類黃酮基因工程與化學合成及其結構修飾研究進展

田杰，張傳博，孫云子

(貴州師范大學 生命科學學院，貴州 貴陽，550025)

黃酮類化合物是一類重要的天然產物，種類眾多，廣泛存在于蕨類和高等植物中,具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、抗自由基等生物活性。此外，對人體還有降血壓血脂、抗衰老、提高機體免疫力等活性[1]。黃酮類化合物在新藥研制、食品貯藏、化妝品工業等領域均有重要應用，但其在植物中含量低且不易提取，基于此，對黃酮類化合物人工合成和加工修飾顯得極為重要。

近年，隨著對黃酮類化合物植物合成相關酶及其基因的研究不斷開展，微生物基因工程合成黃酮類化合物也取得了較大進展。同時，微生物修飾黃酮類化合物也有不少報道，自2000年以來，已發現多種可轉化黃酮類化合物的微生物，部分微生物還可通過自身代謝直接合成黃酮類化合物[2-3]。另外，化學方法合成黃酮類化合物及結構修飾也有很多報道[4-7]。不論是微生物合成及轉化，還是化學方法的合成和結構修飾，近年均無全面闡述，筆者綜述近年國內外黃酮類化合物合成及結構修飾相關研究，旨在為黃酮類化合物的開發利用提供參考。

1 黃酮類化合物分類及生物合成途徑

1.1 黃酮類化合物分類

黃酮類化合物基本骨架為C6-C3-C6結構，中間C3結構可以是開鏈，或者與苯環一起聚合成氧雜環， C3鏈是否成環及其氧化程度可作為黃酮類化合物的分類依據之一。此外，根據B環與C環的鏈接位置不同，C環是否含酮基，以及主體結構上取代基的位置和數目不同等特征，黃酮類化合物可分為不同的種類。目前發現并鑒定的黃酮類化合物已超過一萬種[8]，主要有黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、黃烷酮類、查爾酮類和花色素等。其存在形式有結合態和游離苷元兩種，大多與葡萄糖、棉子糖、半乳糖、鼠李糖等以氧糖苷成結合態，其中以葡萄糖最為普遍。其分類及物質舉例如表1所示。

1.2 黃酮類化合物生物合成途徑

在植物次生代謝中，黃酮類化合物的代謝研究最為深入和清晰，其合成酶涉及苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、酪氨酸解氨酶(tyrosineammonialyase， TAL)、肉桂酸4-羥化酶 (cinnamic acid-4-hydroxylase, C4H)、香豆酰-CoA連接酶(4-coumaryl-CoA ligase, 4CL)、查爾酮合酶(chalcone synthase, CHS)、查爾酮異構酶(chalcone isomerase, CHI)、黃酮合酶(flavonol synthase, FNS)、異黃酮合酶(isoflavone synthase,IFS)、類黃酮3′羥化酶(flavonoid 3′-hydroxylase, F3′H)等。

黃酮類化合物生物合成途徑涉及醋酸鹽途徑(A環合成)和莽草酸鹽途徑(B環和中間C3合成)，A環由葡萄糖轉化生成的3個丙二酰-CoA分子合成，B環由苯丙氨酸生成的4-香豆酰-CoA通過莽草酸途徑合成[9]。A環和B環在CHS催化下縮合成查耳酮，查耳酮再經CHI催化生成二氫黃酮。二氫黃酮是大部分黃酮類化合物的共同前體，可通過FNS、IFS、F3′H等酶的催化，生成其他黃酮類化合物，如圖1所示。

表1 黃酮類化合物分類Table 1 Classification of flavonoids

圖1 黃酮類化合物生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway pf flavonoids

2 黃酮類化合物微生物基因工程合成與化學合成

2.1 黃酮類化合物微生物基因工程合成

目前，黃酮類化合物基因工程生產菌株有釀酒酵母、大腸桿菌和委內瑞拉鏈霉菌等[10-11]。微生物基因工程生產黃酮類化合物有生產周期短、環境污染小、可大規模生產等諸多優勢。當前，很多黃酮類化合物已經在微生物中成功生產，但很多黃酮類化合物的生產都面臨生產效率較低的難題。

為解決這些問題，可通過模塊化共培養、調節碳源流向及基因的表達等提高黃酮類化合物產量。近年來，對黃酮類化合物模塊化共培養的研究較多，最近，WANG等[12]采用模塊化共培養的方法，將櫻花素的合成途徑分成2個模塊并分別在大腸桿菌中構建相關基因，以葡萄糖為底物在間歇式反應器中擴大培養，櫻花素產量達79.0 mg/L，這是目前在大腸桿菌中從頭合成櫻花素的最高濃度。RODRIGUEZ等[13]通過基因篩選、消除苯乙醇生物合成分支、優化核心類黃酮合成途徑、補充前體2-(phosphonooxy)prop-2-en-1-olate(PEP)和 (S)-2-hydroxy-4-oxobutyl dihydrogen phosphite(E4P)、類黃酮3'羥化酶(F3H)和黃酮醇合酶(FLS)等策略在釀酒酵母中獲得了86 mg/L的山奈酚，是當前在釀酒酵母中生產山奈酚的最高濃度。表2列出近年利用微生物生產黃酮類化合物相關研究。

表2 近年黃酮類化合物微生物基因工程合成及產量Table 2 Genetic engineering synthesis and yield of flavonoids from microorganisms

此外，部分植物內生菌可通過自身代謝合成黃酮類化合物。當前，研究者已成功分離了多種有產黃酮能力的植物內生菌，該類植物內生菌多分布于鐮胞霉屬、曲霉屬、青霉屬、交鏈孢屬、痕格孢屬等。表3列出近年分離的產黃酮類化合物內生菌及其宿主植物。

表3 近年篩選產黃酮類化合物植物內生菌Table 3 Screening of endophytic bacteria producing flavonoids in recent years

2.2 黃酮類化合物化學合成

黃酮類化合物的化學合成受到廣泛關注，主要方法有β-丙二酮酸化關環(Baker-Venkataraman,BK-VK)法、Fries重排、Auwers法和查爾酮氧化關環 (AFO)法、光催化合成等。

BK-VK法是傳統的合成方法，該法利用堿催化芳甲酰鹵與2-羥基苯乙酮生成酯，然后在堿處理下生成β-丙二酮，β-丙二酮再經酸催化生成黃酮類化合物。BK-VK法在實際運用中遇到過很多問題，如產物回收率低且難純化等。為克服這些問題，在BK-VK法基礎上出現了很多改良的方法，大大擴大了BK-VK的應用[37-38]。圖2所示BK-VK過程。

圖2 β-丙二酮酸化關環法Fig.2 Baker-Venkataraman,BK-VK

Fries重排是指酚脂在Lewis酸的催化下，?；l生重排的過程。Fries重排常用的催化劑有三氯化鋁、氯化鋅、三氟化硼、氯化鐵、四氯化錫、四氯化鈦等，其產物有鄰位和對位兩種。不同催化劑，不同反應條件都會影響其產物類型，例如，四氯化鈦作催化劑主要產物為鄰位產物，低溫更容易形成對位產物等。

黃酮類化合物合成中常用芳基丙炔酸和苯酚為底物生成酯,在吡啶溶液中滴加N,N′-二環已基碳二亞胺(DDC),所得酯再經Fries重排生成鄰羥基苯乙酮, 然后經環合得到黃酮類化合物，過程如圖3所示。

圖3 Fries重排合成黃酮類化合物Fig.3 Fries rearrangement for the synthesis of flavonoids

Auwers法和查爾酮氧化關環法(AFO)是比較傳統的合成黃酮醇類化合物的方法。Auwers法用苯甲醛和苯并呋喃縮合再經溴化生成2溴-2-(α-溴芐基)苯并呋喃酮, 2溴-2-(α-溴芐基)苯并呋喃酮通過醇堿處理生成黃酮醇。由于Auwers法反應煩瑣，產率低等原因，其實際應用較少，過程如圖4所示。

圖4 Auwers法合成黃酮類化合物Fig.4 Flavonoids were synthesized by Auwers

AFO法基本原理是2’-羥基查爾酮與H2O在堿性溶液中發生氧化環合，生成黃酮醇。其原料2’-羥基查爾酮常由苯甲醛衍生物與苯乙酮縮合生成。AFO法是經典的黃酮醇合成方法，應用較為廣泛。

近年，有很多利用光輔助合成有機化合物的報道。有學者用可見光誘導叔烷基酰胺和NH4SCN發生硫氰化生成了硫代氰胺[39]。2020年，MKRTCHYAN等[40]將NH4SCN替換為BF4N2Ar和TfOIAr2，分別通過藍光和綠光照射合成了黃酮類化合物。具體過程如圖5所示。光輔助合成有綠色環保，合成效率高等優點，對光輔助合成黃酮類化合物的研究是黃酮類化合物開發利用的重要方法和手段。

圖5 光輔助合成黃酮類化合物Fig.5 Photoassisted synthesis of flavonoids

3 黃酮類化合物結構修飾

目前對黃酮類化合物結構修飾的主要方法有生物法和化學法。生物法主要是利用微生物分泌的酶進行修飾，化學修飾則是通過特定化學反應進行。修飾位點主要集中在C環2、3位，A環5、6、7、8位和B環2′、3′、4′ 位，主要有糖基化、去糖基化、?；?、羥基化、甲基化及金屬離子等。

3.1 微生物修飾

目前，已發現了許多對黃酮類化合物有修飾功能的微生物，其中羥基化、去羥基化、甲基化大多發生在B環的C3和C4位點，糖基化和去糖基化多發生在C環。表4為相關微生物對黃酮類化合物的修飾作用。

表4 黃酮類化合物微生物修飾Table 4 Microbial modification of flavonoids

3.2 化學修飾

黃酮類化合物化學修飾的主要方法有金屬離子螯合、鹵族元素和活性基團的引入等。通過化學結構的修飾，可直接影響黃酮類化合物的理化性質和生物活性。

黃酮類化合物對金屬離子有較強的螯合作用，其配合物的配體可與金屬離子產生協同作用，增加其生物活性。很多黃酮類化合物如蘆丁、大黃素、槲皮素、黃芩苷等均有金屬離子螯和及其生物活性研究的報道，其中銅、鋅以及稀土金屬元素與黃酮類化合物的螯和報道較多。圖6所示部分常見黃酮類化合物金屬離子螯和位點。

a-槲皮素；b-香葉木素；c-黃芩苷圖6 常見黃酮類化合物金屬螯和位點Fig.6 Metal chelates sites of common flavonoid compounds

鹵族元素引入黃酮分子可提高黃酮類化合物生物活性，引入元素主要是氟、氯、溴三種。其引入后物質的活性大小通常是氟>氯>溴[51]。

活性基團的引入主要是甲基、?；土u基等。在黃酮分子中引入不同活性基團，可改變黃酮分子構象，增強其生物活性，甚至產生新的生理功能。COPMANS等[52]研究了 naringenin、山奈酚及其3種甲基化衍生物對斑馬魚癲癇發作(ptz誘導)的作用，結果表明，甲基化黃烷酮NRG-dm對斑馬魚幼體ptz誘導的癲癇發作效果非常好。羥基的引入可增大黃酮類化合物水溶性和抗氧化活性，其引入位點不同，對黃酮類化合物活性的影響也不同，其相對活性大小和引入位點的關系為:7>4′≈3>3′>> 5[53]

4 展望

黃酮類化合物在植物中含量低，不易獲得。對生物和化學方法合成黃酮類化合物理論和技術的拓展，可望成為解決這一問題的有效途徑。基因工程及化學方法合成黃酮類化合物可為黃酮類化合物更廣泛和深入的應用提供可能，發掘和完善黃酮類化合物合成及修飾方法，有望彌補植物中黃酮類化合物含量低，生物利用度低等問題。此外，黃酮類化合物對醫藥和食品等領域的意義重大，將基因工程和化學方法廣泛用于新型黃酮類化合物的開發利用，其意義不可估量。