一株哈茨木霉的鑒定及固態發酵產木聚糖酶條件研究

張梅娟,錢朋智,董力青,韓楊,汲廣習,馮鎮

1(齊齊哈爾龍江阜豐生物科技有限公司,黑龍江 齊齊哈爾,161031) 2(齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院,黑龍江 齊齊哈爾,161006) 3(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院,黑龍江 齊齊哈爾,161006) 4(東北農業大學 食品學院,黑龍江 哈爾濱,160030)

木聚糖是最常見的半纖維組分,在自然界中含量豐富,是第二可再生多糖資源,僅次于纖維素[1-2]。木聚糖酶是一類可將木聚糖降解成木糖和低聚糖的木糖苷鍵水解酶[2],在食品、造紙、飼料、飲料、生物轉化等領域具有重要價值[3-7]。木聚糖酶分布廣泛,反芻動物瘤胃微生物、真菌、細菌、放線菌、酵母、蝸牛之類的甲殼動物、陸地植物組織、海洋藻類以及各種無脊椎動物中都存在[8-9]。目前報道的木聚糖酶產生菌主要有短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等細菌,以及木霉屬(Trichoderma)、曲霉菌屬(Aspergillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等真菌,且真菌木聚糖酶的活性普遍高于細菌木聚糖酶[8]。

木霉菌包括哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、綠色木霉(Trichodermaviride)、側耳木霉(Trichodermapleuroticola)、深綠木霉(Trichodermaatroviride)和長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)等250余個種類,是一類重要的可再生資源,已成為國際上最具有學術和應用價值的資源微生物之一[10-11]。在工業領域,木霉菌部分種類可產纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和幾丁質酶等多種酶類[11]。目前,有關木霉菌產纖維素酶的研究較多,而產木聚糖酶的研究報道較少。JAINA等[12]對1株深綠木霉產木聚糖酶活力進行研究發現,木聚糖酶活力較低,為5.8 IU/mL。龔愛姣[13]研究的綠色木霉產木聚糖酶活力可達40 216 IU/mL,比原始菌株產酶量高18%。魏瑛[14]以里氏木霉(Trichodermareesei)為實驗菌株,得到的木聚糖酶活力為228 U/mL,比原始菌株提高了近10倍。錢朋智等[15]鑒定的側耳木霉菌株ZJ-03所產木聚糖酶活力在3 000 IU/g以上,且該木聚糖酶可產低聚木糖,占總糖含量的72%。KORKMAZ等[16]從地中海沿海沉積物分離出1株側耳木霉菌株08?K001,可產木聚糖酶。哈茨木霉是木霉屬中應用最廣的1個菌種[9],作為生防制劑,在植物白絹病、幼苗枯病、疫霉病、馬鈴薯黑痣病等病害的防治上起到明顯作用[17-19],還可產生多種活性次級代謝產物,能促進植物的生長[10]。

本研究采用平板水解圈法從平菇栽培污染菌包中篩選出1株高產木聚糖酶的菌株ZJ-01,結合形態學以及核糖體18S序列同源性分析對該菌株進行鑒定,并通過固態發酵法對菌株的產酶條件進行優化,以期為進一步研究該菌株產木聚糖酶用于生產低聚木糖的可行性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要實驗材料

玉米皮、玉米胚芽粕和玉米蛋白粉,齊齊哈爾龍江阜豐生物科技有限公司；玉米芯、玉米秸稈和玉米苞葉,山東禹城盛之源農業科技有限公司。

1.1.2 培養基

馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養基(potato dextrose agar medium,PDA)：參照吳健等[19]的方法制備。

選擇性培養基：木聚糖5 g,NaCl 0.5 g,KH2PO41 g,MgSO40.5 g,瓊脂粉20 g,定容至1 L,pH值自然,高壓滅菌備用。

初始發酵培養基：按4∶3(g∶mL)將玉米皮用水浸泡過夜；將水分60%的玉米胚芽粕粉與浸泡過夜的玉米皮按4∶1質量比混合,添加一定量KH2PO4,pH值自然,高壓滅菌備用。

1.2 儀器和設備

BS-2F型恒溫雙層振蕩培養箱,常州杰諾基儀器有限公司；5418型臺式高速離心機,德國Eppendorf AG公司；2720型PCR儀,美國ABI；DYCP-32A型電泳儀,北京六一生物科技有限公司；DSX-280B不銹鋼自動高壓滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；HH.S11-1數顯電熱恒溫水浴鍋,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離純化和形態學鑒定

從平菇污染菌包上挑取霉菌孢子,接種到PDA平板培養基上,并設空白對照,于28 ℃恒溫培養箱中暗培養(倒置)；培養4～5 d,待長出肉眼可識別的菌落后,用接種針挑取菌落邊緣長勢較好的菌絲至新的PDA培養基上,28 ℃培養；重復3～4 次后得到純化菌株,編號為ZJ-01,接入斜面培養基并于 4 ℃保存備用。

將保存于冰箱的ZJ-01菌株活化,待菌落長滿培養皿后,用5 mm打孔器取塊接種于新的PDA培養基上,于28 ℃恒溫暗培養5 d(倒置),每隔12 h觀察菌落形態,記錄菌絲的顏色變化。

1.3.2 菌株的分子生物學鑒定和系統發育樹構建

菌株ZJ-01基因組DNA的提取：菌株ZJ-01 DNA采用Solarbio基因組DNA提取試劑盒進行。

PCR擴增：以ZJ-01 DNA為模板,進行18S-PCR擴增,所用引物為通用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS8(5′-TCCGCAGCTTCACCTACGGA-3′)。PCR反應體系(20 μL)：2×Master Mix 10.0 μL,DNA模板2.0 μL,NS1和NS8引物(10 mmol/L)各0.8 μL,加雙蒸水補足。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s,56 ℃退火25 s,72 ℃延伸1 min,循環35次；72 ℃延伸5 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電進行檢測。擴增得到的PCR產物送至青島科創質量檢測有限公司進行測序。

序列分析及系統發育分析：將測得的序列與NCBI的GenBank數據庫中的核苷酸序列進行Blast比對,隨機選取相似性較高的序列,運用MEGA7.0軟件進行聚類分析,采用鄰近法(Neighbor-Joining,NJ)構建系統發育樹,進行系統發育分析。

1.3.3 木霉產木聚糖酶的定性

用直徑為0.5 mm的打孔器從純化的木霉菌落平板培養基中取長勢較好的菌落,接種至選擇性培養基中央,于28 ℃恒溫培養箱中暗培養5 d,每天觀察菌落生長狀況和水解圈生成情況。

1.3.4 木聚糖酶液的制備

待PDA平板上長滿菌株ZJ-01孢子,用無菌水洗脫,轉入裝有玻璃珠的無菌水中,振蕩,制成孢子懸液。待孢子懸液數目達到一定數量后,接種到初始發酵培養基中,28 ℃恒溫發酵適當時間,定時振蕩。發酵結束后,將質量分數0.9%的生理鹽水和固態發酵物按6∶1的質量比混勻,浸提4 h,6層紗布過濾；濾液4 ℃離心10 min,所得上清液即為粗酶液。

1.3.5 木糖標準曲線

木糖標準曲線的制作參考方楨的方法并稍作修改[21],以吸光值為橫坐標x,木糖濃度為縱坐標y。所得標準曲線為y=1.237 3x-0.007 4,R2=0.998 5。

1.3.6 木聚糖酶活力的測定

酶活力定義為：在40 ℃、pH 6.0條件下,1 min水解木聚糖生成1 μmol還原糖所需酶的量為1個酶活力單位,用U/g表示[22]。

采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS)測定木聚糖酶的酶活。取1.0 mL適當稀釋的酶液于A、B比色管中,分別加入1.5 mL 1.0% 的木聚糖溶液和蒸餾水(空白對照),45 ℃水浴反應30 min,加入1.5 mL DNS溶液后在沸水浴中煮沸5 min,迅速用冷水冷卻至室溫,加蒸餾水定容至25 mL,在540 nm處分別測定A管吸光值(AE)和B管吸光值(AB)。

參考GB/T 23847—2009方法[22],對木聚糖酶活力計算公式進行簡化并稍作修改,按公式(1)計算:

(1)

式中：r,通過OD540值(AE-AB)從標準曲線上查得與標準木糖溶液相對應的濃度,mg/mL；Df,稀釋倍數；1 000；轉化因子,1 mmoL=1 000 μmoL；6,生理鹽水與固態發酵物的質量比,即水料比；150.14,木糖的摩爾質量,g/moL；t,酶解反應時間,min。

1.3.7 發酵條件的優化

1.3.7.1 最適氮源原料的篩選

保持初始發酵培養基其他成分不變,分別以玉米酒精酒糟、玉米胚芽粕和玉米蛋白粉為氮源原料,與浸泡過夜的玉米皮按4∶1比例混合制成固態培養基(含水量為60%),接種木霉菌株ZJ-01,28 ℃恒溫發酵72 h,定時振蕩,測定酶活,研究不同氮源原料對菌株ZJ-01發酵產酶的影響。

1.3.7.2 最適碳源原料的篩選

保持初始發酵培養基其他成分不變,分別以玉米皮、玉米芯、玉米秸稈、玉米苞葉為碳源原料,與篩選出的最適氮源原料按1∶4比例混合制成固態培養基(含水量為60%),接種木霉菌株ZJ-01,28 ℃恒溫發酵72 h,定時振蕩,測定酶活力,研究不同碳源原料對菌株ZJ-01發酵產酶的影響。

1.3.7.3 最適氮源和碳源原料質量比的篩選

將優化出的最適氮源和碳源原料,按2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1的質量比混合制成固態培養基(含水量為60%),接種木霉菌株ZJ-01,28 ℃恒溫發酵72 h,定時振蕩,測定酶活力,研究不同氮源和碳源原料質量比對菌株ZJ-01發酵產酶的影響。

1.3.7.4 最適發酵時間的篩選

將菌株ZJ-01接種到最優培養基上,28 ℃恒溫發酵24、48、60、72、84和96 h,定時振蕩,測定酶活力,研究發酵時間對菌株ZJ-01發酵產酶的影響。

2 結果與分析

2.1 木霉的形態學鑒定

在28 ℃培養條件下,菌落生長迅速,菌落生長初期呈絨毛狀,白色,有明顯的同心圓環狀產孢區(圖1-a)；隨著菌絲的老熟,顏色由淡綠色變為暗綠色(圖1-b)。本研究所得菌株形態與方圓[23]所描述的哈茨木霉的形態一致。因此,綜合所觀察的菌落的形態學特征,初步將菌株ZJ-01鑒定為哈茨木霉。

a-菌落生長初期;b-菌落生長后期圖1 菌株ZJ-01在PDA培養基上的形態Fig.1 Morphology of strain ZJ-01 on PDA medium

2.2 木霉的分子生物學鑒定

提取菌株ZJ-01的總DNA,通過18S PCR產物測序及序列分析,利用NCBI進行Blast比對,發現ZJ-01的擴增序列與已知木霉屬菌株18S序列一致性可達98%以上。構建進化樹發現(圖2),菌株ZJ-01與哈茨木霉位于同一分枝上,進一步證明菌株ZJ-01為哈茨木霉。

圖2 菌株ZJ-01系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZJ-01

2.3 木霉產木聚糖酶的定性

木聚糖酶是一種水解酶,將能產木聚糖酶的微生物在含有木聚糖的選擇平板上培養可形成明顯的透明水解圈[14,19]。透明圈法具有簡單、直觀和快速等優點,可用于定性木霉產木聚糖酶的研究[15]。經研究發現,在產木聚糖酶定性平板培養基上第3天即可出現較明顯的水解圈,說明菌株ZJ-01可產木聚糖酶。

2.4 產酶條件的優化

2.4.1 氮源原料

本研究選用含有豐富蛋白質的玉米酒精酒糟、玉米胚芽粕和玉米蛋白粉3種物質作為氮源,從中優選適宜氮源。由圖3可知,不同氮源對哈茨木霉產木聚糖酶活力的影響較大。在3種氮源中,玉米酒精酒糟為氮源的發酵培養基中所產木聚糖酶活力最高,可達3 307 U/g,其次是玉米胚芽粕,玉米蛋白粉相對最低,只有1 849 U/g。可能是由于玉米酒精酒糟中蛋白質含量比較豐富,可達24%以上,而玉米胚芽粕中蛋白質含量相對較低,只有17%左右。玉米蛋白粉雖然有很高的蛋白質含量(20%～70%),但加水后黏稠度大,溶氧效果差,會抑制微生物的生長,不利于木聚糖酶的合成。綜上所述,選取玉米酒精酒糟作為最適發酵氮源。

圖3 氮源原料對哈茨木霉產木聚糖酶活力的影響Fig.3 Effect of nitrogen material on xylanase activity of T.harzianum

2.4.2 碳源原料

在微生物的生長代謝中,80%的碳源被用來維持細胞生命活動所需的能量。大多數真菌產生的木聚糖酶都是復合酶,也是誘導酶,半纖維素底物及類似物通常都是木聚糖酶的良好誘導物,而不同碳源誘導產木聚糖酶的水平存在差異性[8]。本研究選用價格低廉易得的玉米皮、玉米芯、玉米秸稈和玉米苞葉4種農副產品副產物為原料,以研究最適碳源。從圖4可以看出,不同碳源原料對哈茨木霉產木聚糖酶活力影響順序依次為：玉米皮>玉米苞葉>玉米芯>玉米秸稈。目前,固態發酵產木聚糖酶的碳源原料多為玉米芯和麩皮等[5,9],選用玉米皮作為碳源原料的研究相對較少[24]。

圖4 碳源原料對哈茨木霉產木聚糖酶活力的影響Fig.4 Effect of carbon material on xylanase activity of T.harzianum

本研究發現玉米皮的誘導能力明顯高于其他碳源,可達到3 346 U/g。可能是因為玉米皮除了含有豐富的半纖維素,還含有較高量的蛋白質和礦物質等木霉所需的營養成分,更有利于木聚糖酶的合成,且比其他3種原料通透性更好,能提高微生物的產酶性能。該結果與宮曉等研究脈孢霉產木聚糖酶的研究結果一致[22]。因此,選用玉米皮作為培養基中的最適發酵碳源原料。

2.4.3 氮源原料和碳源原料質量比

適當的氮源和碳源配比有助于微生物的生長代謝和發酵分解。玉米酒精酒糟和玉米皮均含有微生物生長所需的多種營養成分,且玉米皮又可為微生物的生長提供一個蓬松的環境,兩者的合理比例可誘導哈茨木霉高產木聚糖酶。調整玉米酒精酒糟和玉米皮的質量比分別為2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1。由圖5可知,隨著氮源和碳源質量比的增加,木聚糖酶活力呈現先升高后降低的趨勢。當氮源比例較高時,木聚糖酶活力較大,氮源和碳源質量比為8∶2時,活力最高,可達3 430 U/g,說明高比例的氮源為細胞的快速生長提供了可快速吸收的營養物質,對哈茨木霉的產酶能力有較大影響,而碳源的影響相對較低,但又不能缺少。本結果與魏桃英等的研究結論一致[25]。隨著氮源含量的增加,培養基的蓬松性變差,容易結塊成團,影響溶氧和散熱,不利于菌體的生長和產酶,導致酶活力下降。確定適宜氮源和碳源質量比為8∶2。

圖5 氮源和碳源質量比對哈茨木霉產木聚糖酶活力的影響Fig.5 Effect of mass ratio of nitrogen and carbon on xylanase activity of T.harzianum

2.4.4 發酵時間

分別選用24、48、60、72、84和96 h作為發酵時間,以確定適宜發酵時間。由圖6可知,隨著培養時間的增加,木聚糖酶活力呈現先升高后降低的趨勢。發酵72 h時,木聚糖酶活力最高,達到3 574 U/g；之后,由于培養基的消耗和菌株生長的衰退,酶活力逐漸降低。同時,在整個培養過程中,接種后48 h左右可見白色菌絲,接入的孢子開始萌發；60 h左右培養基表面布有大量淺綠色孢子；72 h后整個培養基長滿暗綠色孢子。由此確定最適發酵時間為72 h。此結果與權淑靜等優化桔綠木霉產木聚糖酶固態發酵條件的研究結論一致[5]。

圖6 發酵時間對哈茨木霉產木聚糖酶活力的影響Fig.6 Effect of fermentation time on xylanase activity of T.harzianum

3 結論

本研究從平菇栽培污染菌包中分離的綠色霉菌菌株ZJ-01,可在PDA培養基上迅速生長,且形態特征與哈茨木霉特征相符。在此基礎上,利用分子生物方法對其進行測序,所得序列與木霉屬中的許多種類具有較高相似性,可達98%以上。系統進化樹分析發現,ZJ-01與哈茨木霉親緣關系較近,可聚為一類,因此將該菌株鑒定為哈茨木霉。通過單因素試驗篩選,得到哈茨木霉ZJ-01固態發酵產木聚糖酶的適宜碳源為玉米皮,氮源為玉米酒精酒糟,氮源和碳源質量比為8∶2,發酵時間為72 h。在優化條件下,木聚糖酶活力為3 574 U/g。本研究的發酵培養基以玉米酒精酒糟和玉米皮為原料,成本低廉,具有應用潛力,可為進一步研究哈茨木霉產木聚糖酶用于生產低聚木糖奠定基礎。