洋蔥皮乙醇提取物對生鮮豬肉色澤、脂質和蛋白質氧化穩定性的影響

王存堂，高增明，張福娟，朱宏菲，周慶雯，孔保華

1(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 2(東北農業大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱，150030)3(朝陽師范高等專科學校 生化工程系, 遼寧 朝陽,122000)

當前我國肉類消費主要以豬肉消費為主，但是新鮮豬肉往往因為貯藏周期短等原因而造成大量浪費，在貯藏過程中新鮮豬肉會氧化變質或者滋生腐敗菌，這些都會導致豬肉顏色變化、風味惡化、口感變差以及營養成分流失等[1]。因此肉及肉制品的保鮮成為研究者不斷關注的話題。工業生產中肉及肉制品防腐保鮮主要依賴人工合成的抗氧化劑抑制肉的氧化變質，如二丁基羥基甲苯(dibutylated hydroxyl toluene, BHT)、丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyl anisole, BHA)和亞硝酸鹽等。由于合成抗氧化劑的毒性和致癌性導致對天然抗氧化劑的需求逐漸增加[2]。研究發現鱷梨、桑葚、石榴葉、荔枝皮等天然產物的提取物對豬肉及其制品有良好的護色效果，能夠抑制脂質氧化、提升蛋白質氧化穩定性[3-6]。

洋蔥外皮中黃酮類物質含量極為豐富，其成分主要是黃酮類、黃酮醇類和花色素類等，具有抗氧化、抗炎、殺菌、降血壓等生理作用[7]。據報道400 μg/mL洋蔥皮無水乙醇提取物ABTS陽離子自由基清除率高達93%以上，接近槲皮素清除自由基的能力[7]。LEE等[8]證明洋蔥皮提取物具有潛在的抗菌和抗氧化作用，其抗氧化作用是BHT的2倍。對于洋蔥皮提取物在肉及肉制品中的保鮮效果，LEE等[9]研究發現洋蔥皮提取物能夠抑制豬肉香腸脂質氧化，同時降低微生物數量。但是洋蔥皮提取物對生鮮肉的抗氧化及護色作用卻少見報道，本實驗旨在探究洋蔥皮提取物對生鮮豬肉的護色效果，以及對脂質氧化和蛋白質氧化的抑制作用，為洋蔥皮提取物作為天然的抗氧化劑作出進一步研究探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色洋蔥皮,齊齊哈爾市瀏園市場；2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid,TBA)、鹽酸胍,北京Coolaber科技有限公司；ABTS (2,2-聯氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽)、DPPH(1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼),Sigma-Aldrich 化學試劑公司；沒食子酸標準品、蘆丁標準品、福林酚試劑、抗壞血酸、乙醇(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司。

FW100 型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；FiveEasy Plus pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；CR-10 Plus色差計，柯盛行(杭州)儀器有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計 METASH上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 洋蔥皮乙醇提取物(ethanol extract of onion skins, EEOS)的制備

取粉碎的紫色洋蔥皮100 g，加入體積分數70%乙醇200 mL，在25 ℃下浸提2 h，然后將浸提液經6 000 r/min的離心處理，取上清液備用。離心后的沉渣再次經過浸提、離心處理，合并2次離心上清液。將合并后的提取液在旋轉蒸發器中真空濃縮(50 ℃)，再將濃縮液冷凍干燥即為EEOS(得率為10.28%，總酚含量42.12%)，將EEOS儲存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 EEOS總酚含量、DPPH和ABTS陽離子自由基清除性能測定

總酚含量采用福林酚法測定[10]。取0.15 mL用相應的提取溶劑稀釋至質量濃度0.1 mg/mL的提取物樣品溶液于10 mL離心管中，加入1.5 mL 10倍稀釋(0.2 mol/L)的福林酚試劑，利用渦旋混勻器混勻，靜置5 min。加入1.5 mL質量濃度為60 g/L的Na2CO3溶液，然后將此混合液在75 ℃下水浴10 min，隨后立即冰浴終止反應，于725 nm波長處測定反應液的吸光值。以沒食子酸作標準曲線(y=0.031x+0.013，R2=0.998)，總酚含量以每克干提取物中沒食子酸當量表示(mg GAE/g)。

DPPH自由基清除性能參考任曼妮等[10]的方法測定，稍作修改。將4 mL的DPPH甲醇溶液吸光度(1±0.02)與0.4 mL不同質量濃度(0.0125、0.025、0.05、0.10、0.2 mg/mL) 提取物樣品溶液混合。將反應混合物在室溫下搖勻，避光靜置20 min, 在517 nm波長處測定吸光度值的變化。以甲醇代替提取物樣品溶液作為空白對照，以不同質量濃度的VC(0.012 5、0.025、0.05、0.10、0.2 mg/mL)作為對照，樣品對DPPH自由基的清除性能按公式(1)計算:

(1)

通過對DPPH自由基清除性能與提取液濃度之間繪制的劑量效應曲線進行線性回歸分析，結果以IC50表示。IC50是指DPPH自由基濃度減少50%所需要的提取物的質量濃度值(mg/mL)，IC50值越低，自由基清除活性越高。

ABTS陽離子自由基清除性能參考任曼妮等[10]的方法測定，稍作修改。將ABTS溶解于20 mmol/L、pH 4.5的醋酸緩沖溶液中得到7 mmol/L的ABTS陽離子自由基貯液，與過硫酸鉀溶液 (混合體系中終濃度為2.45 mmol/L) 混合，在室溫下避光反應12～16 h，使溶液達到穩定的氧化態。測定前用20 mmol/L、pH 4.5的醋酸緩沖溶液按照適當的比例 (體積比1∶75) 稀釋ABTS自由基貯液，使溶液在734 nm波長下的吸光值達到(0.7±0.02)，以此得到ABTS陽離子自由基工作液，該工作液每次測定前現配。測定時反應體系包括3 mL的ABTS陽離子自由基工作液和200 μL不同質量濃度(0.0125、0.025、0.05、0.10 mg/mL) 提取物樣品混合。室溫避光靜置6 min 后在734 nm波長下測吸光值，以甲醇代替提取物樣品溶液作為空白對照，以不同質量濃度的VC(0.0125、0.025、0.05、0.10、0.2 mg/mL)作為陽性對照，樣品對ABTS陽離子自由基的清除性能按公式(2)計算:

(2)

通過對ABTS陽離子自由基清除性能與提取液濃度之間繪制的劑量效應曲線進行線性回歸分析，結果以IC50表示。

1.2.3 浸漬液的配制

分別將0.5、1.0、1.5、2.0 g EEOS粉末溶于100 mL蒸餾水配制成5、10、15、20 g/L EEOS溶液；將0.5 g VC溶于100 mL蒸餾水配制成5 g/L VC溶液。

1.2.4 豬肉浸漬處理

豬肉選用當天屠宰胴體的背脊部分，市購；所用工具經體積分數75%酒精消毒處理，新鮮豬肉經紫外燈輻照滅菌后，在無菌條件下分割成20.00 g 方形肉塊(長、寬、高分別為5、4、0.5 cm)，然后分別浸漬于蒸餾水、(5、10、15、20 g/L)EEOS溶液和5 g/L VC溶液，2 min后取出，密封于塑料PE 3號自封袋中，置于4 ℃條件下冷藏。共5批樣品，每個樣品15組平行，分別在第1、3、6、9、12天進行測量，每個樣品測量3次，取平均值。

1.2.5 pH測量

取5.00 g肉樣，研磨成肉糜，與20 mL蒸餾水混合，在均質機中混合1 min，用pH計測量其pH值[9]。每個樣品測量3次，取平均值。

1.2.6 色澤測定

使用色差儀測量肉樣的L*(亮度值)、a*(正值代表紅度值)[11]。每個樣品測量3個不同的位點，取平均值。

1.2.7 高鐵肌紅蛋白(metmyoglobin，MetMb)含量測定

在何曉燕等[12]方法的基礎上略加修改，以磷酸鹽緩沖溶液為空白，在525、572、700 nm波長處測得吸光度值，MetMb含量按公式(3)計算：

(3)

式中：Aλ為波長λ nm處的吸光度。

1.2.8 硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)含量測定

脂質氧化的測量參考ZENGIN等[13]的方法并加以修改。取10.00 g肉樣，研磨成肉糜后加入40 mL體積分數10%三氯乙酸溶液，攪拌均勻，置于離心機中6 000 r/min離心5 min，過濾，濾液移至50 mL容量瓶中，用體積分數10%三氯乙酸定容，混勻，靜置10 min后移取5 mL濾液，再加入5 mL TBA溶液，混合后置于95 ℃水浴鍋水浴50 min，取出后冷水浴10 min。然后在波長532 nm處測得吸光度，結果表示為mg/kg，按公式(4)計算：

TBARS/(mg·kg-1)=A532×41.5

(4)

式中：A532為溶液在532 nm 處的吸光度；41.5為每毫升含丙二醛的換算系數。

1.2.9 揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)含量測定

肉樣中TVB-N含量的測定參考BASIRI等[14]的方法，TVB-N值以每100 g牛肉中所含揮發性總堿氮的質量(mg)表示，按公式(5)計算：

(5)

式中:X1為樣品中揮發性鹽基氮的含量，mg/100 g；V1為測定用樣液消耗鹽酸標準溶液體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標準溶液體積，mL；c為鹽酸標準溶液的濃度，mol/L；14為1 moI/L鹽酸標準溶液1 mL相當氮的質量,mg；m為樣品質量，g。

1.2.10 肉樣中蛋白質提取

肌原纖維蛋白的提取參照賈娜等[15]的方法并略加修改，取10.00 g肉樣研磨成肉糜，加入4 ℃，40 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液40 mL(pH 6.8)，勻漿，6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，重復上述步驟3次。沉淀加入4 ℃，0.1 mol/L NaCl溶液40 mL，勻漿，6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，重復該過程2次，第3次加入4 ℃，0.1 mol/L NaCl溶液勻漿后，用2層紗布過濾，濾液經6 000 r/min離心，棄上清液，所得膏狀物為肌原纖維蛋白，將提取的肌原纖維蛋白保存在4 ℃條件下待測。

1.2.11 蛋白質疏水性測定

蛋白質表面疏水性通過蛋白質與溴酚藍的結合量來評價，參照梁慧等[16]的方法，在595 nm處測得吸光度,按公式(6)計算：

(6)

式中:A樣品為樣品組在波長為595 nm下的吸光值；A對照為對照組在波長為595 nm下的吸光值。

1.2.12 蛋白質羰基含量測定

蛋白質羰基含量的測定參照賈娜等[15]的方法并略加修改，用0.6 mol/L NaCl溶液溶解蛋白質，配制成10 mg/mL蛋白溶液。取3 mL蛋白溶液加入4 ℃體積分數20%三氯乙酸1 mL，6 000 r/min離心5 min，棄上清液。在沉淀中加入1 mL 0.2%的二硝基苯肼(用2 mol/L鹽酸配制)，避光振蕩1 h后，加入4 ℃體積分數20%三氯乙酸0.5 mL，然后6 000 r/min離心5 min，取沉淀，沉淀用乙酸乙酯-乙醇溶液(體積比1∶1)洗滌3次，再用3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液溶解沉淀，之后置于水浴鍋中37 ℃水浴15 min。最后離心取上清液，在波長370 nm處測吸光值，同時做試劑空白實驗。按公式(7)計算：

(7)

式中:A樣品為樣品組在波長為370 nm下的吸光值；A對照為對照組在波長為370 nm下的吸光值；0.5為比色光徑，cm；ρ為樣本蛋白質濃度，mg/L。

1.3 數據處理

所有實驗結果用平均值±標準差表示，使用軟件SPSS 21.0系統中的Duncan’s進行差異顯著性分析和相關性分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 EEOS總酚含量及自由基清除活性

洋蔥皮中富含多酚類物質，特別是槲皮素和糖苷類成分是重要的天然抗氧化劑，可清除多種自由基，同時也具有抗菌活性，并對預防心血管疾病和某些癌癥具有積極作用[8]。EEOS中總酚含量以及自由基清除活性見表1，并將其與VC做了對比。CEONG等[17]研究發現紫色洋蔥皮乙醇提取物中的總酚含量為819 mg GAE/g，此結果與本研究相近。由IC50值可知，VC的DPPH和ABTS陽離子自由基清除能力顯著高于EEOS(P<0.05)。一方面，EEOS中的多酚類物質的供氫能力弱于VC,此外，EEOS屬于植物粗提物，其中含有一些雜質，這在一定程度上導致抗氧化活性下降。

表1 洋蔥皮乙醇提取物的總酚含量和自由基清除活性Table 1 Total phenol content and free radical scavenging activity of EEOS

2.2 EEOS對生鮮豬肉pH值的影響

屠宰后豬肉中的肌糖原無氧酵解產生大量乳酸，

且三磷酸腺苷酶促三磷酸腺苷分解產生H3PO4，促使肉質pH值不斷下降，但隨著貯藏期延長，由于自身酶和微生物的影響，肉中的蛋白質和脂肪分解為小分子脫氨基物質NH3和胺類化合物，會造成肉質pH值逐漸回升[18]。EEOS對生鮮豬肉pH值的影響見表2。貯藏期內，豬肉pH值先減小后增大，添加EEOS的各組pH值明顯低于對照組(P<0.05)。貯藏12 d時，添加EEOS可降低豬肉pH值，與對照組相比,20 g/L EEOS處理組pH值減少8.4%。LEE等[9]用泡菜粉制備的乳化香腸pH值略低于其他處理。炮仗花提取物對牛肉漢堡pH值也會產生影響，貯藏期間pH值低于其他處理[19]。5 g/L VC處理組pH值低于對照組和10 g/L EEOS處理組，差異顯著(P<0.05)。

表2 洋蔥皮乙醇提取物對生鮮豬肉pH值的影響Table 2 Effect of EEOS on pH value of fresh pork

2.3 EEOS對生鮮豬肉色澤的影響

豬肉的色澤是評價豬肉新鮮程度一個重要指標，是消費者用以判斷鮮肉貨架期和可接受性的最常用標準，也是決定消費者購買欲最主要的外觀因素。如圖1-a所示，貯藏時間和EEOS添加劑量對生鮮豬肉L*值影響顯著(P<0.05)。第1 天 時，對照組L*值最高為(33.6±0.5)，隨著貯藏天數的增加，L*值逐漸下降。研究者發現,經泡菜提取物處理的豬肉冷藏過程中L*值隨著貯藏時間的延長而降低[20]，但ZAHID等[1]研究發現與對照組相比，經抗氧化劑處理的肉餅在貯藏期內L*值沒有顯著變化。同時各處理L*值在貯藏后期趨于平緩，5、10、15、20 g/L EEOS處理的肉樣L*值在貯藏12天 時與第1天相比分別下降6.8、6.4、6.2、4.8，明顯低于空白對照組(10.8)和陽性對照組(8.6)。這可能是因為洋蔥皮提取物本身的紫紅色色素滲入肌肉表層造成肉樣L*值降低。肖朝耿等[21]研究認為L*值逐漸變平緩和肉糜中甜菜紅色素完全發色有關，紅葉甜菜塊根粉添加量越多L*值越低。

圖1 洋蔥皮乙醇提取物對冷藏過程中豬肉色澤的影響Fig.1 Effect of EEOS on color indexes of fresh pork during refrigerated storage注：不同小寫字母代表同一處理組不同冷藏時間差異顯著 (P<0.05)；不同大寫字母代表同一冷藏時間不同處理組差異顯著(P<0.05)(下同)

隨著貯藏時間增加，a*值逐漸減小，添加EEOS的各組a*值明顯大于空白對照組(圖1-b)，而空白對照組與陽性對照組a*值差異不顯著(P>0.05)。有報道顯示添加牛至的羊肉漢堡a*值最高，隨著貯藏時間的延長，a*值不斷下降[22]，該結果與本文研究結果相同。HAJRAWATI等[18]提出開心果青殼提取物不會影響肉餅的a*值。類似文獻也表明添加了迷迭香和丁香提取物的熟豬肉餅，其顏色變化明顯較慢，與工業抗氧化劑相比更能保護熟豬肉餡餅的紅度值[2]。

2.4 EEOS對生鮮豬肉MetMb含量的影響

生豬屠宰后肌肉纖維中的肌紅蛋白(myoglobin, Mb)和氧合肌紅蛋白(oxymyoglobin, OxyMb)相對比率受MetMb含量的影響， 3種形態的肌紅蛋白相互轉化，導致肌肉中MetMb的積累，影響肉的感官顏色[23]。如圖2所示，冷藏時間對生鮮肉中MetMb含量的影響顯著(P<0.05)，且EEOS處理組MetMb含量均低于空白對照組。這是由于脂質氧化過程中產生的自由作用在肌紅蛋白血紅素基上引起Fe2+的氧化，造成顏色損失[19]。而添加EEOS的各組MetMb含量明顯降低，隨著添加劑量的增大，抑制Fe2+氧化能力越強。第12天時， 20 g/L EEOS處理組抑制MetMb產生的能力是工業抗氧化劑VC的2倍。LEE等[20]研究發現泡菜提取物明顯降低了豬肉中MetMb含量。研究者也注意到開心果青殼中的酚類物質在牛肉餅中的添加量超過750 mg/kg時，肌肉中OxyMb轉化為MetMb的過程才會受到抑制，同時他們也提出了脂質氧化的一二級產物也可能促進MetMb的積累[24]。

圖2 洋蔥皮乙醇提取物對冷藏過程中豬肉MetMb含量的影響Fig.2 Effect of EEOS on MetMb content of fresh pork during refrigerated storage

2.5 EEOS對生鮮豬肉TBARS含量的影響

TBARS是肌肉中脂肪氧化的主要指標。冷藏可以減緩脂肪氧化，但并不能完全阻止脂肪氧化的進行，脂肪氧化產生的自由基會促使二價鐵被氧化成三價鐵，導致Mb被氧化為MetMb[16]。EEOS在生鮮豬肉中對脂質氧化的抑制效果如圖3所示，貯藏期內TBARS含量呈逐漸上升的趨勢，這說明脂質二次氧化產物丙二醛含量不斷增加，添加了EEOS和VC的各組TBARS含量均低于空白對照組。EEOS中富含豐富的酚類化合物是抑制脂質氧化的主要成分，酚類化合物可以通過螯合過渡金屬離子，特別是鐵和銅離子，抑制自由基的形成和自由基反應的傳播[3]。LEE等[20]證明了貯藏時間會影響TBARS含量，添加了不同劑量的泡菜提取物均對豬肉脂質氧化產生抑制作用。第12天時，與空白對照組相比，20 g/L EEOS處理組TBARS含量下降53.1%，抑制效果明顯。經EEOS處理的各組，質量濃度越大抑制脂質氧化的能力越強，當EEOS的質量濃度大于10 g/L時，其抗氧化效果優于工業抗氧化劑VC。該結論與肉樣中肌紅蛋白氧化抑制結果相同，可間接證明SADEGHINEJAD等[24]所發現的脂質氧化的一二級產物會促進MetMb的積累。類似的研究也表明，同對照組相比，羊肉中添加土豆皮提取物TBARS含量減少54%[25]，石榴皮提取物可降低牛肉丸中63.0% 的TBARS含量[26]，與本實驗相似。

圖3 洋蔥皮乙醇提取物對冷藏過程中豬肉TBARS值的影響Fig.3 Effect of EEOS on TBARS value of fresh pork during refrigerated storage

2.6 EEOS對生鮮豬肉蛋白質表面疏水性的影響

圖4 洋蔥皮乙醇提取物對冷藏過程中豬肉蛋白質表面疏水性的影響Fig.4 Effect of EEOS on the protein surface hydrophobicity of fresh pork during refrigerated storage

2.7 EEOS對生鮮豬肉蛋白質羰基含量的影響

蛋白質羰基含量是判斷肉中蛋白質氧化程度的重要指標，肌肉蛋白質氧化會使蛋白質羰基增加，從而導致某些氨基酸側鏈(如賴氨酸、脯氨酸、精氨酸和組氨酸殘基)的氧化降解[1]。由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，蛋白質羰基含量逐漸增加，貯藏期內，各處理組羰基含量均低于空白對照組。第12天，空白對照組羰基含量達到最大值(43.53 nmol/mg),5 g/L VC處理組比其低6.8%，20 g/L EEOS處理組比其低29.2%。EEOS能有效抑制蛋白質氧化與其自由基清除能力和抑菌作用有關。經EEOS處理的3組(10、15、20 g/L)在第1～6天內，蛋白質羰基含量增長緩慢，隨后則急劇上升。RODRGUEZ-CARPENA等[3]研究發現,豬肉餅在冷藏過程中蛋白質氧化產生的羰基化合物含量明顯增加，而鱷梨提取物的添加在一定程度上能夠抑制蛋白質的氧化。

圖5 洋蔥皮乙醇提取物對冷藏過程中豬肉羰基含量的影響Fig.5 Effect of EEOS on the carbonyl content of fresh pork during refrigerated storage

2.8 EEOS對生鮮豬肉TVB-N含量的影響

內源酶或腐敗菌能將肉中蛋白質和其他含氮物質降解成氨、三甲胺和二甲胺等揮發性堿而形成TVB-N，因此TVB-N是評價鮮肉品質的重要指標之一[28]。TVB-N值與腐敗菌群之間有顯著的相關性，隨著肉質中微生物侵染程度加深，TVB-N值會隨之增加。國家標準規定：鮮肉TVB-N值≤20 mg/100 g。如圖6所示，隨著冷藏時間的延長，各處理組TVB-N 值均呈上升趨勢。空白對照組在第6天達到 15.62 mg/100 g，第9天已達到26.37 mg/100 g，該值超過鮮肉的標準，而第9天時，僅15和20 g/L的EEOS 處理組TVB-N值均小于20 mg/100 g，生鮮肉維持在鮮肉范圍內，而在第12天時，各處理組的TVB-N值均高于20 mg/100 g。EEOS的加入，可以延緩肉樣腐敗程度，延緩肉質中TVB-N的生成，且EEOS質量濃度為20 g/L時，抑制效果顯著。LEE等[9]的研究結果也表明洋蔥皮提取物對肉的腐敗有抑制作用，這可能與EEOS的抗菌作用有關。此前，就有報道表明洋蔥皮對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黃體微球菌和單核細胞增生李斯特菌等具有抑制作用[28]。

圖6 洋蔥皮乙醇提取物對冷藏過程中豬肉TVB-N含量的影響Fig.6 Effect of EEOS on TVB-N content of fresh pork during refrigerated storage

3 結論

洋蔥皮乙醇提取物富含多酚類成分，具有很強的抗氧化能力。本研究將豬肉切片在EEOS水溶液中浸漬處理后冷藏，主要是模擬在今后的生產中將EEOS處理液噴涂于豬肉表面，達到抑制表面肉質肌紅蛋白氧化導致的色澤褐變、脂肪和蛋白氧化引起的風味劣變以及微生物浸染導致的貨架期縮短等不利因素，從而達到提高豬肉新鮮度和延長肉質貨架期的目的。EEOS的添加降低了豬肉切片高鐵肌紅蛋白含量，提高了肉質表面色澤，降低了脂肪和蛋白氧化的程度，減少 TBARS 值的增加和羰基化合物的生成，微生物侵染程度(TVB-N值)的增加也得到抑制，且高濃度EEOS浸漬的處理效果更加顯著。綜上所述，洋蔥皮乙醇提取物作為天然抗氧化劑對豬肉的顏色改善、抑制脂質、蛋白質氧化以及微生物侵染程度具有很好的效果。