柚皮蛋白的結構表征及細胞免疫活性初步研究

林諾怡，成堅，王琴，馬路凱，梁嘉熹，李素芬，姚文倩, 劉袆帆

(仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州，510225)

我國是柚子生產大國，年生產量達300萬t以上，柚皮約占全果質量的40%，其總產量超過120萬t[1]，大部分柚皮在加工和食用過程中只作為飼料或是廢物丟棄[2]，造成極大浪費，也易造成環境污染等問題。

目前，對柚皮的研究多集中在多糖、柚皮苷、膳食纖維等物質的提取以及利用方面。陳文娟等[3]采用堿浸提法對漳州血柚皮多糖進行提取工藝的優化，得出提取率為20.77%，通過豬油的抗氧化試驗結果表明，血柚皮多糖能有效地清除掉豬油前6 d產生的自由基。劉袆帆等[4]優化超聲波輔助浸提法提取金柚柚皮中的柚皮苷，并對其在體外水平及細胞水平的抗氧化能力進行分析，結果發現其提取率為(3.8±0.4)%,且能有效保護紅細胞免受 AAPH 自由基的攻擊，降低紅細胞的溶血率。王強等[5]研究柚皮膳食纖維不同處理方式對高脂日糧大鼠抑制體質量和調節血脂等功能的影響，試驗表明經擠壓膨化后的超微粉碎柚皮膳食纖維可降低鼠血清中總膽固醇含量及動脈硬化指數，且高劑量柚皮膳食纖維具有良好的潤腸通便和調節血脂作用。

植物源活性蛋白具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等生物活性，而且對人體的毒副作用小，是一種潛在的保健食品和藥物資源。王玉賢等[6]發現冬蟲夏草蛋白提取物可顯著促進正常巨噬細胞中TNF-α,IL-1,IL-12的分泌。此外，CHANG等[7]從茯苓中分離出具有免疫調節活性的蛋白PCP(3.6 kDa),可刺激巨噬細胞產生大量細胞因子，以提高免疫調節作用。柚子中含有的可溶性蛋白含量為11%以上，是一種良好的蛋白質資源，因此，本試驗從柚皮中分級提取蛋白并對其結構特點和體外免疫活性進行系統研究，旨在提高柚皮的附加值，并為柚子精深加工以及柚皮研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金柚購于廣州市場；小鼠IL-6 ELISA試劑盒、小鼠TNF-αELISA試劑盒,欣博生物科技有限公司；NO試劑盒,南京建成生物工程研究所；氨基酸標準品,美國Sigma公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白,上海伯奧生物;NaCl、NaOH、鹽酸、無水乙醇均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Infinite M1000 Pro 酶標儀，美國Thermo公司；Academic A10超純水系統,Millipore公司；Vector33型傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruck公司；PHS-3C型雷磁精密酸度計，上海精密科學儀器有限公司；5424R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Supra55掃描電鏡，德國Zeiss公司；XY-FD-100F真空冷凍干燥機，上海欣渝儀器有限公司；1100型氨基酸自動分析儀，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柚皮蛋白的提取

采用改良Osborne法[8]并略加修改。對柚皮中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白進行分級提取。

將柚皮放入烘箱中烘干后粉碎并過篩，取50 g柚皮粉于燒杯中，加入15倍去離子水(球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分別加入12倍體積的20 g/L NaCl溶液、14倍體積體積分數為65%乙醇溶液和14倍體積的去離子水)，調pH為11.0，50 ℃水浴1.5 h后離心，得到殘渣用于測定殘余蛋白含量，上清液用 0.1 mol/L HCl溶液調節 pH為7.0，50 ℃水浴0.5 h后離心，靜置沉淀后離心分離，得到上清液和不溶物，將上清液調節至清蛋白等電點，靜置沉淀，離心后得到的固形物用純凈水洗滌，冷凍干燥后得到清蛋白。球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的提取方法同上。

1.3.2 蛋白提取率

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，并按公式(1)計算蛋白的提取率：

(1)

1.3.3 掃描電鏡分析

參考SEILER[9]的方法對樣品進行處理:將蛋白過100目篩，取篩下物用雙面膠黏在樣品座上;將樣品座置于離子濺射儀中，在樣品表面蒸鍍1層10～20 nm厚的鉑金膜，調節電鏡至不同的放大倍數，觀察并拍攝照片。

1.3.4 紅外光譜分析

分別精密稱取2 mg干燥柚皮蛋白與100 mg KBr 粉末混合，研磨均勻后壓片處理。放入紅外光譜儀中在400～4 000 cm-1之間掃描，用Nexus系統軟件對采集圖譜進行分析[10]。

1.3.5 氨基酸組成分析

參考LIU等[11]的方法測定柚皮蛋白的氨基酸組成并稍作修改，外標采用16個氨基酸標準品，并使用氨基酸分析儀對蛋白進行氨基酸組成分析。

1.3.6 柚皮中各蛋白的細胞免疫活性

1.3.6.1 RAW 264.7 細胞的培養

從液氮罐中取一株凍存的 RAW 264.7 細胞，快速放入37 ℃水浴鍋中晃動使細胞在短時間內解凍。然后迅速轉移到15 mL無菌離心管中，加入含9 mL體積分數10% 胎牛血清和質量濃度10 g/L雙抗(鏈霉素與青霉素混合液)的DMEM培養基，1 200×g離心10 min。除去上清液，加入新鮮的培養基，吹打細胞混勻，倒入培養皿，在37 ℃，含體積分數5%的CO2的培養箱中培養，每天更換新鮮培養基[12]。

1.3.6.2 細胞存活率

取對數生長期的細胞按每孔1×105的密度接種到96孔板中，培養24 h 后，吸去上清液，按蛋白質量濃度 50、200和 800 μg/mL 加藥，培養24 h，每孔加入10 μL MTS，放入培養箱中反應 1～4 h，使用酶標儀于570 nm波長處測量其吸光度值[13]，細胞存活率按公式(2)計算:

(2)

1.3.6.3 NO和細胞因子的測定

細胞培養24 h 后收集上清液，1 000 r/min 離心 20 min，取上清液，按蛋白質量濃度250、500 和 800 μg/mL 加藥，以10 μg/mL 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作對照，采用酶聯免疫分析法(ELISA)檢測 IL-6和TNF-α含量。具體操作步驟分別參考Griess 和 ELISA 說明書[12]。

LPS溶液制備：向裝有10 mg LPS粉末的管中加入適量的磷酸緩沖鹽溶液，充分溶解后稀釋到10 mL，0.22 μm微孔濾頭過濾除菌，配成1 μg/mL LPS 作為陽性對照[14]。

1.3.8 數據分析

為讓市民享有更多的綠地，本著“有土皆綠”的原則，因地制宜，采取規劃建綠、拆墻透綠、沿河布綠、拆房建綠、見縫插綠等一系列措施，實施主題公園建設，河道治理綠化，道路改造綠化，單位庭院、居民區綠化，中心城區綜合整治綠化，城郊防護林建設等，讓樹成行、林成景，查缺補綠，還綠布綠。如今，新建設20余處主題公園，80余塊游園綠地，新增公園面積400hm2，街頭綠地面積53.33hm2、道路綠地2hm2。

數據以平均值±標準差表示，重復試驗3次，用Origin 8.0以及SPSS 17.0 軟件對分析數據作圖，采用鄧肯多重分析法進行差異顯著分析(P<0.05)，并使用MeV軟件中的層次聚類[15]對氨基酸含量進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白的提取率

用改良Osborne法分級提取柚皮蛋白后，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的提取率為(15.47±0.17)%、(4.20±0.09)%、(0.18±0.02)%和(0.04±0.01)%，柚皮中的粗蛋白含量為21.14%，由于實驗測得的谷蛋白提取率太低，因此暫不考慮其結構與免疫活性的研究。黎婕[16]在沙田柚的柚皮和果肉中測得的可溶性蛋白含量分別為11%和6%，與本試驗中金柚果皮的蛋白含量相差不大。清蛋白和球蛋白的提取率遠大于其他2種蛋白的原因可能是清蛋白與球蛋白在強堿條件下易溶解，而醇溶蛋白則易溶于一定濃度的乙醇溶液，谷蛋白提取率低可能是由于其在柚皮中的含量較少或是蛋白分子間存在大量作用能力強的二硫鍵使得蛋白難以分離[17]，因此，清蛋白、球蛋白與醇溶蛋白是柚皮中的主要蛋白。

2.2 掃描電鏡

將實驗所提取的清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白樣品鍍膜后用掃描電子顯微鏡在100倍下觀察顯微結構，其表面形態如圖1所示，清蛋白(圖1-a)的空間結構為片狀，表面光滑；球蛋白(圖1-b)表面呈現許多褶皺，局部隆起，表面粗糙，局部有孔，呈山脊狀，連接緊密;醇溶蛋白(圖1-c)的空間結構為不規則片狀，分子間有條狀結構連接，表面有較多孔，分子基團之間相連緊密，表面光滑。結構決定物質的功能，3種蛋白表面形狀的不同可能是影響蛋白的生物活性以及功能性質的因素之一[18]。

圖1 柚皮清蛋白(a)、球蛋白(b)和醇溶蛋白(c)的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrographs of pomelo peel albumin (a), globulin (b) and prolamin (c)

2.3 紅外光譜分析

a-清蛋白；b-球蛋白；c-醇溶蛋白圖2 三種蛋白的紅外掃描圖Fig.2 Infrared spectroscopic diagram of different proteins

2.4 氨基酸含量的聚類分析

柚皮中蛋白質氨基酸組分分析見表1。柚皮中清蛋白的必需氨基酸含量占比(essential amino acid/total amino acid,E/T)為13.21%，球蛋白的必需氨基酸含量占12.48%，醇溶蛋白的E/T值為15.13%。結果顯示，柚皮含有豐富的甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)，含量分別為125.49 g/100 g和50.48 g/100 g。甘氨酸屬于甜味類氨基酸，甜度約為蔗糖的0.8倍，可在食品工業上充當甜味劑；丙氨酸也有特殊甜味、香味，與其他呈香味的物質混合使之顯出更高級的香味，丙氨酸比蔗糖甜，甜度為甘氨酸的1.6倍，可廣泛應用于食品行業中，而且在國外已被普遍用于營養強化和調味，而且丙氨酸是蛋白在脂類中溶解度高的疏水性氨基酸之一，能使蛋白中游離的氨基酸容易進入靶細胞從而發揮其生物活性[12]。

熱圖是最近幾年被廣泛應用的統計方法，可聚合大量數據，將結果以漸進色帶直觀展現出來，它的實質就是將有相似性質的對象用數學方法進行分類[20]。為進一步探究氨基酸組成與蛋白功能性質的關聯性，對表1的氨基酸含量數據進行熱圖的聚類分析，結果見圖3，顏色的深淺表示該蛋白中氨基酸的含量差別。從氨基酸含量來看，聚類比較明顯，表明氨基酸含量存在較大的差異。聚類分析將16種氨基酸分為4類(圖3-b、c)，第一類(Gly和Ala)含量最高；第二類包含Glu、Arg、Asp、Pro，其中Glu與Arg含量較高，可能是影響蛋白功能特性的因素之一；第三類包含Met、Phe、Ile、His，這類氨基酸的含量最少；第四類包含Val、Tyr、Ser、Thr、Lys、Leu，此類氨基酸含量比第三類多。值得注意的是，如圖3-a所示，球蛋白與清蛋白、醇溶蛋白的氨基酸總含量的差異較大，清蛋白與醇溶蛋白的氨基酸總含量相差不大，而除去第一類氨基酸后，球蛋白與清蛋白、醇溶蛋白的氨基酸總量差異較大，表明第一類氨基酸含量可能與蛋白的活性效果有關聯。

表1 清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的氨基酸組成 單位：g/100 g

a-氨基酸含量的聚類分析圖；b-第一類氨基酸的聚類分析圖；c-第二、三、四類氨基酸的聚類分析圖圖3 三種蛋白的氨基酸含量的聚類分析Fig.3 Heatmap of amino acid composition

2.5 蛋白的細胞免疫活性

2.5.1 對RAW 264.7細胞存活率的影響

2.5.2 三種蛋白對 RAW 264.7 細胞產NO能力的影響

由圖4-b可知，3種蛋白與空白組均有顯著差異，質量濃度為250 μg/mL，清蛋白能顯著提高巨噬細胞產NO的能力(P<0.05)；在500 μg/mL時，球蛋白與醇溶蛋白的促進能力均有增強，而清蛋白能顯著提高RAW 264.7 細胞產NO的能力，濃度為92.71 μmol/L；質量濃度為800 μmol/L時，3種蛋白均能提高小鼠巨噬細胞產NO的能力，其中清蛋白的表現力最好，NO濃度為95.46 μmol/L。

2.5.3 三種蛋白對 RAW 264.7 細胞產細胞因子能力的影響

細胞因子是介導抗體免疫應答和炎癥反應的物質，TNF-α是由巨噬細胞產生的能殺傷腫瘤細胞和促進B淋巴細胞增生的細胞因子，對腫瘤有抑制或直接溶解的作用[22]。

由圖4-c可知，在刺激細胞分泌細胞因子TNF-α方面，與空白相比，3種蛋白均能顯著提高RAW 264.7 細胞產TNF-α的能力(P<0.05)，其中在50 μg/mL時，清蛋白的促進能力最佳；在200 μg/mL時，清蛋白與球蛋白均能提高刺激小鼠巨噬細胞分泌TNF-α的能力，其中球蛋白促進能力最強；在800 μg/mL時，清蛋白可刺激巨噬細胞產TNF-α的能力，球蛋白次之,TNF-α濃度分別為9 528.05和9 034.34 pg/mL。

由圖4-d看出，在質量濃度50 μg/mL時，3種蛋白提高巨噬細胞產IL-6的能力均顯著高于空白組；在200 μg/mL時，球蛋白刺激RAW 264.7細胞產生IL-6的能力顯著高于清蛋白與醇溶蛋白；在800 μg/mL時，清蛋白能顯著提高RAW 264.7細胞產生IL-6的能力，IL-6質量濃度為1 769.33 pg/mL。綜上所述，清蛋白的免疫活性最強，球蛋白的活性次之。

a-細胞存活率;b-NO產生量;c-TNF-α產生量;d-IL-6產生量圖4 清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的免疫活性Fig.4 Immunomodulatory activities of albumin, globulin and prolamin注：不同字母表示樣品間具有顯著性差異(P<0.05)

3 結論

采用改良Osborne法對柚皮蛋白進行提取，其中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量分別為(15.47±0.17)%、(4.20±0.09)%、(0.18±0.02)%和 (0.04±0.01)%。通過結構分析，清蛋白表面結構為片狀，球蛋白為緊密的孔狀結構，醇溶蛋白表面為條狀相連的片狀，而且發現柚皮蛋白主要由甘氨酸(125.49 g/100 g)和丙氨酸(50.48 g/100 g)組成。由蛋白的免疫活性得知，清蛋白在800 μg/mL時刺激RAW 264.7 細胞產生NO的含量及細胞因子(TNF-α和IL-6)的能力最強，NO、TNF-α和IL-6的濃度分別為95.46 μmol/L，9 528.05 pg/mL和1 769.33 pg/mL。

綜上所述，清蛋白含量最多，其必需氨基酸含量略低于醇溶蛋白，但細胞免疫活性最強，是一種良好的植物源免疫蛋白，在保健食品及醫藥領域可對其進行開發利用。