和、成本低、環(huán)境友好等特點(diǎn),已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)[9]。隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展,多種微生物合成途徑中酶的克隆表達(dá)變得越來(lái)越廣泛。目前研究較多的是以大腸桿菌Escherichiacoli作為模式生物,其具有代謝產(chǎn)出鳥(niǎo)嘌呤5′-二磷酸-β-L-巖藻糖(5′-diphospho-β-L-fucose,GDP-L-fucose)的2條完整通路(從頭合成途徑和補(bǔ)救途徑)[10-12],通過(guò)構(gòu)建代謝合成途徑中的關(guān)鍵酶基因,以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化模式生物進(jìn)行過(guò)量表達(dá),外源表達(dá)α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,發(fā)酵生產(chǎn)2′-FL。CHIN等[13]通過(guò)構(gòu)建從頭合成途徑中的基因manB、manC、Gmd和WcaG進(jìn)行過(guò)量表達(dá),同時(shí)外源表達(dá)來(lái)自幽門(mén)螺桿菌的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,以E.coliBL21(DE3)為表達(dá)宿主菌生產(chǎn)2′-FL,產(chǎn)量達(dá)到0.51 g/L,限于從頭合成代謝途徑過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致產(chǎn)量提高并不顯著。ENGELS等[14]以L-巖藻糖和乳糖為底物,外源添加ATP和GTP作為能量,通過(guò)體外酶法生產(chǎn)2′-FL,此方法雖可提高2′-FL的生成量,但是相對(duì)成本高。由此可見(jiàn),目前2′-FL的生產(chǎn)并未達(dá)到理想水平,為了提高其產(chǎn)量,利用基因工程的方法提高代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的表達(dá),進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)可作為一種較為有效的方法。

本研究通過(guò)共表達(dá)fkp和futC基因到E.coli表達(dá)載體pCDFDuet-1上,獲得重組質(zhì)粒pCD-fkp-futC,建立2′-FL的合成途徑。并通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因敲除β-半乳糖苷酶和UDP-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶基因LacZ和WcaJ,阻斷中間代謝產(chǎn)物的分解,以期降低發(fā)酵過(guò)程中代謝副產(chǎn)物的產(chǎn)生,從而提高2′-FL的產(chǎn)量,為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所需基因來(lái)源于脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)和幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori)。克隆宿主菌為E.coliDH5α,表達(dá)宿主菌為E.coliBL21(DE3),上述2種菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。E.coli表達(dá)載體pCDFDuet-1購(gòu)自Novagen公司。PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,測(cè)序工作委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.2 主要試劑及儀器

甘油、酵母提取物、胰蛋白胨，國(guó)藥集團(tuán);基因組DNA提取試劑盒,上海生工生物工程有限公司;質(zhì)粒快速抽提試劑盒、DNA切膠純化回收試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司;TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等工具酶,TaKaRa(大連)生物有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品2′-FL,Sigma(上海)公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

A360紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TGL-16M高速臺(tái)式大容量離心機(jī),湖南湘儀集團(tuán)；電轉(zhuǎn)化儀、高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf有限公司；Waters e2695高效液相色譜,美國(guó)Waters公司；SDS-PAGE電泳儀、核酸電泳儀、PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司。

1.1.3 培養(yǎng)基成分

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加15～20 g/L的瓊脂粉。

DM培養(yǎng)基(pH 6.8)：檸檬酸 1.7 g/L,KH2PO413.5 g/L,(NH4)2PO44 g/L,MgSO4·7H2O 1.4 g/L,微量金屬溶液10 mL/L(檸檬酸三鐵10 g/L,ZnSO4·7H2O 2.25 g/L,CuSO4·5H2O 1.0 g/L,MnSO4·H2O 0.35 g/L,Na2B4O7·2H2O 0.23 g/L,(NH4)6Mo7O240.11 g/L,CaCl2·2H2O 2.0 g/L)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

B.fragilis和H.pylori全基因組DNA抽提：取1 mL 過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液,按照細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行抽提[15]。

通過(guò)NCBI官網(wǎng)查詢fkp和futC基因序列,根據(jù)其基因序列設(shè)計(jì)引物,fkp基因引入NdeI和XhoI限制性酶切位點(diǎn),futC基因引入NcoI和HindIII限制性酶切位點(diǎn),引物序列fkp-F1/fkp-R1、futC-F2/futC-R2見(jiàn)表1。以抽提的B.fragilis和H.pylori全基因組為模板,PCR擴(kuò)增得到fkp和futC目的片段。fkp基因的PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 180 s,循環(huán)30次,72 ℃ 5 min；futC基因的PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 60 s,循環(huán)30次,72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后采用酶切位點(diǎn)雙酶切、酶連的方法連接質(zhì)粒載體。構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒pCD-fkp-futC,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α,涂布含有鏈霉素(100 μg/mL)抗性的LB固體平板,37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)12 h,篩選陽(yáng)性克隆子,重組質(zhì)粒pCD-fkp-futC抽提后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證并測(cè)序鑒定。

表1 目的基因擴(kuò)增引物Table 1 Sequences of target gene amplification primers

1.2.2 敲除載體和基因同源修復(fù)臂的構(gòu)建[16-17]

以LacZ基因?yàn)槔?通過(guò)http://www.regenome.net/cas-offinder/設(shè)計(jì)基因的gRNA,將設(shè)計(jì)的20 bp序列引入gRNAR中,以gRNAF/gRNAR作為上下游引物,pTargetF質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶DpnI酶切,去除多余環(huán)狀pTargetF質(zhì)粒。將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,小提質(zhì)粒,用引物gRNAPF/gRNAPR測(cè)序鑒定,將構(gòu)建成功的敲除質(zhì)粒命名為pTF-ΔLacZ。

選用E.coliBL21(DE3)基因組DNA為模板,利用上游同源臂引物L(fēng)acZLF/LacZLR和下游同源臂引物L(fēng)acZRF/LacZRR分別擴(kuò)增出同源臂序列片段1和2,產(chǎn)物純化回收后采用SOE-PCR技術(shù)用引物L(fēng)acZLF/LacZRR將片段1和2擴(kuò)增連接起來(lái)獲得基因同源修復(fù)臂。本研究所用引物和gRNA寡核苷酸序列見(jiàn)表2。

表2 gRNA和引物Table 2 Sequences of gRNA and primers

1.2.3 基因敲除菌株的構(gòu)建

以LacZ基因?yàn)槔?將核酸內(nèi)切酶pCas質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板,30 ℃培養(yǎng),篩選獲得含有pCas質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆子E.coliBL21-Δ。將含pCas質(zhì)粒的E.coliBL21-Δ按照文獻(xiàn)描述的方法[18]制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。構(gòu)建成功的敲除載體pTF-ΔLacZ和基因同源修復(fù)臂電轉(zhuǎn)化(1.8 kV,5 ms)上述感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21-Δ,30 ℃復(fù)蘇1 h,涂布至含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壯觀霉素的LB固體平板,30 ℃培養(yǎng)16 h獲得同源重組菌。提取重組菌染色體DNA為模板,以LacZ基因設(shè)計(jì)上下游敲除鑒定引物L(fēng)acZPF/LacZPR對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證,進(jìn)行回復(fù)野生型/重組型的鑒定,并將PCR鑒定為重組型的菌株命名為E.coliBL21-ΔZ。

鑒定成功的E.coliBL21-ΔZ菌株消除pTF-ΔLacZ和pCas質(zhì)粒抗性,培養(yǎng)于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,待OD600值達(dá)到0.2左右,加入0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG),培養(yǎng)12 h后劃線含卡那霉素抗性的LB固體平板,然后克隆子對(duì)壯觀霉素敏感的確認(rèn)為重組質(zhì)粒pTF-ΔLacZ已經(jīng)被消除。疊加敲除WcaJ基因的操作流程同上述LacZ基因流程,將鑒定敲除菌株命名為E.coliBL21-ΔZΔW。敲除重組菌在42 ℃培養(yǎng)過(guò)夜以消除pCas質(zhì)粒[19]。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)

將驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒pCD-fkp-futC轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21-ΔZ和E.coliBL21-ΔZΔW感受態(tài)細(xì)胞,涂布篩選陽(yáng)性克隆子。鑒定正確的陽(yáng)性克隆子挑取至LB液體種子培養(yǎng)基,添加100 μg/mL的鏈霉素,37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng),吸取體積分?jǐn)?shù)為2%的菌液接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,培養(yǎng)至菌體OD600值為0.6～0.8,添加0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá),后添加10 g/L的乳糖和5 g/L的L-巖藻糖作為底物,25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)100 h,定時(shí)取樣,利用HPLC定量檢測(cè)2′-FL的產(chǎn)量。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)不同培養(yǎng)基對(duì)2′-FL產(chǎn)量的影響

分別選用LB培養(yǎng)基和DM培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基,通過(guò)誘導(dǎo)搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)2′-FL,探究不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)其產(chǎn)量的影響。

(2)不同誘導(dǎo)濃度對(duì)2′-FL產(chǎn)量的影響

改變誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為0.1、0.2、0.5、0.8和1 mmol/L,優(yōu)化適合2′-FL發(fā)酵生產(chǎn)的最佳誘導(dǎo)濃度。

(3)不同誘導(dǎo)溫度對(duì)2′-FL產(chǎn)量的影響

采用不同誘導(dǎo)溫度20、25、28、30、37 ℃,搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)2′-FL,探究不同誘導(dǎo)溫度下的產(chǎn)量變化。

(4)不同接種量對(duì)2′-FL產(chǎn)量的影響

采用1%、2%、3%、5%、10%接種量,通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)2′-FL,研究接種量對(duì)2′-FL產(chǎn)量的影響。

1.2.6 檢測(cè)方法

生物量的測(cè)定：將發(fā)酵液稀釋到適當(dāng)濃度,以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照,于600 nm下測(cè)量菌體OD值。

2′-FL、乳糖、L-巖藻糖和甘油的測(cè)定：發(fā)酵液于100 ℃使細(xì)胞破碎10 min,12 000 r/min離心5 min,取上清液經(jīng)0.22 μm 膜過(guò)濾處理,利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件：示差折光檢測(cè)器；色譜柱為Rezex ROA-organic acid(Phenomenex,USA),柱溫為50 ℃；流動(dòng)相為0.005 mol/L的H2SO4水溶液,流速為0.6 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析,采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

分別以來(lái)源于B.fragilis和H.pylori的基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增得到成熟的fkp和futC目的基因片段,fkp長(zhǎng)度大小為2 850 bp,futC長(zhǎng)度大小為903 bp。將fkp和futC目的片段采用酶切位點(diǎn)雙酶切、酶連的方法先后連接到質(zhì)粒pCDFDuet-1中,構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒pCD-fkp-futC,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽(yáng)性克隆子,抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,并同時(shí)測(cè)序鑒定,雙酶切結(jié)果如圖1所示。Fkp和futC基因分別采用NdeI/XhoI和NcoI/HindIII 2個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,結(jié)果顯示2條明顯的條帶,且重組質(zhì)粒雙酶切后出現(xiàn)的條帶大小與預(yù)期相符,同時(shí)測(cè)序結(jié)果與原目的基因序列對(duì)比正確,由此表明fkp和futC目的基因已經(jīng)正確連接到表達(dá)載體pCDFDuet-1上。

M-DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1-fkp基因的PCR克隆產(chǎn)物；2-futC基因的PCR克隆產(chǎn)物；3-pCD-fkp Nde I和Xho I雙酶切產(chǎn)物；4-pCD-fkp-futC Nco I和Hind III雙酶切產(chǎn)物圖1 PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis verified by double digestion of PCR products and recombinant plasmids

圖2 共表達(dá)質(zhì)粒pCD-fkp-futC的構(gòu)建流程Fig.2 Construction of recombinant plasmids pCD-fkp-futC

2.2 敲除載體和基因同源修復(fù)臂的構(gòu)建與鑒定

利用1.2.2小節(jié)中所述方法構(gòu)建敲除載體pTF-ΔLacZ和基因同源修復(fù)臂,DNA聚合酶對(duì)pTargetF質(zhì)粒、上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,小提質(zhì)粒后,經(jīng)引物gRNAPF/gRNAPR測(cè)序鑒定,測(cè)序結(jié)果正確無(wú)誤,表明敲除質(zhì)粒pTF-ΔLacZ可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

利用表2中相應(yīng)引物L(fēng)acZLF/LacZLR 和LacZRF/LacZRR構(gòu)建lacZ基因的上下游同源修復(fù)臂,其長(zhǎng)度大小分別為500 bp,上下游同源修復(fù)臂經(jīng)SOE-PCR技術(shù)融合后長(zhǎng)度大小為1 000 bp。瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶位置大小與原先設(shè)計(jì)預(yù)期相符。疊加敲除WcaJ基因時(shí),敲除載體pTF-ΔWcaJ的構(gòu)建結(jié)果正確,基因同源修復(fù)臂設(shè)計(jì)上下游同源修復(fù)臂大小各為500 bp,融合后長(zhǎng)度大小為1 000 bp(圖3)。

M-DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1-LacZ基因上游同源片段1；2-LacZ基因下游同源片段2；3-LacZ基因上下游融合片段圖3 基因同源修復(fù)供體的PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR products of gene homology repair donors

2.3 基因敲除菌株的驗(yàn)證

根據(jù)GeneBank中E.coliBL21(DE3)的LacZ基因長(zhǎng)度為3 075 bp,采用CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng),經(jīng)過(guò)同源重組篩選,PCR驗(yàn)證正確的敲除菌株,提取基因組DNA,并利用表2中相應(yīng)的引物L(fēng)acZPF/LacZPR驗(yàn)證原始菌株和敲除菌株,片段大小為3 704 bp、629 bp,兩片段相差的長(zhǎng)度正好為L(zhǎng)acZ基因的長(zhǎng)度,PCR驗(yàn)證條帶電泳如圖4所示。挑取的4個(gè)陽(yáng)性交換突變株中的3個(gè)菌株顯示已敲除,且純化回收敲除菌株的PCR產(chǎn)物,經(jīng)測(cè)序鑒定確認(rèn)堿基正確無(wú)誤,說(shuō)明LacZ基因敲除成功,E.coliBL21-ΔZ菌株構(gòu)建成功。

M-DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1-E.coli BL21原始菌的PCR產(chǎn)物；2、3、5-敲除成功LacZ基因后的PCR產(chǎn)物；4-未敲除成功LacZ基因的PCR產(chǎn)物；7、10-敲除成功WcaJ基因后的PCR產(chǎn)物；8、9-未敲除成功WcaJ基因的PCR產(chǎn)物圖4 LacZ、WcaJ基因敲除后的PCR鑒定Fig.4 PCR and sequencing analysis of the post-knockout LacZ and WcaJ gene

敲除載體pTF-ΔWcaJ和WcaJ基因同源修復(fù)臂電轉(zhuǎn)化E.coliBL21-ΔZ中,按照1.2.3小節(jié)的方法進(jìn)行抗性篩選突變株,經(jīng)PCR驗(yàn)證正確的陽(yáng)性突變株,提取基因組DNA,按照表2中的相應(yīng)引物WcaJPF/WcaJPR驗(yàn)證原始菌株和陽(yáng)性突變株。突變株與原始株相差WcaJ基因的長(zhǎng)度,經(jīng)PCR鑒定及測(cè)序結(jié)果顯示確認(rèn)堿基準(zhǔn)確無(wú)誤,說(shuō)明缺失LacZ基因和WcaJ基因的菌株E.coliBL21-ΔZΔW構(gòu)建成功。

2.4 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

構(gòu)建成功的共表達(dá)質(zhì)粒pCD-fkp-futC轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21-ΔZ和E.coliBL21-ΔZΔW菌株,成功篩選出陽(yáng)性克隆子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),后進(jìn)行SDS-PAGE分析。Fkp基因編碼L-巖藻糖激酶/GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶,共949個(gè)氨基酸殘基,其蛋白分子質(zhì)量為106 kDa[20],futC基因編碼α-1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,共300個(gè)氨基酸殘基,其蛋白分子質(zhì)量為33 kDa[21]。通過(guò)SDS-PAGE分析IPTG誘導(dǎo)的E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21-ΔZ和E.coliBL21-ΔZΔW菌株重組酶,并在106 kDa和33 kDa處顯示出明顯的蛋白條帶(圖5),說(shuō)明共表達(dá)質(zhì)粒pCD-fkp-futC被成功誘導(dǎo)表達(dá)。

M-蛋白Marker；1-E.coli BL21對(duì)照；2-轉(zhuǎn)化pCD-fkp-futC的E.coli BL21；3-轉(zhuǎn)化pCD-fkp-futC的E.coli BL21-ΔZ；4-轉(zhuǎn)化pCD-fkp-futC的E.coli BL21-ΔZΔW圖5 重組菌產(chǎn)酶SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme production

2.5 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 發(fā)酵培養(yǎng)基

大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2′-FL可采用多種外加碳源,例如葡萄糖、甘油、甘露糖等,研究發(fā)現(xiàn)甘油在多種碳源中較適宜且經(jīng)濟(jì),所以本實(shí)驗(yàn)采用甘油作為外加碳源。分別利用LB培養(yǎng)基和DM培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。

從搖瓶發(fā)酵結(jié)果來(lái)看,通過(guò)比較3株重組菌E.coliBL21、E.coliBL21-ΔZ和E.coliBL21-ΔZΔW,單敲LacZ基因以及疊加敲除WcaJ基因后,2′-FL的產(chǎn)量均有所提高,且菌體量沒(méi)有發(fā)生顯著性變化。在發(fā)酵100 h時(shí),E.coliBL21原始菌的產(chǎn)量達(dá)到188 mg/L,E.coliBL21-ΔZ缺陷菌株的產(chǎn)量達(dá)到353 mg/L,E.coliBL21-ΔZΔW缺陷菌株的產(chǎn)量達(dá)到919 mg/L,與原始菌相比產(chǎn)量分別提高1.88和4.89倍。說(shuō)明敲除LacZ和WcaJ基因后,更多的碳流向了產(chǎn)物2′-FL代謝的方向,阻斷了其他代謝副產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)抑制,利于產(chǎn)物的不斷積累。

相比LB培養(yǎng)基,采用DM培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基,2′-FL的產(chǎn)量更高。由圖6可知,LB培養(yǎng)基的生物量比DM培養(yǎng)基更高,雖然LB培養(yǎng)基提供了更多的有機(jī)氮源碳源,可是2′-FL產(chǎn)量反而相對(duì)較低,原因可能是有機(jī)氮源碳源主要提供菌體內(nèi)源生長(zhǎng)和主物質(zhì)代謝,不利于2′-FL的代謝積累。通過(guò)對(duì)比2種不同培養(yǎng)基,優(yōu)選DM培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖6 不同培養(yǎng)基對(duì)2′-FL生產(chǎn)的影響Fig.6 Effect of different media on the production of 2′-fucosyllactose

2.5.2 誘導(dǎo)濃度

IPTG是一種誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑,可作為乳糖的類似物與大腸桿菌表達(dá)載體上的乳糖操縱子結(jié)合,進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)載體上目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),目前被廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[22]。誘導(dǎo)劑IPTG的濃度對(duì)2′-FL的產(chǎn)量有一定影響,尋找合適的誘導(dǎo)濃度對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)顯得尤為重要。由圖7可知,采用終濃度為0.1、0.2、0.5、0.8和1 mmol/L進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵,E.coliBL21、E.coliBL21-ΔZ和E.coliBL21-ΔZΔW均顯示相同的誘導(dǎo)產(chǎn)量趨勢(shì),0.2 mmol/L IPTG作為最佳的誘導(dǎo)濃度。在此誘導(dǎo)濃度下,2′-FL的產(chǎn)量可達(dá)到近1 g/L,可以看出誘導(dǎo)濃度對(duì)合成2′-FL具有顯著影響。因此從促進(jìn)底物轉(zhuǎn)化及經(jīng)濟(jì)效益來(lái)說(shuō),選擇0.2 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG作為最佳誘導(dǎo)濃度。

圖7 不同誘導(dǎo)濃度對(duì)2′-FL生產(chǎn)的影響Fig.7 Effects of different induced concentrations on the production of 2′-fucosyllactose

2.5.3 誘導(dǎo)溫度

溫度是影響基因工程菌生長(zhǎng)、質(zhì)粒穩(wěn)定性和重組產(chǎn)物形成的重要環(huán)境因素,大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度是37～39 ℃,然而在較高溫度下,細(xì)菌的比生長(zhǎng)速率較高,發(fā)酵過(guò)程中容易積累代謝副產(chǎn)物,反之則抑制菌體生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的表達(dá)[23]。只有找到細(xì)菌生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物所需的最適溫度,才可能提高重組菌的密度培養(yǎng)和產(chǎn)物的高表達(dá)。

從圖8可以看出,溫度對(duì)產(chǎn)物合成有顯著影響,隨著溫度的降低,2′-FL合成途徑中的關(guān)鍵酶活性上升,其產(chǎn)量呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì),以E.coliBL21-ΔZΔW為例,菌體合成2′-FL的產(chǎn)量從406 mg/L(37 ℃)升高到919 mg/L(25 ℃),進(jìn)一步降低發(fā)酵溫度,關(guān)鍵酶的酶活力受到抑制,2′-FL產(chǎn)量也隨之降低。這說(shuō)明在一定溫度范圍內(nèi),適當(dāng)?shù)慕档蜏囟扔欣?′-FL的表達(dá),但溫度不能過(guò)低。通過(guò)誘導(dǎo)溫度實(shí)驗(yàn),確定了25 ℃為3株重組菌E.coliBL21、E.coliBL21-ΔZ和E.coliBL21-ΔZΔW發(fā)酵合成2′-FL的最適溫度。

圖8 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)2′-FL生產(chǎn)的影響Fig.8 Effect of different induced temperatures on the production of 2′-fucosyllactose

2.5.4 接種量

在微生物發(fā)酵過(guò)程中,接種量的改變會(huì)對(duì)微生物的發(fā)酵時(shí)間、目標(biāo)產(chǎn)物量以及底物利用率產(chǎn)生影響。當(dāng)搖瓶中菌體不足時(shí),微生物生長(zhǎng)速率變慢,其菌體延滯期會(huì)延長(zhǎng),當(dāng)菌體量過(guò)多時(shí),在發(fā)酵過(guò)程中代謝副產(chǎn)物會(huì)大量積累,進(jìn)而影響目標(biāo)產(chǎn)物的得率。因此,選擇合適的接種量顯得尤為重要。分別在1%、2%、3%、5%、10%接種量下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖9,接種量為5%時(shí)對(duì)于菌體發(fā)酵更為有利,3株重組菌E.coliBL21、E.coliBL21-ΔZ和E.coliBL21-ΔZΔW的2′-FL產(chǎn)量分別提高1.87、1.69和1.56倍,2′-FL的最高積累量可達(dá)到1.44 g/L。當(dāng)接種量小于5%時(shí),2′-FL產(chǎn)量偏低,可能是由于接種量較少,細(xì)胞生長(zhǎng)較為緩慢,導(dǎo)致其積累量也減少；當(dāng)接種量大于5%時(shí),菌體延滯期變短,菌量變多,大量的碳源用于菌體生長(zhǎng),僅有少量的2′-FL合成。因此選擇接種量為5%作為最佳接種量。

圖9 不同接種量對(duì)2′-FL生產(chǎn)的影響Fig.9 Effects of different inoculation doses on the production of 2′-fucosyllactose

3 結(jié)論

2′-FL是一種含量豐富的人乳寡糖,在嬰幼兒成長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到不可替代的作用,改善腸道微環(huán)境,增強(qiáng)腸道屏障功能,調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),刺激大腦發(fā)育,改善學(xué)習(xí)和記憶能力等,越來(lái)越多地添加在嬰幼兒配方奶粉中,其受關(guān)注度也日益增加。本文通過(guò)對(duì)來(lái)源于B.fragilis和H.pylori的fkp基因和futC基因克隆表達(dá)載體pCDFDuet-1,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除阻礙代謝途徑中的β-半乳糖苷酶和UDP-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶基因LacZ和WcaJ,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21原始菌、E.coliBL21-ΔZ和E.coliBL21-ΔZΔW基因缺陷菌,結(jié)果表明,通過(guò)重組缺陷菌的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化,2′-FL產(chǎn)量可達(dá)到1.44 g/L,這對(duì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)2′-FL的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。因此基因水平上的進(jìn)一步改造及發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵生產(chǎn)等是今后研究的方向。