染色盒同源物3對人結直腸癌細胞增殖的影響及其機制研究

張嘉琦，賈佩琦，蘇東明

0 引 言

結直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，在我國其發病率近年不斷上升。結直腸癌治療選擇多樣且個體化，包括腹腔鏡和手術局部切除、術前放療、姑息化療、靶向治療和免疫治療等等[1-3]。盡管如此，其治療形勢仍不樂觀。部分與結直腸癌風險相關的癌癥易感基因已被成功鑒定，但大多數導致發病的機制仍不清楚，有待進一步研究[4]。探討結直腸癌發生發展的分子機制，尋找可靠的結直腸癌早期治療靶點，仍舊是一個熱點與難點。

染色盒同源物3(Chromebox3，CBX3)，屬于CBX蛋白家族，是一種異染色質蛋白，又被稱為異染色質蛋白1γ(heterochromatin protein 1γ, HP1γ)，存在于哺乳動物體內。CBX3已被證實在肺腺癌、宮頸癌、乳腺癌、結直腸癌等多種癌癥中表達存在不同程度的上調，特別是結直腸癌中，已有研究證實miR-30a靶向CBX3，在小鼠異種移植模型中特異性地抑制結直腸癌細胞的生長[5]，說明CBX3在結直腸癌發生發展中發揮重要作用，而其可能涉及到的下游機制還未被完全闡明，有待進一步的研究。本研究旨在探討CBX3在結直腸癌中的表達，及其對結直腸癌細胞增殖的影響，并初步研究其下游作用機制，以期為結直腸癌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料人正常結腸上皮細胞系(NCM460)及人結直腸癌細胞系(HCT116、HT29、SW620)購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)公司。16例結直腸癌患者組織樣本及其配對癌旁組織樣本來自南京醫科大學附屬逸夫醫院病理科，病理診斷均為腺癌。

1.2 研究方法

1.2.1 生物信息學分析利用基因表達譜交互分析(GEPIA)數據庫(http://gepia.pku.cn/)分析CBX3在各個類型癌癥中癌組織及癌旁組織的表達情況，并對TCGA數據集內270例結直腸癌患者進行生存期分析，Kaplan-Meier生存曲線評估CBX3表達與結直腸癌生存結果之間的相關性；利用Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org/)分析CBX3基因在結直腸癌中表達差異，閾值的確定依據如下值：P值為0.0001，倍數變化為2，各基因排序；利用LinkedOmics數據庫(http://www.linkedomics. org/login.php)篩選CBX3相關基因并進行京都基因與基因組百科全書通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway，KEGG通路)富集分析。

1.2.2 免疫組織化學染色使用鏈霉菌生物素-過氧化物酶法(SP法)對收集的16例結直腸癌配對標本進行免疫組織化學染色。兔抗人CBX3抗體購自英國Abcam公司，鼠兔通用型二抗及濃縮型DAB購自北京中山金橋公司。染色結果由2位病理醫師獨立評分并進行統計，根據CBX3表達量，陰性0分，弱陽性1分，陽性2分，強陽性3分。

1.2.3 細胞培養人正常結腸上皮細胞NCM460，人結腸癌細胞系HCT116、HT29、SW620，均使用含10%胎牛血清的1640培養基進行培養。培養條件為：95%空氣，5%二氧化碳，37 ℃，培養箱濕度70%～80%。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達量收取正常結腸上皮細胞NCM460和結直腸癌細胞HCT116、HT29、SW620的細胞總蛋白進行Western blot實驗。使用10%或12%的SDS-PAGE膠進行蛋白質電泳，每孔上樣量20 μg。濕轉法將蛋白質轉到PVDF膜上，室溫下5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h。分別加入一抗4 ℃過夜，次日二抗室溫孵育1～2 h。在搖床上進行以上操作，每個步驟之間用TBST洗膜10 min×3次，最后加ECL超敏發光液暗室內曝光，拍照并進行灰度分析。

1.2.5 結直腸癌細胞轉染CBX3過表達質粒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，CBX3特異性小干擾購自上海吉瑪制藥技術有限公司。用于轉染的質粒載體經DNA Mini-prep(QIAGEN公司，德國)提取。按照脂質體核酸轉染試劑使用說明書(上海翊圣生物科技有限公司)將CBX3過表達質粒(記作CBX3-OE組)、空載質粒(記作Vector組)，或特異性小干擾(共三組序列，后續實驗使用si-1、si-2及si-3混合組進行，記作CBX3-RNAi組)、無義序列(同記作Vector組)轉染至6孔板上培養的結直腸癌細胞。24 h后用于增殖實驗；48 h后收集細胞用于Western blot實驗。

1.2.6 細胞增殖實驗采用SRB實驗及克隆形成實驗來觀察細胞增殖情況。用含10%胎牛血清的培養基懸浮細胞并計數，在96孔板中每孔接種3000個細胞，完全培養基體積200 μL，分別于24 h、48 h、72 h和96 h收取細胞進行SRB染色，檢測515 nm波長處吸光值；在六孔板中每孔接種300～500個細胞，培養10～14 d，肉眼可見細胞克隆時，進行結晶紫染色后拍照，鏡下計數克隆數目。

1.2.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)HCT116細胞轉染特異性小干擾及無義序列后，提取RNA，按照逆轉錄試劑盒(美國Qiagen 公司)說明書進行逆轉錄，獲得cDNA，存于-20 ℃。訂購CBX3及CEBPD(CCAAT/enhancer-binding protein delta，CCAAT/增強子結合蛋白delta)引物，按照qRT-PCR標準體系加樣，在實時定量PCR儀(ABI公司，美國)上運行程序。CBX3及CEBPD相對于GAPDH的表達使用2-ΔΔCt法計算和標準化。

1.2.8 轉錄組測序選取HCT116細胞系，利用siRNA敲低CBX3表達，對CBX3敲低組及其對照組進行轉錄組測序。測序后，對2組間基因表達量進行差異分析，篩選出顯著差異基因并制作熱圖。

2 結 果

2.1 生物信息學分析

2.1.1 數據庫分析CBX3表達及其與生存期關系GEPIA數據庫分析顯示,CBX3在多種癌癥中呈現高表達，尤其在結腸癌與直腸癌中，CBX3顯著高表達，見圖1。在Oncomine數據庫中，CBX3的mRNA表達水平明顯高于正常組織(P<0.01)。上述結果提示CBX3表達水平在結直腸癌中明顯升高。Kaplan-Meier生存曲線顯示，高表達CBX3的患者無病生存期低于低表達組(log-rank檢驗，P=0.034)，提示CBX3高表達與低生存率相關，見圖2。

圖1 GEPIA數據庫分析CBX3在癌癥特別是結直腸癌中表達水平

圖2 CBX3表達水平與無病生存期關系

2.1.2 CBX3共表達網絡研究KEGG通路分析結果顯示，CBX3相關基因在核糖體、剪接體、蛋白酶體、RNA運輸及降解、錯配修復、細胞周期、Th17細胞分化、T細胞受體信號等多種途徑富集，表明CBX3對轉錄組的影響廣泛且復雜。

2.2 結直腸癌組織及細胞中CBX3表達水平免疫組織化學染色結果顯示，CBX3主要定位于細胞核中，且在腫瘤組織中的表達明顯高于對應癌旁組織，染色結果進行評分統計，差異具有統計學意義(P<0.0001)，見圖3。Western blot實驗表明，CBX3在各結直腸癌細胞系中蛋白表達量顯著高于正常結腸上皮細胞系，見圖4。

*P<0.01圖4 Western blot檢測結直腸癌細胞系中CBX3蛋白相對表達量(n=3)

2.3 CBX3對結直腸癌細胞增殖的影響Western blot結果顯示過表達及敲低效率顯著，見圖5。SRB實驗結果顯示，與Vector組相比，CBX3-OE組細胞增殖速率明顯上升，CBX3-RNAi組細胞增殖速率明顯下降;克隆形成實驗結果顯示，與Vector組相比，CBX3-OE組細胞克隆形成數量明顯增多，CBX3-RNAi組克隆形成數目明顯減少;見圖6。以上結果提示CBX3能夠促進HCT116細胞的增殖。

*P<0.05圖5 Western blot驗證CBX3過表達或敲低效率(n=3)

a：SRB實驗(與24 h相比)；b：克隆形成實驗*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001圖6 SRB實驗及克隆形成實驗檢測細胞增殖能力(n=3)

2.4 敲低CBX3后對CEBPD表達的影響轉錄組測序篩選差異基因熱圖見圖7a，查閱其基因功能最終選取CEBPD、ADAM9、NT5E進行后續實驗。qRT-PCR結果顯示，敲低CBX3后，CEBPD mRNA水平顯著升高，見圖7b。Western blot結果顯示，CEBPD蛋白水平也相應升高，見圖8a。GEPIA數據庫中CBX3與CEBPD相關性分析提示兩者存在負性相關，見圖8b。以上結果提示，CBX3的促癌作用可能通過抑制下游CEBPD的表達來實現。

a：轉錄組測序差異基因熱圖；b：qRT-PCR檢測差異基因表達*P<0.001圖7 轉錄組測序篩選差異基因并進行驗證(n=3)

a：Western blot檢測CEBPD蛋白相對表達量；b：CBX3與CEBPD相關性分析(GEPIA)*P<0.05、**P<0.001圖8 Western blot檢測CEBPD表達水平(n=3)

3 討 論

CBX3蛋白屬于CBX蛋白家族，與其結構相似的還有CBX1和CBX5，均屬于異染色質蛋白。已知異染色質蛋白高度保守并參與細胞功能，包括DNA復制和修復[6]、轉錄調控[7]和RNA拼接[8]、細胞分化[9-10]、細胞周期和細胞分裂調控[11]、著絲粒和端粒內環境穩定[12]等。而不同的亞型又具有各自獨特的功能，本課題重點關注CBX3的功能及機制。

前期調研發現，CBX3與多種癌癥相關，例如，有研究顯示CBX3的體內敲低減少了K-RasG12D誘導的肺腺癌的發生，延長了K-RasG12D誘導的肺腺癌小鼠的存活期[13]；有關胰腺癌的研究中發現，CBX3的過度表達可以誘導胰腺癌細胞的體外增殖、無錨定生長、遷移和侵襲等等[14]。課題組通過生物信息學分析，明確了CBX3在多種癌癥中均呈現高表達，尤其在結直腸癌中，CBX3表達顯著升高且與預后相關。KEGG通路分析提示，CBX3可能通過蛋白酶體、RNA運輸及降解、錯配修復、細胞周期等途徑影響結直腸癌的發生發展，從而發揮積極的促癌作用。

后續研究中，利用免疫組織化學染色及Western blot實驗，確認了CBX3在結直腸癌組織中及細胞中均顯著高表達。通過在結直腸癌細胞中過表達或敲低CBX3證明了CBX3能夠促進結直腸癌細胞的體外增殖。在此基礎上進一步進行轉錄組測序，以期能夠找到CBX3促進結直腸癌細胞增殖的下游分子機制。

通過轉錄組測序，在敲低CBX3后，課題組發現多個癌癥相關因子表達發生改變，其中CEBPD表達明顯升高。CEBPD是一種轉錄因子，由單個外顯子CEBPD基因編碼，能夠調控細胞分化、運動、生長停滯、增殖和死亡等多種生物學過程。有研究顯示，紫草素對銀屑病局部皮損JAK/STAT3信號通路有明顯抑制作用，并增加CEBPD的表達，從而顯著抑制細胞增殖并誘導凋亡[15]。而另有研究證實，CBX3敲低可以導致骨肉瘤細胞中G0和G1期的凋亡增加和細胞周期停滯[16]，提示CBX3與細胞凋亡途徑密切相關。通過GEPIA數據庫對CBX3和CEBPD進行相關性分析，發現兩者存在負性相關，因此推測，CBX3可能通過抑制CEBPD表達從而進一步抑制細胞凋亡，在結直腸癌中發揮促癌作用。但兩者之間具體的作用機制還未完全明確，有待進一步研究與完善。

綜上所述，本課題組在細胞水平驗證了CBX3能夠促進結直腸癌細胞的增殖，并發現這種促進作用可能是通過抑制CEBPD轉錄因子的表達而實現的，從而為基于CBX3為靶標的結直腸癌早期診療提供了新思路。