不同類型發(fā)花磚茶特征香氣成分研究

金友蘭，黃甜，蔣容港, 黃芳芳, 劉仲華,3, 黃建安, 李勤,3*

1(茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué))，湖南 長(zhǎng)沙, 410128) 2(國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙,410128) 3(湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙, 410128) 4(益陽(yáng)茶廠有限公司，湖南 益陽(yáng), 413046)

“發(fā)花”是茯磚茶加工過(guò)程中重要的加工工藝。優(yōu)勢(shì)菌種冠突散囊菌在適宜溫濕度條件下快速繁殖，茶葉內(nèi)含成分在濕熱作用和微生物胞外酶作用下發(fā)生復(fù)雜的變化，從而形成了茯磚茶特有的品質(zhì)特征[1-2]。研究表明，茯磚茶特有的風(fēng)味品質(zhì)與保健功效的形成與“發(fā)花”工序密切相關(guān)[3-4]。

茶葉中的揮發(fā)性物質(zhì)是決定茶葉品質(zhì)與風(fēng)味的重要因子之一。迄今為止，從茶葉中分離鑒定出的芳香物質(zhì)已有數(shù)百種。近年來(lái)，隨著茯磚茶的逐漸興起及其獨(dú)特的保健功效[5-9]，越來(lái)越多的廠家通過(guò)對(duì)不同類型的毛茶原料進(jìn)行“發(fā)花”處理，開(kāi)發(fā)了多種新型發(fā)花磚茶產(chǎn)品，而發(fā)花紅茶磚和發(fā)花白茶磚是其中2種主要的類型。但是，由于目前關(guān)于發(fā)花白茶磚和發(fā)花紅茶磚品質(zhì)特征研究較少，其特征香氣成分尚不明確，阻礙了其生產(chǎn)工藝的發(fā)展和產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化。

本研究以茯磚茶、發(fā)花白茶磚和發(fā)花紅茶磚為研究對(duì)象，采用感官審評(píng)、頂空固相微萃取、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、香氣活性值(odor activity value,OAV)值法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，研究不同類型發(fā)花磚茶特征香氣成分，以期為發(fā)花磚茶工藝、產(chǎn)品創(chuàng)新和標(biāo)準(zhǔn)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

以白茶、紅茶和黑毛茶為原料發(fā)花的發(fā)花白茶磚、發(fā)花紅茶磚和茯磚茶,購(gòu)于市場(chǎng)。

1.1.2 主要儀器和試劑

Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀、HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)色譜柱,美國(guó)Agilent公司；50/30 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯涂層纖維(DVB/CAR/PDMS)萃取頭，美國(guó)Supelco公司；磁力加熱攪拌器,北京康林科技有限責(zé)任公司；電子天平。

NaCl,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；癸酸乙酯,美國(guó)Sigma試劑公司。正構(gòu)烷烴混標(biāo)(C8-C40)，上海Sigma-Aldrich公司。

內(nèi)標(biāo)溶液配制：取癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品母液0.1 mL于100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，配制成質(zhì)量濃度為0.864 g/L的標(biāo)準(zhǔn)液，然后稀釋到8.64 mg/L，分裝,放置4 ℃下備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 感官審評(píng)方法

感官審評(píng)按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》[10]，對(duì)發(fā)花磚茶外形和內(nèi)質(zhì)進(jìn)行描述和打分。

1.2.2 香氣分析方法

稱取1.0 g磨碎的茶樣與0.5 g NaCl加入到20 mL頂空萃取瓶中，加入5 mL沸騰蒸餾水以及10 μL癸酸乙酯內(nèi)標(biāo)溶液，封口，80 ℃、400 r/min磁力攪拌器平衡10 min后插入裝有50/30 μm萃取頭的手動(dòng)進(jìn)樣手柄，吸附萃取40 min后，收回萃取頭纖維部分再取出萃取頭，并盡快插入GC-MS進(jìn)樣口中，250 ℃解析5 min。

GC條件：Agilent HP-5MS色譜柱,石英毛細(xì)管柱(30 m×250 μm,0.25 μm);升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持1 min，然后以15 ℃/min升至280 ℃，保持1 min，以280 ℃運(yùn)行3 min，溶劑延遲時(shí)間為3 min。載氣為高純氦氣(純度>99.999%)，載氣流速1 mL/min；進(jìn)樣模式不分流。

MS條件：離子源(EI)，離子源溫度230 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，EI源能量70 eV，電子倍增電壓;880 V，采用全掃描模式,掃描范圍35～400 u。

定性方法：由GC-MS分析得到各色譜峰的質(zhì)譜信息與NIST 17標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)，匹配指數(shù)大于80%作為物質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)；通過(guò) C7-C40 正構(gòu)烷烴混標(biāo)物的保留時(shí)間，計(jì)算未知化合物的保留指數(shù)(retention index,RI)，結(jié)合文獻(xiàn)以及數(shù)據(jù)庫(kù)中的RI對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，RI按公式(1)計(jì)算:

RI=100n+100×[(RTx-RTn)/(RTn+1-RTn)]

(1)

式中：RTx,待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間;RTn,n個(gè)碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間;RTn+1,n+1個(gè)碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間[11]。

定量方法[12]：通過(guò)計(jì)算待測(cè)揮發(fā)物與癸酸乙酯的峰面積之比求得其含量(假定各揮發(fā)物的絕對(duì)校正因子為1.0)，按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中:比值,峰面積比值;m,茶樣質(zhì)量,1 g。

每個(gè)樣品獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.3 OAV計(jì)算

在各種揮發(fā)性成分定量的基礎(chǔ)上，根據(jù)參考文獻(xiàn)中各揮發(fā)性物質(zhì)在水中的風(fēng)味閾值，按公式(3)計(jì)算各成分的OAV[13]：

(3)

式中：ωi,茶葉組分i的含量,ng/g；OTi,組分i在水中的香氣閾值,μg/kg。OAV≥1的化合物被確定為茶葉中的活性香氣化合物。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Agilent MassHunter 7.0 進(jìn)行定量分析，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SIMCA-P進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)、聚類分析(hierarchical cluster analysis, HCA)以及正交偏最小二乘判別分析法(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)分析，R軟件對(duì)差異揮發(fā)性成分進(jìn)行熱圖(Heatmap)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型發(fā)花磚茶特征香氣感官品質(zhì)分析

感官審評(píng)表明(表1)，不同原料加工而成的發(fā)花磚茶在外形、色澤和金花形態(tài)上差異不明顯，但香氣感官品質(zhì)差異明顯。以黑毛茶為原料加工而成的茯磚茶香氣感官特征呈現(xiàn)菌花香帶木香，并略帶泥土氣；以白茶為原料加工而成的發(fā)花白茶磚香氣感官特征呈現(xiàn)菌花香，且?guī)逑悖灰约t茶為原料加工而成的發(fā)花紅茶磚香氣感官特征呈現(xiàn)菌花香，并帶紅茶獨(dú)特的花香、甜香。新型發(fā)花磚茶均具有典型的“菌花香”，但也具有各自獨(dú)特的香氣特征。

表1 發(fā)花磚茶樣品信息及感官審評(píng)結(jié)果Table 1 The sample information and sensory evaluation results of fungal fermentation brick teas

2.2 不同類型發(fā)花磚茶揮發(fā)性成分分析

不同類型發(fā)花磚茶共鑒定出75種揮發(fā)性成分(表2)，包括醛類16種、醇類12種、酮類20種、酯類7種、內(nèi)酯類3種、碳?xì)漕惢衔?2種、雜氧類化合物4種以及酚類化合物1種。其中，醛類、醇類和酮類化合物是3種發(fā)花磚茶的主要揮發(fā)性成分，且含量均為茯磚茶>發(fā)花紅茶磚>發(fā)花白茶磚，同樣，雜氧類化合物在茯磚茶中的含量也顯著高于其他兩類發(fā)花磚茶，而酯類、碳?xì)漕惡头宇惢衔镌诎l(fā)花紅茶磚中的相對(duì)含量高于茯磚茶和發(fā)花白茶磚。

茯磚茶中含量高的揮發(fā)性成分主要有(E,E)-2,4-庚二烯醛(2 587.88±207.56) ng/g、氧化芳樟醇I(1 856.99±143.09) ng/g、2-正戊基呋喃(1 645.81±72.57) ng/g、3,5-辛二烯-2-酮(769.96±68.28) ng/g、β-紫羅蘭酮(553.56±9.06) ng/g、E-2-辛烯醛(426.15±23.10) ng/g、己醛(407.09±21.279) ng/g、甲基庚烯酮(335.83±18.74) ng/g和壬醛(326.46±25.52) ng/g。發(fā)花白茶磚中含量較高的揮發(fā)性成分主要有苯甲醛(306.00±7.361) ng/g、苯乙醇(249.99±11.20) ng/g、氧化芳樟醇II(212.88±14.36) ng/g、芳樟醇(205.64±15.42) ng/g和水楊酸甲酯(361.58±29.10) ng/g。發(fā)花紅茶磚中含量較高的揮發(fā)性成分主要有水楊酸甲酯(916.53±45.86) ng/g、(E,E)-2,4-庚二烯醛(702.35±50.27) ng/g、氧化芳樟醇I(522.24±22.58) ng/g、β-紫羅蘭酮(350.55±28.14) ng/g、芳樟醇(319.18±14.69) ng/g和氧化芳樟醇II(306.20±24.72) ng/g。

續(xù)表2

2.3 不同類型發(fā)花磚茶香氣成分分析

香氣化合物單體在整體香氣中的貢獻(xiàn)主要取決于閾值及其含量，可以通過(guò)計(jì)算OAV進(jìn)行表征。以往研究認(rèn)為OAV>1的揮發(fā)性成分對(duì)樣品香氣形成有貢獻(xiàn)，OAV>10的揮發(fā)性成分被認(rèn)為是重要的香氣成分[14-15]，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的揮發(fā)性成分的閾值和屬性描述，計(jì)算各個(gè)揮發(fā)性成分的OAV。結(jié)果表明(表3)，共有37種揮發(fā)性成分可計(jì)算OAV。

表3 揮發(fā)性成分OAV值和香氣描述Table 3 OAV value and aroma description of volatile compounds

茯磚茶中呈香物質(zhì)有25種(OAV>1)，其中，OAV>10的重要香氣成分有14種，包括青氣屬性的己醛、庚醛、壬醛、(E,E)-2,4-庚烯醛、(E,E)-2,4-壬烯醛、3,5-辛二烯-2-酮和2-正戊基呋喃；蘑菇香、泥土氣屬性的1-辛烯-3-醇；果香屬性的β-環(huán)檸檬醛和檸檬醛；花香屬性的芳樟醇和α-紫羅酮;甜木香屬性的雪松醇和木香屬性的β-紫羅蘭酮。其中青氣屬性的3,5-辛二烯-2-酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛、2-正戊基呋喃的OAV最高，分別達(dá)到(1 539.93±136.57)、(1 151.30±92.58)和(342.87±15.11)。

發(fā)花白茶磚中呈香物質(zhì)有22種(OAV>1)，其中，OAV>10的重要香氣成分有10種，包括青氣屬性的己醛、3,5-辛二烯-2-酮、(E,E)-2,4-壬烯醛和2-正戊基呋喃；果香屬性的β-環(huán)檸檬醛；蘑菇香、泥土氣屬性的1-辛烯-3-醇；花香屬性的芳樟醇和α-紫羅酮;甜木香屬性的雪松醇和木香屬性的β-紫羅蘭酮。其中青氣屬性的3,5-辛二烯-2-酮和(E,E)-2,4-壬二烯醛的OAV最高，分別達(dá)到(231.49±17.18)和(145.28±16.07)。

發(fā)花紅茶磚中呈香物質(zhì)有27種(OAV>1)，其中，OAV>10的重要香氣成分有12種，包括青氣屬性的己醛、(E,E)-2,4-庚烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、(E,E)-2,4-壬烯醛和2-正戊基呋喃；果香屬性的β-環(huán)檸檬醛；蘑菇香、泥土氣屬性的1-辛烯-3-醇；花香屬性的芳樟醇、α-紫羅酮和水楊酸甲酯;甜木香屬性的雪松醇和木香屬性的β-紫羅蘭酮。其中青氣屬性的3,5-辛二烯-2-酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛和甜木香屬性的雪松醇的OAV最高，分別達(dá)到(457.38±24.01)、(343.54±8.00)和(292.01±23.44)。

2.4 不同類型發(fā)花磚茶特征香氣成分分析

采用PCA、HCA、OPLS-DA結(jié)合OAV，研究茯磚茶、發(fā)花白茶磚和發(fā)花紅茶磚中特征香氣成分。PCA和HCA(擬合參數(shù)為R2X=0.955，Q2=0.915)分析表明(圖1)，茯磚茶、發(fā)花白茶磚和發(fā)花紅茶磚可明顯分為3組，表明茯磚茶、發(fā)花白茶磚和發(fā)花紅茶磚揮發(fā)性成分組成存在顯著差異。

a-PCA得分圖;b-HCA圖圖1 不同類型發(fā)花磚茶揮發(fā)性成分比較分析Fig.1 Comparative analysis of volatile components of different types of fungal fermentation brick tea

基于PCA和HCA結(jié)果，構(gòu)建了3個(gè)OPLS-DA模型(茯磚茶 VS 發(fā)花白茶磚；茯磚茶 VS 發(fā)花紅茶磚；發(fā)花白茶磚 VS 發(fā)花紅茶磚)，置換檢驗(yàn)(permutation test)R2=0.842、Q2=-0.207,R2=0.614、Q2=-0.722和R2=0.389、Q2=-0.771，判別模型有較好的解釋能力，且不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。共篩選出24種差異揮發(fā)性成分(VIP>1)如表4所示。

結(jié)合OAV值(OAV>1)，共篩選出15種特征香氣成分，包括(E,E)-2,4-庚二烯醛、己醛、壬醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、苯乙醛、氧化芳樟醇I、芳樟醇、雪松醇、1-辛烯-3-醇、樟醇、3,5-辛二烯-2-酮、β-紫羅蘭酮、甲基庚烯酮、水楊酸甲酯和2-正戊基呋喃。

如圖2所示，茯磚茶中具有青氣屬性的(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、己醛、壬醛、3,5-辛二烯-2-酮、2-正戊基呋喃和甲基庚烯酮以及木香屬性的氧化芳樟醇I和β-紫羅蘭酮的含量顯著高于其在發(fā)花白茶磚和發(fā)花紅茶磚中的含量，為茯磚茶的特征香氣成分。

表4 基于OPLS-DA篩選不同類型發(fā)花磚茶差異揮發(fā)性成分Table 4 Screening of different volatile components of different types of Fungal fermentation brick tea based on OPLS-DA

M1-己醛;M2-壬醛;M3-苯乙醛;M4-(E，E)-2,4-庚二烯醛;M5-(E，E)-2,4-壬二烯醛;M6-氧化芳樟醇I;M7-芳樟醇;M8-雪松醇;M9-1-辛烯-3-醇;M10-樟醇;M11-3,5-辛二烯-2-酮;M12-甲基庚烯酮;M13-β-紫羅蘭酮， M14-水楊酸甲酯;M15-2-正戊基呋喃圖2 不同類型發(fā)花磚茶關(guān)鍵特征香氣成分Heatmap分析Fig.2 Heatmap analysis of differential volatility components of different types of fungal fermentation brick tea

發(fā)花白茶磚中具有清香屬性的苯乙醛的含量顯著高于其在茯磚茶和發(fā)花紅茶磚中的含量，為發(fā)花白茶磚的特征香氣成分。發(fā)花紅茶磚中具有蘑菇香、泥土氣屬性的1-辛烯-3-醇、具有花香屬性的芳樟醇、樟醇和水楊酸甲酯以及具有甜木香屬性的雪松醇的含量顯著高于其在茯磚茶和發(fā)花白茶磚中的含量，為發(fā)花紅茶磚的特征香氣成分。

3 討論與結(jié)論

揮發(fā)性成分的組成與含量形成了茶葉的香氣特征，并受茶樹(shù)品種、原料及加工工藝的影響[18]。本研究以不同茶類原料經(jīng)“發(fā)花”工藝制成的發(fā)花磚茶為研究對(duì)象，對(duì)其香氣感官屬性、揮發(fā)性成分和香氣成分組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明3種發(fā)花磚茶在特征香氣成分的種類及含量上具有顯著差異。

基于OAV分析法，鑒定了27種呈香揮發(fā)性成分，主要以青氣屬性、花香屬性和木香屬性物質(zhì)為主。其中，青氣屬性的物質(zhì)在3種發(fā)花磚茶中均占主導(dǎo)地位，特別是3,5-辛二烯-2-酮和(E,E)-2,4-壬二烯醛，在3種發(fā)花磚茶中OAV均達(dá)最高，這可能導(dǎo)致3種發(fā)花磚茶均具有典型的“菌花香”，表明這2種香氣成分在發(fā)花磚茶共有的典型“菌花香”形成中起重要作用。

采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法篩選出3種發(fā)花磚茶中15種特征香氣成分。其中茯磚茶中的(E,E)-2,4-庚二烯醛、己醛、壬醛、3,5-辛二烯-2-酮、甲基庚烯酮、2-正戊基呋喃、氧化芳樟醇I和β-紫羅蘭酮含量顯著高于發(fā)花白茶磚、發(fā)花紅茶磚，貢獻(xiàn)了茯磚茶的特有“木香”和“泥土氣味”，與先前研究[19-20]茯磚茶香氣成分結(jié)果一致，且均是茯磚茶中主要揮發(fā)性成分[21-22]，其中，氧化芳樟醇I的形成與茯磚茶、普洱茶發(fā)酵過(guò)程中真菌生長(zhǎng)密切相關(guān)[23-24]。發(fā)花白茶磚具有“菌花香帶清香”的香氣感官品質(zhì)，其中具有清香屬性的苯乙醛含量顯著高于茯磚茶、發(fā)花紅茶磚。苯乙醛是由苯丙氨酸經(jīng)脫羧后形成的相應(yīng)醛類物質(zhì)，使茶葉呈現(xiàn)淡淡的花香，稀釋后具有清香[25],有研究認(rèn)為苯乙醛是白茶香氣的主要組成成分[26-27]，主要貢獻(xiàn)發(fā)花白茶磚中的清香[24-25]，劉菲等[28]的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。發(fā)花紅茶磚中1-辛烯-3-醇、雪松醇、芳樟醇、樟醇和水楊酸甲酯的含量顯著高于茯磚茶、發(fā)花白茶磚，其香氣描述為蘑菇香、甜木香和花香。這些香氣屬性描述詞均可用以描述“菌花香”感官屬性[29]，也是紅茶香氣中最主要的物質(zhì)[30-31]。

同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)茯磚茶和發(fā)花紅茶磚在香氣成分組成上更為接近，蔡正安等[32]采用冠突散囊菌接種不同茶類的原料進(jìn)行“發(fā)花”處理。結(jié)果表明，相比于接種在未發(fā)酵原料茶(白茶、綠茶)上的生長(zhǎng)情況，冠突散囊菌在發(fā)酵茶(紅茶、黑茶、青茶)中生長(zhǎng)情況更好，推測(cè)可能與茯磚茶和發(fā)花紅茶磚原料均經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理有關(guān)，而發(fā)花白茶磚揮發(fā)性成分含量整體偏低可能與白茶原料未經(jīng)發(fā)酵有很大關(guān)系[32]。

此外，已鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)中有部分化合物由于閾值缺乏，無(wú)法利用OAV法衡量其對(duì)不同類型發(fā)花磚茶特征香氣的貢獻(xiàn)，而且OAV方法對(duì)樣品中的特征風(fēng)味化合物的分析也存在一定局限性，后續(xù)還將采用不同方法對(duì)發(fā)花磚茶的特征香氣成分開(kāi)展進(jìn)一步驗(yàn)證研究。