高通量測序技術在水生態污染監測中的應用

景 明， 陳 瑜， 高 昕， 李繼影

（江蘇省蘇州環境監測中心，江蘇蘇州215000）

0 引 言

張家港位于江蘇省蘇州市，區域范圍內水系發達，隨著區域經濟發展，人類活動一定程度上影響了河道水質。本研究主要針對張家港某生態污染河道河水呈赤紅色，經顯微鏡初步鑒定發現該現象是由微生物爆發導致的生態污染事件。微生物是指示水生態環境變化的敏感指標［1］。目前，微生物分類主要依靠光學根據細胞的形態結構特征確定其種類［2］。但顯微鏡檢測適用于鑒定細胞體積較大，具有顯著形態學的大型細胞，對于部分個體較小的細胞無法有效鑒定［3］。

隨著基因測序技術不斷地發展與普及，大數據分析能力不斷提高，基因組研究手段正越來越多地應用于鑒定形態學難以辨別的物種［4］。原核生物和真核生物的基因組都含有保守區和可變區，其中可變區能夠區分物種之間的差異，適用于進行測序和分類鑒定，是研究環境樣品中微生物物種群落的重要手段。目前高通量測序技術已經廣泛應用于研究藍藻水華的形成及其爆發原因的機理。本研究通過Illumina 測序對該河道的原核生物及真核生物分別進行測序，分析其群落結構及成因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及前處理

本次采樣地點為張家港污染河道（坐標為120°38′15.43E，31°48′32.11N），采樣時間2019-12-23，每個采樣點使用垂直采樣器在水面下0.5 m處收集5 L水樣，儲存在塑料瓶內，置于4 ℃冷藏箱后運回實驗室，在24 h內完成水樣中微生物的富集。采用標準方法［5］測定以下常規水質指標：葉綠素a、氨氮、總磷、總氮、化學需氧量、色度和pH。

樣品濃縮采用膜過濾法，將樣品通過醋酸纖維素濾膜（孔徑0.45 μm、直徑50 mm），用PBS（0.01 mol／L）對濾膜進行洗脫。然后將洗脫液進行高速離心濃縮（14 000 r／min，10 min），最后去掉上層清液，用1 mL PBS進行洗脫，然后進行DNA提取。

1.2 DNA提取及高通量測序

DNA提取采用CTAB［6］法標準化操作流程，然后采用瓊脂糖凝膠電泳進行DNA 濃度和純度檢測。最后取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng／μL作為基因組DNA 模板。根據待測序區域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物（New England Biolabs 公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。本研究選擇針對原核生物16S rRNA基因中高度變化的V4 區域［7］以及真核生物18S rRNA的V4 區域［8］的引物作為擴增子，詳見表1。PCR的反應條件為：95 ℃5 min，94 ℃60 s，57 ℃45 s，72 ℃60 s，共34 個循環，最后72 ℃ 終延伸10 min，16 ℃5 min。PCR產物通過2%的瓊脂凝膠電泳檢測。根據PCR產物的濃度對樣品進行等量混合，然后使用1 ×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳對PCR 產物進行純化，將剪切得到的目標條帶使用試劑盒回收產物，試劑盒為Thermo Scientific 公司GeneJET 膠回收試劑盒。

使用建庫試劑盒（Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns，Thermofisher）進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit 定量和文庫檢測合格后，進行上機測序（Ion S5TMXL，Thermofisher）。

表1 本研究PCR擴增引物引物序列

1.3 數據分析

使用Cutadapt［9］先對原始數據的reads 進行低質量部分剪切，去掉干擾數據，再根據Barcode 從處理后的數據中拆分出各樣品數據，然后進行去除嵌合體序列處理，即對截去Barcode 和引物序列初步質控得到原始數據Reads 序列［10］通過與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列［11］，得到最終的有效數據（Clean Reads）。

用Uparse 軟件［12］對樣品進行聚類分析，以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），選取OTUs 中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs序列進行物種注釋，用RDP Classifier 方法與Silva132 數據庫進行物種注釋分析（設定閾值為0.6 ～1.0）。使用MUSCLE 軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs 序列的系統發生關系。最后，以樣品中數據量最少為標準對測序數據進行均一化處理，后續的Alpha 多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數據。

2 結果與分析

2.1 測序數據分析及多樣性指數

本次擴增的第1 輪PCR擴增產物如圖1 所示，所擴增的基因片段條帶單一，長度分別約為300 bp 及350 bp，真核生物的生物量顯著高于原核生物。

圖1 擴增產物電泳圖

測序共獲得16S rRNA 基因V4 可變區的88 968條原始序列，通過數據篩選后共得到80 148 個高質量序列；18S rRNA 基因V4 可變區的88 510 條原始序列，通過數據篩選后，共得到87 841 個高質量序列。

將序列進行隨機抽樣，并通過對所抽到的序列數和代表的OTU數來構建稀釋性曲線，如圖2 所示。由圖可知，原核生物得到的注釋為548 種OTU，真核生物得到的注釋為33 種，兩個樣品的稀釋曲線趨于平坦，說明原核生物與真核生物的測序結果都較為完整，原核生物的物種分布較為均勻種群組成較為豐富；真核生物的種群組成比較單一。

圖2 OTUs稀釋曲線

對不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha Diversity 分析指數進行統計，結果見表2（均一化時選取的數據量：cutoff ＝65 446（原核生物）；cutoff ＝79 939（真核生物））。Shannon-Wiener指數和Simpson指數表示個體分布的均勻度，各物種之間個體分布越均勻，指數越高，如果每一個體都屬于不同的物種，指數則達到極值，由表可知真核生物的物種組成比原核生物單一。

表2 Alpha Indices 統計表

2.2 原核生物的多樣性和群落結構分析

對樣品中的原核生物OTUs 進行注釋后發現，本次樣品原核生物多樣性豐富，涵蓋了22 門74 種。其中，變形菌門（Proteobacteria）21 種，占54.5%；擬桿菌門（Bacteroidetes）24 種，占15.77%；放線菌門（Actinobacteria）1 種，占12.37%：厚壁菌門（Firmicutes）15 種，占8.19%，如圖3 所示。原核生物OTUs前6 的屬占總測序量的百分比見表3，6 個屬OTUs總百分比僅為32.18%，表明原核生物種類分布較為均勻。

圖3 原核生物門水平上的物種相對豐度餅狀圖

表3 原核生物主要物種注釋（前6 種）

2.3 真核生物的多樣性和群落結構分析

對所得到真核生物的OTUs序列進行物種注釋后發現，本次采集的樣品中真核生物種類比較單一，共發現4 個門12 種，其中金藻門（Chrysophyta）占93.95%，如圖4 所示，樣品中核心OTU 是Pedospumella encystans占93.94%，3 種微生物占真核生物的95%以上（見表4）。

圖4 真核生物門水平上的物種相對豐度餅狀圖

表4 真核生物主要物種注釋（前3 種）

顯微鏡觀察結果如圖5 所示，藻體呈棒狀及螺旋狀，游動速度較快。且棒狀藻體中含5 ～10 個顆粒狀色素體。幾乎所有的可見細胞均為該微生物，細胞顏色為紫紅色，水體中大量出現，導致河道水面呈現為紫紅色，形態學鑒定無法準確判斷該微生物種類。

根據高通量測序結果中真核生物和原核生物生物量以及物種豐度的區別，導致本次河道生態污染的微生物為Pedospumella encystans。篩選真核生物中特別關注的物種（相對豐度前10 的種）進行物種分類樹統計，進行展示，其物種分類樹如圖6 所示。

圖5 顯微鏡觀察結果

圖6 樣本中特定物種分類樹

3 討 論

3.1 高通量測序技術的應用

該河道微生物的優勢種個體較小，通過顯微鏡難以準確判斷其類別，而高通量測序技術具有能夠檢測數量較少、體積微小且不宜培養的微生物的能力［13］，用于檢測環境樣品中微生物群落結構的生物多樣性［4］。目前江蘇省浮游藻類監測主要建立在形態學鑒定的基礎上，本研究采用高通量測序技術對河道原核生物及真核生物的群落組成進行研究，同時結合形態學檢測結果，發現引起本次河道生態污染的微生物為一種體積較小，難以通過傳統顯微鏡鑒定種類的真核浮游藻類。高通量測序技術可以彌補顯微鏡觀察中難以判斷的物種信息，從而提高了浮游藻類監測的綜合能力［14］。

3.2 水環境因子對生物群落結構的影響

本研究中，河道的水質參數如表5 所示。由表5可知，該河道水體屬于劣5 類水體，相比其他指標化學需氧量濃度較低（5 類水40 mg／L），氨氮（5 類水2.0 mg／L）與總磷（5 類水0.4 mg／L）濃度較高，均超過5類水要求5 倍以上，可生化性較差（可生化處理的水質推薦的碳氮比為100∶5，該河道碳氮比為1∶1，推測有工業廢水排入），對活性微生物繁殖造成影響，致使水體的自凈能力得到影響，當有少數微生物能夠適應該水質條件時，該微生物易成為優勢種。

表5 該河道水質理化指標

3.3 優勢種Pedospumella encystans

金藻是生態學和生態生理學的原生模式種，一部分種類是水體中的初級生產力，另一部分是水體中部分細菌的捕食者，通常最佳生長條件為溫度較低，透明度較好且有機物含量較低的水體［15］，在初春、晚秋或冬季多有發現，多數存活于水體的中下層，有研究表明在冰面下某些金藻種類仍能存活［16］。

近幾年，系統發育樹和大系統分類學顯示了金藻門所包含種類的復雜性，許多種類為光合自養和異養生物之間的過渡［17］，其中異養型金藻與自養型金藻相比，具有較小的基因組和細胞體積，相對表面積較大，能夠高效利用環境中的營養鹽且所需代謝時間短于其它藻類。Pedospumella encystans 屬于金藻綱（Chrysophyceae），色金藻目（Chromulinales），Chromulinales科，Pedospumella 屬，屬于一種異養型微型浮游藻類［15］，細胞無細胞壁，僅含有一條鞭毛，Pedospumella encystans在中國發現較少，在已有研究中有報道，當水質的可生化性較差時，自養型微生物難以生存的條件下該種類易成為優勢種［18］。

4 結 論

本研究結果表明，運用高通量測序技術結合形態學鑒定能夠揭示水環境中微生物的多樣性及群落組成，得到更客觀、更準確的監測結果，在水生態監測和水質評價方面具有較好的應用潛力。

（1）對張家港生態污染河道進行形態學鑒定，群落組成單一，可見的微生物基本為同一種類。

（2）用高通量測序技術對18S rRNA 基因V4 區測序，結果顯示數量較多且群落組成單一，Pedospumella encystans 占93.94%。用高通量測序技術對16S rRNA 基因V4 區測序，結果顯示數量相對較少且群落分布較為均勻，由此得出主要的微生物為Pedospumella encystans。

（3）對該河道水質進行分析，推測該河道有工業廢水混入，可生化性較差，同時冬季河道水質不利于常規藻類生長，使得Pedospumella encystans 成為優勢種，導致了本次河道生態污染事件。