谷氨酰胺轉氨酶添加量對蛋黃粉乳化性和凝膠性的影響

黃笛,李翠云,萬敏惠,程琴,駱香遠,鐘佶良,葉勁松

(四川農業大學 食品學院,四川 雅安,625014)

蛋黃粉是以新鮮雞蛋黃為原料,經過清洗、消毒、干燥等工序得到的含水量低于5%的粉質，具有優異的乳化性和凝膠性,被廣泛地作為食品添加劑用于食品加工業[1-2]。而在蛋黃粉加工過程中,殺菌和干燥過程由于溫度過高,會嚴重影響蛋黃粉的功能性質,使所得蛋黃粉難以滿足工業需求。FABIEN 等[3]研究表明74 ℃加熱12 min會使蛋白質發生熱變性,形成不溶性聚集體使溶解度呈直線下降,熱變性還會影響乳液滴粒徑和絮凝性能進而影響乳液的流變性能。喬立文[4]研究發現,熱處理會導致不同蛋白質的變性,在加熱過程中蛋白質不斷展開與聚合,導致總的表面疏水性與巰基含量隨加熱溫度與時間發生復雜的變化,使全蛋液黏度增加,并在67 ℃時全蛋液由牛頓流體變為假塑性流體,最終導致蛋白質變性影響其功能性質。

因此,如何有效提高蛋黃粉功能性質顯得至關重要。對提高蛋黃粉功能性質研究較多的是酶法改性。谷氨酰胺轉氨酶(glutamine transaminse,TGase)是轉移反應的轉移酶,在肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧基(酰基供體)和不同酰基受體之間的轉移,使蛋白質發生交聯反應,改善蛋白質的結構與功能,從而提高蛋白質的乳化性、保水性和凝膠性等功能性質。TGase由于其優異的酶改性效果,被廣泛應用于食品加工業,如LUCILLA 等[5]研究發現TGase交聯作用可促進谷醇溶蛋白形成蛋白質網絡結構,從而影響無麩質面粉的感官特性。QIU 等[6]研究發現TGase有限的交聯可通過展開蛋白質結構使更多的疏水基團暴露,蛋白質分子的解折疊和最初埋在蛋白質分子中的巰基基團的暴露，從而改善花生球蛋白和伴花生球蛋白的溶解性、乳化性和凝膠性等。然而TGase在雞蛋中的研究報道很少,在蛋黃粉中的運用未見報道。

本研究將TGase作用于蛋黃液，對蛋黃液中的蛋白質進行改性，通過噴霧干燥得到蛋黃粉，研究經TGase交聯作用之后的蛋黃粉乳化性和凝膠性能的變化，并通過傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和測定表面巰基數分析TGase作用機理，為專一性蛋黃粉的生產提供理論支持，促進雞蛋深加工業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋，雅安名山黃家鮮雞蛋門市(蛋雞品種：大五金鳳)；精煉一級大豆油，益海嘉里食品營銷有限公司；谷胺酰胺轉氨酶(酶活力為100 U/g),南京龐博生物有限公司。

三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane THAM，Tris)，江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，博士德生物技術有限公司；2-硝基苯甲酸(2-nitrobenzoic acid，DTNB)、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、考馬斯亮藍G-250,成都市科隆化工試劑廠；NaCl、KBr、NaOH、甘氨酸、鹽酸、尿素、鹽酸胍、檸檬酸、磷酸、無水乙醇、甲醇、乙酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

B-290小型噴霧干燥儀,瑞士BUCHI公司；Varioskan Flash酶標儀,美國Thermo Fisher科技公司；DYCZ-240型電泳儀及電源,北京市六一儀器廠；Thermo-ST16R低溫高速離心機,北京聯合科力科技有限公司；TA-XTPlus型物性測試儀,英國SMS公司；Thermo Scientific NicoletIS10型傅里葉變換紅外光譜儀,賽默飛世尓科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋黃粉加工工藝流程

揀蛋→洗蛋→消毒→清水噴淋→吹干→打蛋、分蛋→酶處理→巴士殺菌→冷卻、過濾→噴霧干燥→出粉→包裝

(1)消毒：將完好潔凈的鮮雞蛋于清水中清洗,再置于4 g/L NaOH溶液中浸泡5 min,最后用蒸餾水清洗晾干備用。

(2)酶處理:用蒸餾水將鮮蛋黃液稀釋1.5倍,并調節pH值為7.5,加入現配的TGase溶液,添加量分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 U/g蛋黃,混勻并密封置于35 ℃的恒溫水浴鍋中反應3.5 h,得到TGase處理后的蛋黃液樣品。

(3)噴霧干燥:將酶處理所得蛋黃液于噴霧干燥進口溫度為150 ℃,進料溫度45 ℃,進料速率30%條件下進行干燥,得到蛋黃粉并進行指標測定。

1.3.2 蛋黃粉熱凝膠強度測定

凝膠測定參考車用真[7]的方法,并略作修改。

(1)凝膠的制備：蛋黃粉與蒸餾水按質量比1∶3復溶→取溶液10 mL放于20 mL的燒杯中→用保鮮膜封口,并用橡皮筋扎緊→置于80 ℃水浴加熱50 min→立即放入冰水中冷卻20 min→存放于4 ℃冰箱中過夜→恢復到室溫→測定凝膠強度。

(2)凝膠強度的測定:測試前速度5 mm/s,測試速度2 mm/s,測試后速度5 mm/s,測試距離為15 mm,選用P/5探頭,凝膠強度用硬度即探頭下壓過程中的最大感應力(g)表示,重復3次取平均值。

1.3.3 蛋黃粉溶液熱凝膠持水力測定

參照HANDA 等[8]研究方法，略有改動。蛋黃溶液按照質量比為1∶3向蛋粉中加入蒸餾水進行配制。量取5 mL蛋黃溶液于離心管中，于80 ℃水浴40 min，立即在冰水中冷卻至25℃后，8 000×g離心20 min，小心將離心液倒出，稱取沉淀質量。蛋黃粉溶液熱凝膠持水力(water holding capacity，WHC)按照公式(1)進行計算：

(1)

式中：m0為離心之前蛋黃凝膠質量，g；m1為離心之后沉淀的質量，g。

1.3.4 乳化性測定

根據GUO等[9]的研究方法進行調整。在25 ℃下，將不同條件下制得蛋黃粉末加入蒸餾水中制備質量分數為0.5%的蛋黃溶液。將15 mL蛋黃溶液和15 mL大豆油加入高速勻漿機，在10 000 r/min勻漿均質2 min。然后立即從乳液底部吸取50 μL與5 mL 1 g/L SDS溶液混合，并在500 nm波長下測量混合物的吸光度。用乳化活性指數(emulsification activity index，EAI)和乳化穩定性指數(emulsification stability index，ESI)來評價乳化性質，EAI可根據蛋白乳液的吸光值確定，ESI按照公式(2)進行計算：

(2)

式中：A0和A10是蛋白乳液在0和10 min下測定吸光度值。

1.3.5 表面巰基數測定

參考BEVERIDGE等[10]方法略作修改。75 mg蛋黃粉樣品用1 mL Tris-甘氨酸緩沖液(10.4 g Tris，6.9 g甘氨酸，1.2 g EDTA，用0.1 mol/L HCl溶液調pH至8.0，定容至1 000 mL)混勻后加4.7 g鹽酸胍，用緩沖液定容至10 mL。測定巰基時，取1 mL上述溶液加4mL脲-鹽酸胍溶液和0.05 mL Ellman’s試劑，以不加Ellman’s試劑的為空白對照，于412 nm 處測定吸光值。按公式(3)計算蛋黃粉表面巰基數：

(3)

式中：A412為412 nm處的吸光值；D為稀釋因子，為5.02；ρ為樣品質量濃度，mg/mL。

1.3.6 SDS-PAGE電泳分析

參照PANOZZO[11]的方法,略有改動。采用SDS-PAGE進行電泳分析,并分析TGase對蛋黃粉中蛋白質的交聯情況。

1.3.7 FTIR

本實驗參照葛紹陽等[12]的研究方法進行測定。取在不同處理條件下制得的蛋黃粉與KBr,研磨均勻,壓片。實驗條件：光譜分辨率4 cm-1,測量范圍4 000～400 cm-1,掃描信號累加32次,對蛋黃粉中蛋白質二級結構進行分析,探究TGase處理對蛋黃粉品質影響的機理。

1.4 數據統計與分析

實驗均重復3次，數據結果均采用均值±標準差形式。FTIR實驗數據采用OMNIC 8.0及Origin 9_64軟件處理及繪圖。實驗數據采用SPSS軟件進行統計學分析處理，數據差異性采用單因素方差分析中的最小顯著差異法，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同TGase添加量的蛋黃粉凝膠性的變化

由圖1可知,隨TGase添加量的增加,蛋黃粉的凝膠性和WHC均呈現先增加后降低的趨勢,在TGase添加量為1.5 U/g蛋黃時均達到最大。在TGase添加量為0～1.5 U/g蛋黃范圍內,隨著TGase添加量的增加,促使蛋黃中蛋白質交聯形成分子質量相對較大的蛋白,形成的網絡結構能結合更多的水分子,因此樣品的WHC和凝膠硬度也隨之增強,當TGase添加量為1.5 U/g 蛋黃時,TGase 對蛋黃中的蛋白質交聯作用達到最佳。但當TGase添加量超過1.5 U/g 蛋黃時,隨著酶的添加,蛋黃粉的凝膠強度和保水性開始下降,可能是因為交聯過度,形成的凝膠網絡結構致密,不利于與周圍自由水水分子的結合,從而使WHC和凝膠硬度均降低[13]。

圖1 TGase添加量對蛋黃粉的凝膠性和持水性的影響Fig.1 Effect of TGase closagen on the gel hardness and water holding capacity of egg yolk powder注：a-g和A-B分別表示不同TGase添加量的蛋黃粉凝膠硬度和持水性具有顯著差異

2.2 不同TGase添加量的蛋黃粉乳化性的變化

由圖2可知,隨著TGase添加量的增加,蛋黃粉的EAI呈現先升高后降低的趨勢,在蛋黃粉添加量為2 U/g蛋黃時達到最大。在TGase添加量為0～2 U/g蛋黃范圍內,隨著酶添加量的增加蛋白質聚合物增多,使油水界面單位面積的蛋白質聚合物數量增加,降低了油水界面的表面張力,因此EAI增大。當TGase添加量超過2 U/g蛋黃時,過度交聯會使蛋白質聚集的效果增強,蛋白質溶解度降低,油水界面單位面積的蛋白質數量減少,因此EAI減小。

圖2 TGase添加量對蛋黃粉的乳化性的影響Fig.2 Effect of TGase closage on the emulsifying properties of egg yolk powder

蛋黃粉的ESI隨 TGase 添加量的增加呈現先降低后升高的趨勢,在 TGase 添加量為 2 U/g 蛋黃時,取到最小值,在 TGase 添加量為 0～2 U/g 蛋黃范圍內,隨著 TGase 添加量的增加,蛋黃中蛋白質 的交聯程度越來越大,小分子交聯形成較大分子量的蛋白質,使得微粒尺寸增大,ESI 降低,當 TGase 添加量超過 2 U/g 蛋黃時,交聯過度,大分子蛋白質網絡結構更加緊密,微粒尺寸減小,ESI 升高[14]。

2.3 TGase對蛋黃粉凝膠表面巰基數的影響

由圖3可知,隨TGase添加量的增加,蛋黃粉凝膠表面巰基數呈現逐漸降低的趨勢,在酶添加量大于2 U/g蛋黃時下降較快。隨著TGase添加量的增加,小分子蛋白質交聯形成一定空間網絡結構的大分子蛋白質,水分子進入此空間可能與蛋白質肽鏈發生結合,使肽鏈間的巰基裂解轉化為二硫鍵(二硫鍵是凝膠形成過程中最主要的作用力),導致巰基數減少。當交聯過度時,形成的網絡空間更加緊密,巰基被包埋于蛋白質內部[15],以及TGase發揮交聯作用時,新形成的交聯肽鏈中含有硫氨基酸,硫氨基酸之間相互接近,通過氧化形成二硫鍵,導致巰基數下降較快[16]。

圖3 TGase對蛋黃粉凝膠表面巰基數的影響Fig.3 Effect of TGase addition on the gel surface thiol number of egg yolk powder

2.4 SDS-PAGE電泳分析

由圖4可以看出,隨TGase添加量的增加,條帶c(分子質量為48 kDa)和條帶d(分子質量為25 kDa)及分子質量小于25 kDa的蛋白質分子條帶顏色逐漸變淺,條帶a(分子質量大于245 kDa)和條帶b(分子質量為180 kDa)顏色逐漸加深,在TGase添加量為1.5 U/g蛋黃時變化較明顯。結合圖1凝膠性測定可知,隨TGase添加量的增加,小分子蛋白質交聯成分子質量較大的蛋白質,且形成的凝膠網絡結構有利于水分子的結合,因此小分子質量的條帶變淡,當TGase添加量為1.5 U/g蛋黃時,蛋白質分子內和分子間交聯反應強,過度的交聯形成的大分子蛋白質數量增多,形成的凝膠網絡結構緊密,不利于水分子的結合,因此大分子質量的條帶顏色變深。

圖4 不同TGase添加量處理的蛋黃粉蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoretogram of egg yolk powder treated by TGase under different TGaseclosage注：泳道1～8分別是TGase添加量為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 U/g的蛋黃粉

2.5 蛋黃粉中蛋白質二級結構變化

圖5 不同TGase添加量處理下的蛋黃中蛋白質的FITR圖Fig.5 FITR spectra of egg yolk powder treated by TGase under different TGase dosage注：曲線1～8分別是TGase添加量為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 U/g的蛋黃粉

BLUME等[18]研究指出,1 600～1 639 cm-1為 β-折疊,1 640～1 650 cm-1為γ-隨機結構,1 651～1 660 cm-1為 α-螺旋結構,1 661～1 700 cm-1為 β-轉角結構,β+α結構被指認為是蛋白質分子內總相互作用的氫鍵,代表蛋白質分子的緊密程度。

對圖5中不同TGase添加量處理下的蛋黃粉的圖譜進行酰胺Ⅰ區分峰擬合,計算峰面積,得到蛋黃粉中蛋白質各二級結構所占的百分比。由表6可知,隨TGase添加量的增加,α-螺旋百分量呈現先增加后下降的趨勢,而 β-折疊百分量趨勢相反,呈現先降低后增加的趨勢,β+α結構含量基本無變化。適度的交聯反應能促使蛋白質二級結構中的 β-折疊轉化為 α-螺旋,提高乳化液油水界面的張力,能更緊致的包裹油滴,因此形成的乳液平均值粒徑更小,當交聯過度時,分子之間的相互作用使 α-螺旋轉化為 β-折疊,乳化液油水界面的張力減小,油滴的體積增大,因此形成的乳液平均值粒徑變大。

表6 不同TGase添加量處理下蛋黃中蛋白質二級結構的變化Table 6 Changes of secondary structure of protein in egg yolk under different TGase dasage

3 結論

凝膠性和乳化性能作為蛋黃粉主要的功能性質,在食品加工業中具有重要的地位[19],通過酶改性提高蛋黃粉的凝膠性和乳化性能擴大其運用領域。本實驗結果表明：

(1)TGase添加量為1.5 U/g蛋黃時,由于適度的交聯反應,使蛋黃粉中部分巰基轉換為二硫鍵,以及小分子蛋白質間交聯形成的網絡結構有利于水分子與肽鏈之間的結合,水分子的結合使連接肽鏈間的共價鍵的數目增加,凝膠性硬度增強[20],因此,能獲得凝膠性較高的蛋黃粉。

(2)TGase添加量為1.5 U/g蛋黃時,由于適度的交聯反應能改變蛋黃中蛋白質的二級結構,使 α-螺旋結構含量增加,蛋白質中 α-螺旋結構的增加會增大蛋白質分子的柔韌性,有助于其在油水界面的吸附和展開,加快蛋白質在油水界面的擴散和吸附的速率,因此,乳化活性提高；但當交聯過度時,會造成 α-螺旋內部氫鍵斷開,解螺旋并展開,形成 β-折疊,從而降低乳化活性[12],因此,TGase添加量為1.5 U/g蛋黃時,能得到乳化性最佳的蛋黃粉。