水下爆炸致急性心肺損傷模型中不同劑量烏司他丁的治療效果評(píng)價(jià)

葉長(zhǎng)青，邵先安，王前進(jìn)，王 靜，馬宏昊，齊曉林，尹 純

0 引 言

爆炸傷是一種戰(zhàn)時(shí)發(fā)生的特殊類(lèi)型創(chuàng)傷。現(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)中,使用水下爆炸的方式破壞水面艦艇、潛水艇和海軍基地建筑物及水下設(shè)施是常見(jiàn)的打擊手段，也對(duì)水下作戰(zhàn)或作業(yè)人員的健康造成極大威脅[1]。空氣中爆炸引起胸腹部以及脊髓損傷較多，而水下爆炸傷以心肺損傷最常見(jiàn)，也最嚴(yán)重，如不及時(shí)救治很容易導(dǎo)致?lián)p傷對(duì)象死亡[2-3]。除了爆炸沖擊波直接作用于胸部的原發(fā)性損傷外，大量炎性細(xì)胞因子被釋放入血導(dǎo)致的繼發(fā)性炎癥損傷也是重要的致死原因[4]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α (TNF-α)是參與心肺損傷炎癥反應(yīng)的重要炎性細(xì)胞因子之一，其與急性心肺損傷發(fā)病以及嚴(yán)重程度密切相關(guān)[5]；中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶 (NE)是中性粒細(xì)胞激活的標(biāo)志物，也是激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要效應(yīng)因子[6]；白細(xì)胞介素8 (IL-8)對(duì)多種白細(xì)胞具有趨化活性,特別是在炎性反應(yīng)中可引起局部中性粒細(xì)胞的聚集[7]。有研究觀測(cè)到兔胸部爆炸傷后IL-6、IL-8及TNF-α顯著升高[8]。基于上述炎性細(xì)胞因子在心肺損傷中發(fā)揮的重要作用，本研究利用中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)爆炸力學(xué)實(shí)驗(yàn)室的水下爆炸裝置建立兔急性心肺損傷模型，通過(guò)觀察心肺組織的濕干重比值、家兔PaO2及血清中TNF-α、NE和IL-8的水平變化，探討藥物對(duì)水下爆炸致急性心肺損傷的治療效果。烏司他丁是一種廣譜胰蛋白酶抑制劑，由人尿液中分離純化而來(lái)。它能夠抑制氧自由基的產(chǎn)生、抑制白細(xì)胞過(guò)度激活，從而保護(hù)血管內(nèi)皮和基膜、降低血管通透性，是一種常用的急性炎癥反應(yīng)治療藥物[9]。有研究結(jié)果提示烏司他丁能抑制TNF-α所引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞高通透性，有效抑制急性肺損傷炎癥反應(yīng)，一定程度上緩解肺水腫與肺出血等癥狀[10]。但目前為止，烏司他丁治療水下爆炸導(dǎo)致急性心肺損傷的效果評(píng)價(jià)尚缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。本研究立足實(shí)戰(zhàn)需要，從組織病理到細(xì)胞因子在多個(gè)層面系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了不同劑量烏司他丁對(duì)水下爆炸致急性心肺損傷的治療效果，為開(kāi)發(fā)新型治療策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取40只健康成年新西蘭雄兔(安徽長(zhǎng)臨河醫(yī)藥科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：syxk(皖)2007-002)，體重為(1.8±0.2)kg。在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，密切觀察一般情況，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天禁食12 h。采用抽簽法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、爆炸損傷組、低劑量烏司他丁組和高劑量烏司他丁組，每組10只。利用水下爆炸裝置對(duì)爆炸損傷組、低劑量烏司他丁組和高劑量烏司他丁組造成急性心肺損傷，并在致傷后即刻對(duì)低劑量烏司他丁組和高劑量烏司他丁組分別進(jìn)行2.5萬(wàn)U/kg和10萬(wàn)U/kg的烏司他丁治療

1.2 水下爆炸利用氯胺酮和氟哌利多的混合麻藥麻醉家兔，分別從左頸總動(dòng)脈和右頸外靜脈放置留置針。手術(shù)完成后，將家兔放在鋼制保護(hù)箱中，鋼板開(kāi)窗，窗口的大小和家兔的胸部大小基本吻合。將家兔胸部緊貼窗口，其他部位均保護(hù)在鋼板內(nèi)。隨后將鋼板放置在水下爆炸池內(nèi)，以1.0 g太安作為爆炸源，家兔距爆心1.8 m，由專(zhuān)業(yè)人員實(shí)施爆炸。爆炸后立即清理家兔呼吸道，密切觀察其呼吸、心率、精神狀態(tài)和應(yīng)激反應(yīng)等。

1.3 烏司他丁治療在水下爆炸后即刻對(duì)低劑量烏司他丁組和高劑量烏司他丁組進(jìn)行烏司他丁治療。按照低劑量烏司他丁組(2.5萬(wàn)U/kg)和高劑量烏司他丁組(10萬(wàn)U/kg)的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)兔體重計(jì)算烏司他丁劑量，用等滲鹽水溶解烏司他丁粉劑(廣東天普生化醫(yī)藥有限公司，批號(hào)031505264)，然后按照相應(yīng)的劑量經(jīng)靜脈置管緩慢推注。

1.4 動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)測(cè)量將5 mL注射器用肝素溶液(1000 U/mL)浸潤(rùn)管壁。在爆炸前以及爆炸后4 h、12 h、24 h分別通過(guò)左側(cè)頸總動(dòng)脈抽取2 mL動(dòng)脈血。原則上借助動(dòng)脈血壓推動(dòng)針芯使動(dòng)脈血自動(dòng)進(jìn)入含肝素液的注射器內(nèi)，然后立即將注射器插入橡膠塞隔絕空氣，隨后利用美艾利爾Epoc? 血?dú)夥治鱿到y(tǒng)測(cè)量PaO2。

1.5 心肺組織濕干重比值檢測(cè)爆炸24 h后，毀髓法處死家兔，取左肺中葉和心尖部位，等滲鹽水迅速?zèng)_洗后迅速吸干表面等滲鹽水和血跡后稱(chēng)取組織濕重，隨后將組織塊置于80 ℃干燥箱烘干72 h后稱(chēng)取干重。用濕重除以干重，計(jì)算濕/干重比值。

1.6 血清細(xì)胞因子濃度測(cè)定以3種在炎癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子(TNF-α，IL-8，NE)為代表，分析了烏司他丁治療對(duì)血清炎性細(xì)胞因子水平的影響，進(jìn)一步探索烏司他丁治療水下爆炸導(dǎo)致急性心肺損傷的效果。在爆炸后4 h、12 h、24 h分別通過(guò)左側(cè)頸總動(dòng)脈抽取4 mL動(dòng)脈血，緩慢注入干管內(nèi)靜置30 min，在離心半徑25 cm、轉(zhuǎn)速4000 r/min 條件下離心15 min，收集血清。按照說(shuō)明書(shū)的操作步驟，利用兔TNF-α ELISA試劑盒(上海江萊生物科技公司，批號(hào)201602)；兔IL-8 ELISA試劑盒(上海江萊，批號(hào)201602)；兔NE ELISA試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號(hào)20160127FR)完成TNF-α、IL-8和NE濃度測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)兔生理狀態(tài)及PaO2變化爆炸損傷組動(dòng)物在爆炸后4 h、12 h、24 h出現(xiàn)心跳加速、口唇發(fā)紺、呼吸急促、口吐淡紅色黏液等表現(xiàn)，正常對(duì)照組中未觀測(cè)到上述表現(xiàn)。爆炸損傷組在爆炸后4 h、12 h、24 h的PaO2均顯著低于正常對(duì)照組(P=0.042，P=0.018，P=0.002)；低劑量和高劑量烏司他丁組在爆炸后4 h、12 h、24 h的PaO2與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔在爆炸后不同時(shí)間點(diǎn)的PaO2比較

2.2 各組實(shí)驗(yàn)兔心肺組織的濕干重比值與對(duì)照組相比，爆炸損傷組動(dòng)物的心肌組織和肺組織的濕干重比值均顯著升高(P=0.037，P=0.028)。高劑量烏司他丁組的心肌組織濕干重比值明顯低于爆炸損傷組(P=0.047)，這凸顯了高劑量烏司他丁對(duì)水下爆炸致心肌損傷的明確療效。盡管低、高劑量烏司他丁組的肺部濕干重比值與爆炸損傷組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.649，P=0.267)，但低、高劑量烏司他丁組的肺部濕干重比值中位數(shù)低于爆炸損傷組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)兔心肌組織和肺組織的濕干重比值比較(紅線代表中位數(shù)和四分位間距)

2.3 烏司他丁治療與血清炎性細(xì)胞因子水平變化與爆炸損傷組相比，低劑量烏司他丁組的血清TNF-α含量在爆炸后12 h和24 h均明顯降低(P=0.018，P=0.013)，高劑量烏司他丁組的血清TNF-α含量也在爆炸后24 h低于爆炸損傷組(P=0.004)。低、高劑量烏司他丁組血清NE含量均在爆炸后24 h顯著低于爆炸損傷組(P=0.007，P= 0.036)。高劑量烏司他丁組的血清IL-8在爆炸后4 h、12 h、24 h均顯著低于爆炸損傷組(P=0.024，P=0.007，P=0.011)，但低劑量烏司他丁組的血清IL-8與爆炸損傷組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 爆炸損傷組與烏司他丁組實(shí)驗(yàn)兔的血清TNF-α、NE、IL-8含量比較

3 討 論

建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究水下爆炸傷的基礎(chǔ)，目前主要有兩種方法制作模型：通過(guò)激波管產(chǎn)生沖擊波致傷以及直接進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)水下爆炸[11]。我們采用后一種方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后固定在水下爆炸裝置內(nèi)，通過(guò)保護(hù)裝置可以選擇性地致傷某一部位，如腹部、脊髓等[12]。我們以往的研究?jī)H從細(xì)胞因子水平觀察烏司他丁對(duì)TNF-α、NF-κB、MMP-9等個(gè)別細(xì)胞因子的影響，并未從更宏觀的角度全面評(píng)價(jià)藥物對(duì)急性肺損傷的治療效果[13-14]。此外，由于心臟同樣是空腔器官，在實(shí)際水下爆炸中心肺損傷往往同時(shí)發(fā)生，心臟損傷對(duì)機(jī)體的影響也不容忽視。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期對(duì)爆炸條件的摸索，我們成功建立水下爆炸急性心肺損傷模型，通過(guò)給予不同劑量烏司他丁治療，全面評(píng)估兩種劑量烏司他丁對(duì)PaO2、炎性細(xì)胞因子水平、心肺組織濕干重比值的影響。

急性肺損傷是由肺內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)釋放引起的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重的可能發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征和頑固性低氧血癥[5]。有研究發(fā)現(xiàn)胸部撞擊致家兔急性肺損傷后，家兔PaO2會(huì)出現(xiàn)下降[15]。與之相似，本研究觀測(cè)到家兔在爆炸損傷后也出現(xiàn)了明顯的PaO2下降。烏司他丁屬于一種廣譜胰蛋白酶抑制劑，能抑制氧自由基的產(chǎn)生、抑制白細(xì)胞過(guò)度激活，從而保護(hù)血管內(nèi)皮和基膜、降低血管通透性，緩解肺水腫、肺出血等癥狀[9-10]。最新的meta分析提示烏司他丁能夠改善創(chuàng)傷后急性肺損傷患者呼吸功能和預(yù)后情況[16]。我們以往探索過(guò)血必凈對(duì)水下爆震傷的治療效果[17]，但烏司他丁能否有效治療水下爆炸導(dǎo)致的心肺損傷尚缺乏實(shí)驗(yàn)研究。在烏司他丁治療組中，在爆炸后4 h、12 h、24 h的PaO2與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不過(guò)，與爆炸損傷組相比，低劑量或高劑量烏司他丁治療后血氧分壓并沒(méi)有顯著上升，僅呈現(xiàn)出改善的趨勢(shì)。這可能是本研究樣本量較少的緣故，要推導(dǎo)出更可靠的結(jié)論有待更大規(guī)模的研究。濕干重比值是反應(yīng)炎癥性損傷的一個(gè)重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是心肌組織還是肺組織，在爆炸損傷后的濕干重比值均顯著大于正常對(duì)照組，提示空腔器官在沖擊波作用下比較容易出現(xiàn)滲出、水腫等炎性反應(yīng)。采用烏司他丁治療后，心肌的炎癥反應(yīng)明顯減輕。肺部的炎性反應(yīng)呈現(xiàn)減輕的趨勢(shì)，但受限于樣本量較少，未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

原發(fā)性肺損傷會(huì)激活心肺組織內(nèi)巨噬細(xì)胞，后者通過(guò)釋放TNF-α 進(jìn)一步誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞等釋放IL-6、IL-8 、NE等炎癥因子，趨化中性粒細(xì)胞聚集并釋放溶酶體酶、氧自由基，損害血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，增加毛細(xì)血管通透性,造成繼發(fā)性炎癥損傷[18]。在本研究中，烏司他丁治療組實(shí)驗(yàn)兔均在爆炸后觀測(cè)到血清TNF-α、NE水平明顯低于爆炸損傷組，這提示高劑量和低劑量烏司他丁治療均對(duì)水下爆炸心肺損傷模型的血清TNF-α和NE 水平有抑制效果。高劑量烏司他丁組的血清IL-8在爆炸后4 h、12 h、24 h均顯著低于爆炸損傷組，而該現(xiàn)象并未在低劑量烏司他丁組中觀察到。這表明高劑量烏司他丁對(duì)于IL-8的抑制要明顯優(yōu)于低劑量烏司他丁。

本研究成功建立了可以選擇性致傷胸部的水下爆炸傷動(dòng)物模型，初步證明了烏司他丁對(duì)水下爆炸致急性心肺損傷的治療價(jià)值，為未來(lái)海上戰(zhàn)傷救治提供治療決策依據(jù)。不過(guò)本研究樣本量較少，觀察時(shí)間較短(致傷后24 h內(nèi)，屬于早期炎癥反應(yīng))，此結(jié)論有待于臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。