榆梔止血顆粒含藥血清對異位子宮內膜間質細胞PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響

劉艷杰, 楊 陽

(1.鄭州大學第一附屬醫院婦科, 河南 鄭州 450000 2.南京醫科大學附屬南京醫院婦科, 江蘇 南京 210006)

子宮內膜異位癥是多發于育齡婦女的婦科疾病，特征為子宮內膜組織(包括腺體、間質)異位種植到子宮腔被覆黏膜及子宮以外的部位，可引發疼痛、月經失調、盆腔包塊，甚至不孕等癥狀或體征[1]。雖然子宮內膜異位癥屬于良性疾病，但由于其具有種植廣泛、侵襲性強、易復發等腫瘤類似生物學行為的特點，嚴重影響患者的身心健康和生活質量。目前，關于子宮內膜異位癥發生的學說研究較多，但其分子病理機制尚不完全明確，目前多認為子宮內膜增殖、遷移、黏附、侵襲是子宮內膜異位癥發病過程的關鍵步驟[2]。第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是具有蛋白與脂質磷酸酯酶活性的抑癌基因，與多種腫瘤的發生發展密切相關，可通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號轉導途徑，調控細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等過程[3]。研究表明，子宮內膜異位癥發生與PTEN/PI3K/AKT信號通路有關[4]。榆梔止血顆粒是一種固經止血、滋陰清熱的中成藥，成份復雜，常用來治療月經過多、經期延長。子宮內膜間質細胞(endometrial stromal cells，ESCs)是子宮內膜的主要組成部分，本研究將通過研究榆梔止血顆粒含藥血清對異位ESCs細胞增殖、侵襲及PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響，以期為榆梔止血顆粒用于治療子宮內膜異位癥提供一定參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物:8周齡SPF級雄性SD大鼠，體質量250g左右，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司生產許可證號：SCXK(滬)2017-0012。

1.2試劑與儀器:胎牛血清(貨號：FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司；榆梔止血顆粒(國藥準字：Z20130019)購自山東新時代藥業有限公司；CCK-8試劑(貨號：CK-04)購自日本同仁化學研究所；Matrigel基質膠(貨號：356234)購自美國BD公司；結晶紫(貨號：0528-100G)購自美國Amresco公司；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號：K1002S)購自美國Promega公司；PTEN、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PTEN抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、GAPDH抗體(貨號：ab267787、ab8933、ab64148、ab181602)購自abcam公司；PI3K抗體、p-PI3K抗體(貨號：bs-0128R-2、bs-5538R-2)購自上海恒斐生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號：0295G-HRP)購自美國santa公司；恒溫培養箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；酶標儀、化學發光成像系統(型號：MODEL550、ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司；顯微鏡(型號：CX31)購自日本Olympus公司；熒光定量PCR儀(ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司。

1.3實驗方法

1.3.1榆梔止血顆粒含藥血清的制備:24只SD大鼠隨機分為榆梔止血顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和空白對照組，每組6只，分別給予各組大鼠榆梔止血顆粒藥液(1g/mL、3g/mL、5g/mL)2.5mL及生理鹽水2.5mL灌胃，連續7d，末次給藥2h后，麻醉大鼠并通過腹主動脈采血，37℃放置3h后，4℃靜置過夜，3000r/min離心15min，取上清液，0.22μm微孔濾膜除菌，將每組大鼠的血清混合，分為榆梔止血顆粒低、中、高劑量血清和空白血清。-20℃保存備用。

1.3.2異位ESCs細胞的分離、培養及分組:取異位子宮內膜新鮮組織，無菌生理鹽水清洗，將組織剪成0.1～1mm3碎塊，加入含1%膠原酶和100μg/mL DNA酶的培養液，置于37℃、5% CO2培養箱中消化1～1.5h，用100目不銹鋼篩網過濾未消化組織，800r/min離心去上清，加入完全培養液將沉淀重懸為5×105個/mL的細胞懸液，接種在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞融合率達到80%左右時，用胰蛋白酶消化、傳代培養。取對數期異位ESCs細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔培養板，每孔100μL，分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，分別加空白血清、榆梔止血顆粒低劑量血清、榆梔止血顆粒中劑量血清和榆梔止血顆粒高劑量血清。

1.3.3CCK-8法檢測各組異位ESCs細胞增殖情況:將1.3.2中各組異位ESCs細胞培養48h，加入CCK-8試劑后繼續培養2h，使用全自動酶標儀于波長450nm處檢測各孔吸光度(optical density，OD)值。

1.3.4Transwell法檢測各組異位ESCs細胞侵襲情況:用無血清培養基稀釋Matrigel基質膠(1：8)，向每個Transwell小室中加50μL，37℃ 1h凝固。用無血清培養液將1.3.2中各組異位ESCs細胞稀釋為2.5×105個/mL的細胞懸液，以200μL接種于Transwell小室上層，下室中加入500μL 10%胎牛血清的培養液，37℃、5% CO2培養箱中孵育24h，擦去未侵襲細胞，用4%多聚甲醛固定10min穿膜細胞，PBS洗滌，0.5%結晶紫染液染色20min。在顯微鏡下隨機選取6個視野，統計200倍鏡下的穿膜細胞數目，計算平均值。

1.3.5qRT-PCR法檢測各組異位ESCs細胞中PTEN mRNA表達情況:將1.3.2中各組異位ESCs細胞培養48h，收集細胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用qRT-PCR法檢測PTEN mRNA表達水平，內參基因為GAPDH。反應程序：95℃預變性10min；95℃變性10s，55℃退火35s，72℃延伸1min，循環40次。PTEN上游引物：5'-ACCAGAGA CAAAAAGGGAGTA-3'，下游引物：5'-ACCACAAACTGAGG ATTGCA-3'；GAPDH上游引物：5'-GAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物：5'-GCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。Ct值為擴增產物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環數，相對表達量以2-ΔΔCt法表示。

1.3.6蛋白印跡(western blot，WB)法檢測各組異位ESCs細胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達情況:將1.3.2中各組異位ESCs細胞培養48h，收集細胞，提取各組細胞總蛋白并定量。電泳分離等量蛋白質并轉至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，分別加入PTEN抗體、p-PI3K抗體、PI3K抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、GAPDH抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育1h，免疫反應化學發光法顯色，Tanon 600圖像分析系統拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

2 結 果

2.1各組異位ESCs細胞增殖情況:與對照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細胞OD值顯著降低(P<0.05)；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細胞OD值逐步遞減(P<0.05)，見表1。

表1 各組異位ESCs細胞OD值比較

2.2各組異位ESCs細胞侵襲情況:與對照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細胞侵襲細胞數顯著降低(P<0.05)；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細胞侵襲細胞數逐步遞減(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 各組異位ESCs細胞侵襲情況(×200)

表2 各組異位ESCs細胞侵襲細胞數比較

2.3各組異位ESCs細胞中PTEN mRNA表達情況:與對照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細胞中PTEN mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細胞中PTEN mRNA表達水平逐步遞增(P<0.05)，見表3。

表3 各組異位ESCs細胞中PTEN mRNA表達水平比較

2.4各組異位ESCs細胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達情況:與對照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細胞中PTEN蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細胞中PTEN蛋白表達水平逐步遞增(P<0.05)，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達水平逐步遞減(P<0.05)，見圖2、表4。

圖2 各組異位ESCs細胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達情況

表4 各組異位ESCs細胞中PTEN p-PI3K PI3K p-AKT AKT蛋白表達水平比較

3 討 論

子宮內膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，是造成婦女盆腔痛、生育力低下、具有惡性腫瘤高發風險的重要原因，嚴重威脅育齡期婦女的健康[5]。近年來，子宮內膜異位癥發病有上升趨勢，發病率高達15%，進行婦科手術的患者中被發現同時合并子宮內膜異位癥的患者占5%～15%。現階段，臨床上通常將手術療法與藥物療法聯合用于子宮內膜異位癥治療，以多種藥用植物為主的中藥療法或植物提取物在子宮內膜異位癥中的治療應用中受到廣泛關注[6]。

榆梔止血顆粒主要由地榆炭、墨旱蓮、炒梔子組成，具有清熱、涼血、調經止痛的功效，常用于治療血熱證所致月經過多、經期延長等癥，可伴見口干心煩、尿赤便結、舌紅、苔黃、脈滑數等。本研究結果顯示，與對照組相比，低、中、高劑量組異位ESCs細胞OD值、侵襲細胞數顯著降低；隨著榆梔止血顆粒含藥血清劑量升高，異位ESCs細胞OD值、侵襲細胞數逐步遞減，提示榆梔止血顆粒含藥血清可呈劑量依賴性抑制異位ESCs細胞的增殖與侵襲，可能在治療子宮內膜異位癥中具有一定作用，但具體機制尚不清楚。

子宮內膜異位癥發生與異位ESCs細胞的增殖、侵襲等密切相關，如何有效積極防治異位ESCs細胞的增殖、侵襲已成為預防子宮內膜異位癥關鍵所在[7,8]。PTEN是一個抑癌基因，不僅參與腫瘤發生發展，對子宮內膜異位癥的發生發展也有一定抑制作用。葉妮等[9]研究表明，PTEN的降低是EMs的發病機制之一，通過上調PTEN mRNA及蛋白表達可使異位內膜出現凋亡性病理改變，而不影響在位內膜的病理結構。PI3K/AKT信號通路與細胞內信號轉導有關，是人體內基礎信號通路之一，參與細胞發育、增殖、凋亡與侵襲等過程[10]。王靜等[11]研究發現，蘿卜硫素可通過PI3K/Akt信號通路降低腹腔子宮內膜異位癥大鼠病灶體積。張亞萍等[12]研究亦發現，蠲痛飲治療子宮內膜異位癥，抑制上皮間質細胞活性，促進細胞凋亡，可能是通過下調PI3K/Akt /mTOR通路蛋白的表達發揮作用的。Zhang等[4]研究表明，miR-26a通過PTEN/PI3K/AKT途徑促進奶牛子宮內膜上皮細胞增殖并誘導基質細胞凋亡。本研究結果顯示，隨著榆梔止血顆粒含藥血清的使用及劑量升高，異位ESCs細胞中PTEN mRNA及蛋白表達水平顯著升高，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達水平顯著降低，提示榆梔止血顆粒可影響PTEN/PI3K/AKT通路，可能通過促進PTEN轉錄翻譯，抑制PI3K、AKT磷酸化蛋白表達，進而抑制異位ESCs細胞的增殖與侵襲。

綜上所述，榆梔止血顆粒含藥血清可抑制異位ESCs細胞的增殖與侵襲，并影響PTEN/PI3K/AKT信號通路的激活，可能對治療子宮內膜異位癥有一定幫助，但還需要進一步深入研究。