免疫細胞分離鑒定綜合實驗設計

孔小麗， 陳 思， 陳瑋琳， 黃 鐘

（深圳大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院醫(yī)學教學實驗中心，廣東深圳518060）

0 引 言

醫(yī)學免疫學是一門研究人體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能，連接基礎與臨床研究的重要學科。隨著實驗科學技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)越來越多高等醫(yī)學院校增設免疫學實驗課程。

實驗課程是學生獲取理論知識及對其加深理解的重要途徑。目前，醫(yī)學免疫學的理論教學改革已深入開展，伴隨著免疫技術(shù)的迅速發(fā)展，實驗教學方面的改革尚略顯滯后［1-3］。免疫細胞的分離鑒定是經(jīng)典的基礎醫(yī)學實驗之一，對臨床醫(yī)學本科生學習免疫細胞及其功能，了解免疫系統(tǒng)及免疫應答等相關知識具有重要意義［1-4］。國內(nèi)各大高校仍較少有將該大型貴重儀器運用于本科生實驗教學工作中。在學校現(xiàn)有大型貴重儀器平臺的基礎上，對經(jīng)典實驗教學進行升級，形成一個具有研究性綜合性的實驗教學，不但有利于學生鞏固掌握所學的理論知識，拓展學生的視野，還提升大型貴重儀器的使用率。

1 大型儀器設備的培訓

對大學生在使用大型儀器設備前的培訓是使用大型貴重儀器進行實驗教學成敗的關鍵。培訓主要是采用翻轉(zhuǎn)課堂教學方法進行的。教師提前錄制顯微鏡流式細胞分析儀操作演示視頻和軟件分析視頻，并上傳分享到專門的網(wǎng)站、微信教學公眾號或微信班級群，學生課堂前采用智能手機、平板電腦等工具，借助互聯(lián)網(wǎng)信息技術(shù)，線上自主觀看學習相關的教學材料。課堂上顯微鏡普通觀察操作由學生完成，設備專管技術(shù)老師輔助監(jiān)督，儀器軟件數(shù)據(jù)分析采集由任課教師輔助完成，引導學生分析問題，解決問題，對理論知識進行消化理解。

（1）正置熒光顯微鏡。實驗教學采用的是奧林巴斯BX51 正置熒光顯微鏡，主要由物鏡，熒光激發(fā)塊、熒光激發(fā)光源、圖像系統(tǒng)等基本構(gòu)件組成。其具有UIS2 光學系統(tǒng)，能夠完成出色的熒光觀察和微分干涉差觀察；顯像圖像軟件Cellsens 能夠完成理想的免疫細胞圖像處理。

（2）流式細胞儀。碧迪醫(yī)療公司（Becton Dickinson，BD）分析型流式細胞儀具有488 nm 和633 nm雙激光檢測器，可同時進行4 色檢測。課堂上采用的型號為FACS Calibur及FACS C6 Plus。流式細胞儀主要由液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、流動室和電子控制系統(tǒng)組成［1-2］，可分析細胞大小、濃度、細胞內(nèi)或細胞外蛋白質(zhì)表達等，給科研實驗室或臨床研究提供相關重要結(jié)果［6-7］。課堂上重點講解儀器的軟件數(shù)據(jù)分析，包括FSC、SSC、A、W、gate 等常用術(shù)語的介紹，F(xiàn)SC-SSC 物理參數(shù)圖，單參數(shù)圖，雙參數(shù)圖的表示和樣例數(shù)據(jù)分析。

流式細胞儀分離鑒定法與傳統(tǒng)方法如尼龍毛柱分離法、粘附分離法等相比，具有快速、準確、多參數(shù)分析等特點［5-7］，能直接計算顯示出各類細胞的相對含量，同時保持細胞的活性。

2 實驗設計

2.1 實驗原理和目的

外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞，是生命科學研究領域中最常用的細胞之一。PBMC的分離是免疫學研究中的一項基本技術(shù)，目前常用的PBMC 分離法有Ficoll-Hypaque密度梯度離心法，用此法分離PBMC 純度可達95%，其中淋巴細胞約占90%左右［5］。在傳統(tǒng)方法分離PBMC基礎上，進一步利用大型貴重儀器為本科實驗教學服務，即采用研究級正置熒光顯微鏡和流式細胞儀分離鑒定各淋巴細胞亞群。

2.2 實驗試劑和儀器

（1）實驗試劑。FITC-Anti-Human CD3（eBioscience），F(xiàn)ITC-Anti-Human CD4（eBioscience），PE-Anti-Human CD8（eBioscience），淋巴細胞分離液（達科為生物科技有限公司）等。正常人肝素抗凝全血2 ～4 mL／組（學生分5 組，學生自愿原則提供，深圳大學校醫(yī)院協(xié)助）

（2）儀器耗材。流式細胞分析儀，臺式冷凍離心機、正置熒光顯微鏡、移液器，吸管、載玻片等。

2.3 實驗方法

（1）Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞（PBMC）。采用PBS 將抗凝血稀釋1倍，吸取適量的淋巴細胞分層液置于離心管中，將稀釋全血沿管壁緩慢加至分離液上（稀釋后的血液與淋巴細胞分離液體積比為1 ∶1），保持兩者界面清晰。2 000 r／min 離心10 min。沿管壁輕輕吸出PBMC 層細胞，PBS 洗滌及離心細胞，去除大部分混雜的血小板。取部分沉淀細胞即PBMC顯微鏡下觀察拍照。

（2）人外周血CD3 淋巴細胞的顯微鏡觀察。輕取上述PBMC 細胞，加入FITC-CD3 抗體室溫孵育30 min，PBS洗滌2 次，最后一次離心后留部分液體，用加樣槍吹打混勻，吸出1 點于玻片上，加蓋玻片，在技術(shù)教師協(xié)助下熒光顯微鏡觀察拍照。

（3）人外周血CD4-CD8 淋巴細胞亞群的流式檢測。取流式管，設置好空白對照管、單陽管對照管及樣品管，每管中加入抗凝血100 ～200 μL，單陽管中分別加入FITC-CD4 和PE-CD8 抗體（1∶1 000 稀釋）一種抗體，而樣品管中同時加入CD4 與CD8 兩種抗體，混勻，室溫孵育30 ～60 min，按比例加入紅細胞裂解液裂解10 min，混勻，離心，PBS洗滌細胞，最后一次洗滌離心后定容至200 μL，樣品交由專管技術(shù)教師流式細胞儀上機檢測。

2.4 結(jié)果與分析

（1）密度梯度離心法分離PBMC及形態(tài)觀察。離心前試管內(nèi)有稀釋血和淋巴細胞分離液兩個層面，離心后試管內(nèi)可見到有多個清晰層面，如圖1（a）所示，從上到下依次為：血漿、單個核細胞、分離液、粒細胞、紅細胞。實驗所取的為單個核細胞層，即上層黃色血漿和白色Percoll 分離液層交界處一圈的乳白色層面為PBMC層。

圖1 外周血單個核細胞（PBMC）分析

該分離方法為傳統(tǒng)經(jīng)典的分離方法，PBMC 吸取出來，顯微鏡觀察如圖1（b）所示，可見視野中有大部分的淋巴細胞、少許紅細胞、血小板等。

（2）CD3 免疫細胞的熒光顯微鏡觀察。CD3 是所有T淋巴細胞膜上的共同標記，F(xiàn)ITC-CD3 抗體可以特異性識別并結(jié)合T 淋巴細胞膜表面CD3 抗原結(jié)構(gòu)分子。如圖2 所示，在熒光顯微鏡的觀察下，熒光標記清晰顯示在T 淋巴細胞膜上，呈細小顆粒狀綠色熒光。同一視野下，其余細胞（如粒細胞、紅細胞、血小板等）沒有熒光顯示。

圖2 CD3熒光顯微鏡觀察示意圖

（3）T淋巴細胞亞群的流式細胞儀鑒定。在使用流式細胞儀測定T淋巴細胞亞群時，先利用散射光參數(shù)—前向角散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）將細胞群區(qū)分出粒細胞、淋巴細胞、單核細胞［見圖3（a）］。在該散點圖上圈出所需分析的淋巴細胞群R1，圖3（b）、（c）的散點圖上顯示的是R1 淋巴細胞群的具體結(jié)果，F(xiàn)SC-A代表細胞大小，F(xiàn)SC-W 代表細胞寬度，CD4-FICT代表CD4 淋巴細胞熒光強度，CD8-PE 代表CD8淋巴細胞熒光強度。最后通過計算機Cellquest 軟件自動收集、數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計分析，得出各類陽性細胞的百分比率。圖3（c）可以顯示計算出CD4 和CD8 淋巴細胞亞群的數(shù)量多少。

CD3、CD4、CD8 淋巴細胞陽性比例在機體自身免疫、炎癥和抗腫瘤等方面具有重要的意義［8］。根據(jù)T淋巴細胞亞群CD4 與CD8 的數(shù)據(jù)比例，可以推算出機體的免疫功能。正常情況下，CD4／CD8 比例介于1.5～2.5 之間，如果發(fā)生病毒感染，CD8 將增多，比值會發(fā)生變化，假如比例發(fā)生異常，代表機體免疫絮亂及功能異常。目前，在臨床應用方面，可通過對不同的淋巴細胞亞群數(shù)量的測定來監(jiān)測患者的免疫狀態(tài)，并進行指導治療［8-10］。

圖3 不同散射光細胞參數(shù)散點圖

3 教學效果分析與討論

相較于傳統(tǒng)的醫(yī)學免疫學實驗教學，本實驗將教學與臨床科研相結(jié)合，取得良好的教學效果，從以下幾個方面體現(xiàn)出來。

3.1 利用大型貴重儀器，改革實驗方法

傳統(tǒng)免疫學實驗是采用尼龍棉分離鑒定T 淋巴細胞［10-13］，與其相比，本實驗教學緊跟最新發(fā)展的檢測方法，將實驗教學與醫(yī)學院大型貴重儀器相結(jié)合［14-15］。實驗教學中，利用研究級正置熒光顯微鏡觀察CD3 淋巴細胞的形態(tài)，通過計算機實時觀察圖片及處理保存；采用流式細胞儀鑒定T 淋巴細胞亞群，加深了學生對免疫細胞、免疫功能的理解，其實踐性方法特別為后續(xù)臨床或基礎研究具有重要意義。學生從細胞分離，提取細胞顯微鏡觀察，流式鑒定細胞，親自操作，整個實驗過程具有連貫性，有利于學生形成完整的實驗思路，有利于拓展科研創(chuàng)新思維和培養(yǎng)綜合能力。研究級顯微鏡和流式細胞儀的應用，改革實驗方法，能緊跟免疫學實驗教學以及最新發(fā)展的實驗技術(shù)。

3.2 合理安排實驗時間

由于課時限制，以往大多數(shù)免疫學教學實驗是由技術(shù)員事先完成大部分，學生按實驗講義指示完成剩余部分，或者一個完整的實驗分成二次課完成。實驗教學設計、實驗課堂的開展具有連貫性。具體實施過程是以小組為單位，30 個學生分為5 組。實驗課提前發(fā)實驗方案講義和儀器說明視頻給學生，讓學生課前提前查找相關資料，彌補課時不足，同時提高學生學習自主性。很多免疫反應或離心洗滌都需要一定的時間，在這些時間段，比如：在T淋巴細胞亞群抗原抗體反應的時候，學生可以利用這些時間完成PBMC 形態(tài)學觀察、CD3 淋巴細胞熒光顯微鏡的觀察。護士采血后學生小組實驗自主安排進行，小組間實驗交錯進行，合理利用實驗時間。最后，由大型貴重儀器設備專管老師協(xié)助檢測樣品。實驗教學中，更新了實驗小設備和實驗耗材，比如：量程精確的微量移液器、孵育震蕩箱、一次性槍頭、一次性培養(yǎng)液等，從而大量節(jié)省實驗時間。

3.3 改革實驗內(nèi)容，提高學生積極主動性

本實驗課程對免疫細胞進行分離檢測，經(jīng)過實驗操作，使學生容易對免疫系統(tǒng)、免疫細胞、免疫分子的結(jié)構(gòu)與功能等抽象理論有更好的理解認識。傳統(tǒng)免疫學實驗課程以免疫凝集反應、免疫沉淀反應等示范性實驗內(nèi)容或玻片示教為主，操作性實驗較少，且與實際臨床結(jié)合較少［1-4，8-9］。實驗設計以自愿為原則，課堂實驗教學分5 組，每一組分派1 或2 位學生，由校醫(yī)院專派護士抽取少許外周血作為測試的正常樣品。在學生實驗過程中，由于標本是學生自己的，都想看到實驗結(jié)果，而實驗結(jié)果好壞取決于操作者的每一個步驟。因此，實驗課堂從開始到最后得出實驗數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析，學生都呈現(xiàn)出極大的積極性，從而提高實驗教學效果。本實驗課程的內(nèi)容在科研、臨床上都具有較大實用價值，為學生今后進一步的臨床或科研學習工作打下基礎。

4 結(jié) 語

將實驗課程內(nèi)容與學科前沿技術(shù)相結(jié)合，在提高大型設備使用率的同時，學生不僅可以有目的性地消化醫(yī)學免疫學相關理論基礎知識，而且可以加深學生對免疫學新技術(shù)的認識和訓練，激發(fā)學生的學習興趣，為學生開展創(chuàng)新性實驗研究和畢業(yè)論文奠定基礎。隨著科學研究的發(fā)展，免疫學實驗技術(shù)應用越來越普遍，需要不斷學習并進一步完善免疫學實驗課的教學模式，提高教學效果，為學生今后開展臨床科研工作打下基礎。