Raji-MG63細胞共培養體系中心肌營養蛋白樣細胞因子1(CLCF1)對RANKL/OPG比值及成骨細胞分化的影響

陳娟 葉云金 謝麗華 陳賽楠 葛繼榮 許惠娟

福建省中醫藥科學院骨質疏松證候基因組學重點研究室，福建 福州 350003

2000 年Arron[1]首次提出“骨免疫學”概念，講述了骨骼系統與免疫系統之間的相互關系，在維持骨代謝平衡過程中，免疫因素發揮著重要作用。B 淋巴細胞、T淋巴細胞、細胞因子和趨化因子等均能與成骨細胞、破骨細胞相互作用，調節骨形成和骨吸收[2-3]。其中，骨保護素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)系統是骨代謝與免疫系統之間的橋梁[4]。OPG 主要來源于骨微環境內B 細胞及漿細胞，對骨有保護作用。成骨細胞分泌RANKL，可激活破骨細胞和單核巨噬細胞(破骨細胞前體細胞)膜表面的RANK受體，引起破骨細胞活化。

心肌營養蛋白樣細胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1，CLCF1)基因屬于白細胞介素6(IL-6)細胞因子家族成員，是一種B細胞刺激劑，與神經內分泌免疫調節密切相關[5-6]。課題組前期研究發現，CLCF1 是絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)腎陰虛證關聯基因[7]。但CLCF1基因參與PMOP的具體機制尚不清楚。本研究通過構建Raji-MG63細胞共培養體系，研究CLCF1基因對RANKL/OPG比值和成骨細胞分化的影響。旨在從骨免疫角度，探討CLCF1 對OPG/RANKL/RANK信號系統的調控機制，闡明PMOP的骨免疫機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人B淋巴瘤細胞Raji細胞、人骨肉瘤細胞 MG63均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；MEM培養基(GIBCO公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS,GIBCO公司)；青鏈霉素(Invitrogen公司)；CRISPR/Cas9慢病毒系統(上海吉凱基因化學技術有限公司)；CLCF1、OPG、RANKL、JAK2、p-JAK2 STAT3、p-STAT3、GAPDH抗體(Abcam公司)；堿性磷酸酶檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);茜素紅(南京凱基)。

1.2 方法

1.2.1CLCF1基因敲除Raji細胞株的構建：Raji細胞用含10 % FBS、1 %雙抗的RPMI-1640培養基，置于含5 % CO2孵箱中以37 ℃恒溫培養。CRISPR/ Cas9基因編輯技術介導的CLCF1基因敲除Raji細胞株的構建,參考文獻[8]。CLCF1 sgRNA 序列5’-TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3’。實驗分2組：對照組(Control組)和CLCF1敲除組(CLCF1-KO組)。轉染前先將Raji細胞接種于6孔板中，Control組和CLCF1-KO組按照感染復數(multiplicity of infection，MOI)100，分別感染CRISPR/ Cas9-CLCF1慢病毒及相應陰性對照慢病毒。24 h后換正常培養液，轉染72 h后通過熒光顯微鏡及FCM觀察感染效率，并收取細胞進行相關檢測。

1.2.2Raji-MG63細胞共培養體系的構建：應用Transwell 實驗建立共培養體系，將Raji細胞種植于24孔板Transwell小室上層,下層為成骨細胞系MG63，細胞以完全培養基(RPMI1640培養基+10 %胎牛血清+1 %雙抗)常規培養。

1.2.3Western blot檢測蛋白水平：運用RIPA裂解法提取轉染后各組細胞總蛋白，定量蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品，110 V、120 g/L SDS-PAGE分離蛋白70 min。采用濕轉系統，100 V恒壓轉膜 60 min，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入CLCF1抗體(1∶1 000)、OPG抗體(1∶1 000)、JAK2、p-JAK2 STAT3、p-STAT3抗體(均1∶1 000)、RANKL抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶2 000)。4 ℃孵育過夜；1×TBST 漂洗3次，加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗(1∶4 000)，常溫孵育1 h；1×TBST 漂洗4 次，避光條件下化學發光檢測，并進行灰度值分析。以GAPDH作為內參計算目的蛋白相對灰度比值[9]。

1.2.4ALP活性檢測：參考碧云天堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書，收集各組細胞，計數后，添加150 μL 0.2 %Triton X-100裂解細胞，4 ℃，15 000 r/min離心15 min，收集上清液作為樣品；向96孔板內添加50 μL底物、30 μL緩沖液和20 μL樣品，在微孔板震蕩器上充分振蕩1 min后，37 ℃孵育15 min；添加100 μL反應終止液，在微孔板震蕩器上充分振蕩1 min后，酶標儀測量405 nm處的吸光值；同樣方法進行空白(蒸餾水)對照和標準品的檢測，實驗數據取ALP活性與細胞蛋白總量的比值進行統計分析。

1.2.5茜素紅染色：細胞用PBS洗2次；每孔加入2 mL 4 %中性甲醛溶液，固定30 min；吸走中性甲醛溶液，用PBS洗2次；每孔加入1 mL茜素紅染液染3～5 min；吸走茜素紅染液，用PBS洗2次；每孔加入 1 mL 10 %十六烷基吡啶，輕微搖晃 10 min 洗脫染料，吸取200 μL 加入96孔板中，分光光度計檢測 540 nm 處吸光值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 抑制CLCF1基因表達對RANKL/OPG比值和JAK2/STAT3通路的影響

CRISPR/ Cas9-CLCF1慢病毒感染Raji細胞72 h后,Western blot結果顯示，與對照組相比，CLCF1基因敲除組CLCF1蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(圖1 A)，提示成功建立CLCF1基因敲除的Raji細胞株。

為探討CLCF1基因對RANKL/OPG和JAK2/STAT3通路的調控作用，筆者檢測了相關蛋白的表達變化。結果顯示，與對照組相比，CLCF1基因的敲除顯著降低OPG的表達，但對RANKL的表達影響輕微(圖1 A，圖1B)。與對照組相比，CLCF1基因敲除增加了RANKL/OPG比率(圖1C)。此外，CLCF1基因敲除組，p-JAK2 和p-STAT3水平均減少(圖1 A)，p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值降低(圖1B)。說明抑制CLCF1表達，會抑制JAK2/STAT3通路的激活，并影響RANKL/OPG的比值。

圖1 CLCF1對JAK2/STAT3通路和RANKL/OPG比值的影響A:Weste blot分析CLCF1基因敲除對JAK2/STAT3通路及RANKL和OPG影響;B:相對蛋白質水平的定量分析;C:Weste blot分析顯示CLCF1基因敲除對RANKL/OPG比值的影響。注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Fig.1 Effects of CLCF1 on the JAK2/STAT3 pathway and RANKL/OPG ratio

2.2 抑制CLCF1基因表達對成骨細胞分化的影響

為了探討CLCF1基因能否通過RANKL/OPG系統影響成骨細胞分化，筆者通過Transwell小室建立了Raji-MG63細胞共培養系統。通過堿性磷酸酶(ALP)活性和茜素紅S染色水平分析MG63細胞成骨分化能力。結果表明，與對照組相比，CLCF1基因敲除組MG-63細胞ALP活性降低(圖2 A)。鈣結節的數量和體積明顯低于對照組，茜素紅半定量結果顯示CLCF1基因敲除組成骨能力弱于對照組，差異有統計學意義(圖2B)。提示抑制CLCF1基因表達能抑制成骨細胞分化。WB結果顯示，CLCF1基因敲除組MG63細胞OPG蛋白表達水平明顯降低，RANKL蛋白上調，RANKL/OPG 比值升高；同時，p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值降低。與對照組比較，差異具有統計學意義(圖2C)。

圖2 CLCF1基因敲除對Raji-MG-63共培養體系中MG-63細胞成骨分化的影響A：MG63細胞JAK2/STAT3通路和RANKL/OPG的相對蛋白水平的定量分析；B：MG-63細胞ALP活性評價成骨能力的分析；C：茜素紅染色分析MG63細胞成骨能力。注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Fig.2 Effect of CLCF1 gene knockout on osteogenic differentiation of the MG-63 cells in the Raji-MG-63 co-culture system

3 討論

CLCF1作為IL-6家族的細胞因子，參與調節B細胞的增殖和運動神經元的發育。然而，CLCF1在骨代謝的生理和病理學中的作用尚待明確。本研究結果表明，抑制 CLCF1的表達能使JAK2/STAT3通路失活、RANKL/OPG比值升高。此外，CLCF1基因敲除能抑制成骨細胞分化。提示CLCF1可能通過調節RANKL/OPG平衡在免疫介導的骨代謝中發揮作用。

骨免疫學的概念指出，骨質疏松癥、類風濕關節炎和牙周炎等慢性炎癥性疾病通過激活免疫細胞合成的細胞因子來誘導骨丟失[10-11]。在這方面，許多被認為與骨免疫相關的細胞因子，如白細胞介素6(IL-6)[12]、腫瘤壞死因子α(TNF-α)[13]、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)[14]、核因子-κB受體激活劑(RANK)及其配體(RANKL)[15]都被發現參與了這一生物學過程。OPG/RANK/RANKL通路在骨免疫中的作用已被廣泛報道。RANKL負責刺激破骨細胞分化和骨吸收，而OPG通過阻斷RANKL抑制骨吸收。OPG、RANKL 和其唯一受體RANK是調節破骨細胞分化成熟的重要信號系統，在骨質疏松中起重要作用[16]。RANKL能激活單核巨噬細胞(破骨細胞前體細胞)膜表面的RANK受體，促進破骨細胞的活化[17]。RANKL作為一種重要的細胞因子,能調節T細胞和早期階段B細胞的發育和功能,對免疫系統發育也起著起重要作用。OPG與RANK競爭性地結合RANKL，阻斷RANKL與RANK結合，從而抑制破骨細胞前體細胞的分化，起到抑制骨吸收的作用[18]。因此OPG/RANKL/RANK信號系統被認為是骨免疫研究的介入點。

作為IL-6細胞因子家族的一員，CLCF1在免疫細胞中高表達。CLCF1的作用主要在于支持運動神經元的生存和發育。同時，CLCF1在免疫調節功能和B細胞擴張中也發揮重要作用，影響B細胞群的存活和分化[19]。研究[20]表明，由 B細胞所表達的RANKL促進破骨前體細胞分化，并引發骨吸收。在骨骼生物學中起著至關重要的作用。IL-6家族的成員，包括睫狀神經營養因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、心肌營養素-1(CT-1)和腫瘤抑制素M(OSM)等已被證明能在病理條件下刺激成骨細胞分化并促進骨吸收[21-22]。和其他IL-6家族細胞因子不同的是，關于CLCF1在骨代謝中作用的數據甚少報道。本研究結果表明，抑制CLCF1基因表達，會引起RANKL/OPG比值失調。因此，筆者推測，CLCFI基因可能通過調節B細胞RANKL/OPG的平衡，從而在骨免疫和骨代謝中發揮重要作用。

CLCF1也參與JAK/STAT級聯反應的調節。Mukut Sharma等[23]的研究表明，CLCF1誘導的STAT3磷酸化。CLCF1作為潛在循環因子，促進腎小球足細胞中的JAK/STAT信號通路，在人類腎臟疾病局灶節段性腎小球硬化(FSGS)發生發展過程中發揮作用[24]。JAK2/STAT3通路在骨質疏松癥的發生和發展中起著重要作用。最近的研究[25-26]表明JAK2/STAT3通路能調節RANKL水平并增強破骨細胞的分化。此外，本研究結果表明，CLCF1基因敲除后，抑制了JAK2/STAT3通路的激活。提示CLCF1可能通過JAK2/STAT3調控RANKL/OPG的表達，進而影響骨代謝，這一點有待于后續深入的研究。

綜上所述，本研究結果顯示CLCF1可能是骨免疫調控基因，通過調控B淋巴細胞，影響OPG的生成，繼而影響RANKL/OPG的平衡和成骨分化，參與骨代謝過程。這些結果為免疫-骨骼相互作用的機制提供了新的理解，并為CLCF1作為病理性骨丟失的創新治療靶點提供了前景。