22C3位點PD-L1與ki67 EGFR和血液指標相關性研究

冒學蓮， 王承霞， 陳 艷， 賈張軍， 竺明晨

(南京醫科大學附屬腫瘤醫院/江蘇省腫瘤醫院/江蘇省腫瘤防治研究所， 江蘇 南京 210009)

近年來，肺癌發病率及致死率逐年上升，躍居首位，成為腫瘤患者的“第一殺手”，非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占原發性肺癌的80%。為了延長患者生命，提高生存率以及改善預后，NSCLC非手術性治療，漸漸從靶向在向免疫治療方向發展，由NSCLC晚期的標準二線治療，轉變為無驅動基因改變，PD-L1高表達的一線治療，改變的治療策略，開啟了肺癌新時代的精彩篇章。PD-L1通過誘導T細胞凋亡，抑制細胞因子表達，傳遞共刺激信號通路，減少細胞免疫應答，降低機體對腫瘤細胞的監視和清除，腫瘤由此發生、發展。多篇文獻指出PD-L1的過表達與較差的臨床指標相關[1]。PD-L1高表達可能成為預測肺癌患者預后的潛在標志物[2]，研究NSCLC患者PD-L1的表達情況與患者的臨床病理特征、ki67、EGFR預后有關因素之間的相關性，對NSCLC患者的治療與預后將產生重要的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料:收集江蘇省腫瘤醫院2018年11月至2019年7月的臨床病理資料完整的，且經病理學確診為NSCLC組織標本121例。男性91例，女性30例。年齡37～90歲，中位年齡63歲。60歲以下的占33.1%。73.6%(89/121)的患者有淋巴結轉移。14.9%(18/121)的患者有時吸煙，85.1%的患者從不吸煙。根據2016年國際抗癌聯盟(UICC)新的修訂標準，進行NSCLC的TNM分期[12]，其中Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期103例。腺癌76例，其他45例為鱗癌、腺鱗癌，神經內分泌癌等。分化程度：高分化11例、中分化34例、低分化76例；病人血液檢驗結果均為入院采血第一次所得。研究獲得本院醫學倫理委員會的批準。

1.2組織標本免疫組化:4μm石蠟切片，二甲苯脫蠟至水、2min高溫高壓抗原修復、3% H2O2進行封閉，按照北京中杉金橋生物技術有限公司公司試劑盒說明書進行分別加入一抗Ki67工作液和單克隆鼠抗人PD-L1(22C3)，封片均設陽性和陰性對照，陰性對照為PBS代替一抗。在對應的DAKO Link 48診斷平臺，PD-L1染色結果判定根據腫瘤細胞(TC)呈現任何強度細胞膜染色(PD-L1)的占比，<1%為陰性；1～49%為低表達；≥50%為高表達。所有切片均由經驗豐富的病理診斷醫生，至少2名進行切片判定。

1.3EGFR基因突變的檢測:采用EGFR基因突變檢測試劑盒(ARMS法)，檢測EGFR基因18、19、20、21外顯子突變，嚴格參照說明書進行操作，檢測結束后分析結果。

1.4血清各項指標檢測:清晨抽取所有受試者，空腹靜脈血5mL于試管中，混勻備用。采用emiBioCytoCounter系列全自動可視化細胞檢測儀檢測CD3+,、CD4+、CD8+T細胞比例。采用羅氏全自動生化分析儀P800和電化學發光免疫分析儀E601及配套試劑分別檢測血清LDH、CEA、CA199、CY211水平。嚴格參照操作流程進行操作。

1.5統計學處理:研究所得數據錄入SPSS20.0進行統計，計數資料用率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，Spearman進行相關性分析。所有統計結果，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PD-L1與各指標陽性表達率:所有患者均行PD-L1檢測。PD-L1陽性表達率分別為61.2%(74/121)，低表達率38.0%(46/121)高表達率23.2%(28/121)。101例患者進行Ki67免疫組化，Ki67高表達占56.4%(57/101)。48例患者進行了EGFR基因檢測，其中陽性突變者占41.7%(20/48)。119例患者行CEA檢測，異常率為64.7%(77/119)。108例患者行CA125檢測，異常率為51.9%(56/108)。119例患者行LDH檢測，異常率為17.6%(21/119)，71例患者行CY211檢測，異常率為64.8%(46/71)。見表1。

表1 肺癌各項指標的異常(高)表達率

2.2PD-L1表達與肺癌的臨床病理特征的關系:Ⅲ+Ⅳ分期和局部有淋巴結轉移的患者PD-L1陽性表達率顯著高于Ⅰ+Ⅱ和無淋巴結轉移的患者，差異具有統計學意義(χ2=6.636、7.726，P<0.05)，不同年齡、性別、病理類型、吸煙情況、分化情況，PD-L1陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 PD-L1表達與肺癌的臨床病理特征的關系n(%)

2.3EGFR、免疫組化與血清各項指標的對PD-L1陽性表達率相關性:PD-L1陽性表達率與EGFR突變型、Ki67高表達、CD8+T細胞數量增高和LDH增高具有顯著相關性。呈正相關(P<0.05)，而與CY211增高、CEA增高和CD4+T細胞數量異常未見明顯相關性(P>0.05)。見表3。

表3 PD-L1表達與肺癌的其他指標的相關性(n)

3 討 論

PD-L1是定位于人染色體9q24，編碼290個氨基酸的穿膜蛋白，表達于大部分腫瘤細胞及免疫細胞表面，巨噬細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞[3]。PD-1/ PD-L1是近年來研究較熱的負性免疫共刺激分子，抑制細胞因子的轉錄和翻譯，抑制了腫瘤特異性CD8+T細胞的免疫活性，誘導T細胞凋亡，從而逃避T細胞的抗腫瘤免疫應答，進而促進腫瘤形成。PD-1與PD-L1在實體惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要的生物學作用[2]。本研究PD-L1陽性表達率為61.2%，略高于Lin[4]等研究，PD-L1在肺癌腫瘤細胞上高表達53.6%，差異可能與研究對象選擇不同有關。

本文研究結果顯示，Ⅲ+Ⅳ分期和局部有淋巴結轉移的患者PD-L1陽性表達率顯著增高。與Koh等報告相吻合[5]，肺腺癌中PD-L1與TNM臨床分期呈正性相關。在NSCLC中，PD-L1與PD-1結合后，調節腫瘤微環境，降低CD8+T細胞的糖酵解，抑制活化增殖，逃避監視和殺傷，導致患者病情進展、淋巴結轉移，分期高，迅速惡化[6]。PD-L1與肺癌病情發展和轉移存在相關性，肺癌分期較高患者中PD-L1表達水平更高，腫瘤細胞高表達PD-L1提示侵襲性高、分期較晚。

本研究中高表達PD-L1與部分免疫組化分子、血液分子物質具有顯著相關性，如LDH、EGFR基因突變、Ki67表達和CD8+T細胞。與諸多研究結果相一致。Tang等[7]發現晚期肺腺癌中PD-L1高表達，EGFR突變型PD-L1高表達率顯著提高71.9%；TKIs治療EGFR突變型高表達PD-L1患者預后更好。Reck[8]and Rittmeyer[9]研究發現EGFR突變患者其免疫治療，療效顯著差于EGFR野生型。EGFR屬于肺癌的驅動基因，原癌基因的激活和抑癌基因的失活，免疫微環境細胞因子誘導，導致細胞的分化、增殖、凋亡發生異常，高增殖率，高異質性的肺癌發生，EGFR調控信號通路，持續激活誘導腫瘤細胞PD-L1非炎癥性機制表達，同時促進PD-L1糖基化水平,而不被降解，起穩定PD-L1分子的作用。TKI在直接抗腫瘤的同時，還可以間接抗腫瘤，通過下調PD-L1表達、增強細胞免疫應答。分析EGFR與PD-L1間的分子聯系，對肺癌免疫治療和靶向治療的規范應用，有很大的導向作用。

Ki-67高表達與PD-L1表達具有明顯相關性，Ki-67是一種與細胞周期相關的蛋白質，被認為是腫瘤細胞增殖相關的核標記物[10]。在肺癌的預后研究中，Ki-67影響著治療療效，可作為預后差的標志物，在肺癌的免疫逃逸過程中，PD-L1表達高者，腫瘤細胞加速增殖，迅速惡化[11]，提示PD-L1高表達者，病情重，發展快。

LDH是乳酸脫氫酶，是個常規生化指標，肺癌患者中LDH升高者，PD-L1表達率顯著升高。美國AACR在2016年發布，在使用抗PD-L1抗體治療腫瘤時，LDH值正常的患者，腫瘤控制率顯著高于LDH值增高的患者。腫瘤細胞在侵襲發展的過程中，正常細胞破裂死亡，釋放出LDH，PD-L1越高，提示惡性程度越高，侵襲力強，LDH值越高，因此PD-L1可能成為肺癌患者生存的預測生物標志物。

近年來,以PD-L1/PD-1抑制劑為代表，現在已有鼠來源的22C3，獲得美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration,FDA)通過，并獲得認證，可以應用于臨床，用于非小細胞肺癌的伴隨診斷，篩選癌癥新藥Pembrolizumab單抗，增強機體內源性抗腫瘤效應。腫瘤免疫療法為無法手術，或轉移的晚期非小細胞肺癌患者帶來新的希望。SUN等[12]研究Ⅰ期患者PD-L1高表達患者的復發率顯著提高，ⅢB/Ⅳ期NSCLC患者PD-L1表達強陽性與OS較短相關。Madore[13]等研究提示，PD-L1蛋白表達提示較差的預后。深入研究PD-L1在NSCLC的表達情況，及相關分子顯得尤為重要。PD-L1與NSCLC病情發展和轉移存在相關性，抑制T細胞的活化增殖，進而導致病情進展或轉移，可作為病情程度的判斷指標。

本研究存在一些局限性，回顧性分析，樣本量不夠大，所選擇的患者不是有全部的臨床資料，進行了EGFR檢測患者數量有限，只分析了組織石蠟切片的結果，未對血液結果同步分析；腫瘤個體異質性，導致數據統計結果會有所偏差；僅選用22C3一種抗體檢測PD-L1表達情況，沒有涵蓋多種抗體檢測結果，免疫法判定也易受多種因素影響，不能做到標準化；缺乏患者使用Pembrolizumab治療療效的相關數據。隨著抗PD-1/PD-L1免疫治療的臨床應用，PD-L1與TNM分期淋巴結轉移CD8+T細胞、LDH和Ki67表達之間關系，尤其是與EGFR等肺癌驅動基因信號通路之間的聯系，進一步分析PD-L1表達在NSCLC患者中的預后意義，有助于靶向治療與免疫治療的在個體化，精準化治療手段中更加合理地規范使用，最終將肺癌的治療過程向慢性病邁進。