異補骨脂素改善骨質疏松大鼠骨代謝的作用探討

尚延春 張海英 柴巍巍

河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院),河南 鄭州 450000

骨質疏松癥是常見的內分泌疾病，可增加全身骨折的風險。據統計[1]，我國50歲以上居民的骨質疏松癥發病率已高達19.2 %，且呈上升趨勢。目前治療骨質疏松癥的常用藥物有雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素等[2]，雖有一定作用但副作用大，仍需優化。異補骨脂素是補骨脂的重要成分，被證實具有抗骨質疏松作用[3]。有實驗證實[4]，核心結合因子α1(core binding factor α 1，Runx 2)/人基質金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP13)信號通路可參與骨質疏松大鼠骨組織破壞病變。但是異補骨脂素是否能通過上述信號通路途徑治療骨質疏松癥尚未可知。鑒于此，本研究將設計進行大鼠對照試驗以探討上述問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：50只SD大鼠，均為雌性，7周齡，180～220 g，平均(205.42±10.12)g，SPF級，均購自河南省實驗動物中心，合格證號：SCXK(豫)20180001。

1.1.2實驗藥物：異補骨脂素干粉，購自上海純優生物科技有限公司，純度≥98 %。

1.1.3試劑與儀器：維酸鉀購自博士德生物工程有限公司；血鈣甲基百里酚藍(methyl thymol blue，MTB)法檢測試劑盒、血磷鉬酸法測定試劑盒、血清骨鈣素(bone gla protein，BGP)、尿膠原砒啶交聯N末端肽(N-terminal telopeptides of typeⅠcollagen，NTX)、酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自美國OXTEX公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、脫氧核苷酸(deoxynucleotide，DNA)提取試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒均購自美國Bio-Rad公司；兔抗鼠Runx 2、MMP13單克隆抗體、山羊抗兔Runx 2、MMP13多克隆抗體均購自美國Invitrogen 公司；Runx 2、MMP13及內參(β-actin)均由深圳晶美生物科技公司設計合成。DPX型雙能X射線骨密度儀購自Lunar公司；UH4150型紫外/可見分光光度計購自天美(中國)科學儀器有限公司；7600型全自動生化分析儀購自日本ATACH公司；BX53型光學顯微鏡購自日本Olympus公司；9700型聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1建模、分組與干預：將50只SD大鼠采用隨機數字表分為為5組：正常對照組、模型空白組、異補骨脂素低濃度組、異補骨脂素中濃度組、異補骨脂素高濃度組，每組10只。除正常對照組外，均采用維甲酸灌胃建立骨質疏松癥大鼠模型：取維酸鉀和1 %羧甲基纖維素鈉，混合均勻并配置成終濃度為含7 %維酸鉀的混懸液，1 mL/100 g灌胃，每天1次，持續2周[5]。與此同時，正常對照組大鼠每天灌胃1 %羧甲基纖維素鈉+蒸餾水，共2 mL，每天1次。建模成功后，異補骨脂素低濃度組、異補骨脂素中濃度組、異補骨脂素高濃度組分別給予25、50、100 mg/kg異補骨脂素(溶于2 mL生理鹽水中)灌胃，正常對照組和模型空白組給予2 mL生理鹽水灌胃，每天1次，每周停用1 d，持續3個月。

1.2.2骨密度檢測：分別于治療前后采用雙能X射線骨密度儀檢測大鼠股骨近端、L4～6腰椎骨骨密度，取平均值。

1.2.3骨代謝檢測：分別于治療后取大鼠尾靜脈血3 mL檢測骨代謝指標，其中血鈣、血磷分別采用MTB法、鉬酸法測得；BGP和NTX均采用ELISA法檢測。

1.2.4骨結構變化檢測：治療后將實驗大鼠斷頭處死，取股骨干骺端組織1 mm3。常規脫鈣、切片、脫蠟、水化，給予蘇木精染色。以鹽酸酒精分化，以氨水返藍，持續5 s后以自來水沖洗1 min。伊紅染色，梯度濃度乙醇脫水，固定封片后鏡檢。

1.2.5骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA檢測：取股骨干骺端組織常規提取總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，測定其濃度與純度。Runx 2上游引物：5’-ACTGATCGTTGCTAGCTAGGCT-3’，下游引物：5’-CTGACTGCTAGCTAGTTTGATC-3’；MMP13上游引物：5’-CTCGATCGATAAACTAGCTGGA-3’，下游引物：5’-CCGGATCGATGGTTCAGTAGTT-3’；β-actin上游引物：5’-TTAAACTAGCTAGTTTAGCTAA-3’，下游引物：5’-CTCTCGATCAGTCTAGTCATGG-3’。PCR反應：94 ℃(5 min)→94 ℃(40 s)→51 ℃(40 s)→72 ℃(1 min)，35個循環，72 ℃(10 min)。分析目的基因的相對表達強度。

1.2.6骨組織Runx 2、MMP 13蛋白表達檢測：取股骨干骺端組織BCA蛋白定量，上樣。電泳分離并轉膜，洗膜后以脫脂牛奶封閉10 min。加入一抗，4 ℃過夜；洗脫后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，漂洗。染膜，暗室內曝光，分析目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，計量資料組間比較采用單因素方差分析(F檢驗)，每兩組間比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異補骨脂素對骨質疏松癥大鼠骨密度的影響

建模和干預期間正常對照組、模型空白組、異補骨脂素低濃度組、異補骨脂素中濃度組、異補骨脂素高濃度組分別有1、3、2、2、1只死亡，多死于灌胃時不慎穿破食道，有2只大鼠死亡原因未明。治療前后采用雙能X線骨密度儀測量骨密度，正常對照組骨密度均無明顯變化(P<0.05)，余四組骨密度均下降(P<0.05)。治療后與正常對照組比較，其余四組骨密度均下降(P<0.05)；與模型空白組比較，異補骨脂素三個濃度組的骨密度均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴。見表1。

表1 異補骨脂素對骨質疏松癥大鼠骨密度的影響Table 1 Effect on bone mineral density in rats with osteoporosis

2.2 異補骨脂素對骨質疏松癥大鼠骨代謝的影響

分別采用MTB法、鉬酸法、ELISA測定治療后各組大鼠的骨代謝。與正常對照組比較，模型空白組血鈣無明顯變化(P>0.05)，異補骨脂素三個濃度組的血鈣均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴；各組血磷均相近(P>0.05)；與正常對照組比較，其余四組BGP均下降(P<0.05)，NTX均升高(P<0.05)；與模型空白組比較，異補骨脂素三個濃度組的BGP均升高(P<0.05)，NTX均下降(P<0.05)，且呈濃度依賴。見表2。

表2 異補骨脂素對骨質疏松癥大鼠骨代謝的影響Table 2 The effects on bone metabolism in rats with osteoporosis

2.3 異補骨脂素對骨質疏松癥大鼠骨結構的影響

通過HE染色觀察骨質疏松癥大鼠的骨結構，正常對照組可見骨小梁形態結構完整，髓腔相對小，且腔內造血細胞豐富；模型空白組骨小梁數目顯著減少，形態結構破壞嚴重，骨髓腔內造血細胞數量顯著減少，脂肪細胞顯著增多；異補骨脂素低濃度組骨小梁數目明顯減少，形態結構破壞明顯，骨髓腔內造血細胞數量明顯減少，脂肪細胞明顯增多；異補骨脂素中濃度組骨小梁數目減少，形態結構遭破壞，骨髓腔內造血細胞數量減少，脂肪細胞增多；異補骨脂素高濃度組骨小梁數目輕微減少，形態結構輕微受損，骨髓腔內造血細胞數量輕微減少，可見少量脂肪細胞。見圖1。

圖1 骨質疏松大鼠骨結構HE染色(×50)注：A：正常對照組；B：模型空白組；C：異補骨脂素低濃度組；D：異補骨脂素中濃度組；E：異補骨脂素高濃度組。Fig.1 HE staining of bone structure in osteoporotic rats (×50)

2.4 異補骨脂素對骨質疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA表達的影響

采用qRT-PCR方法檢測骨質疏松癥大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA表達。與正常對照組比較，其余四組Runx 2 mRNA表達水平均下降(P<0.05)，與模型空白組比較，異補骨脂素三個濃度組的Runx 2 mRNA表達水平均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴；MMP13 mRNA變化趨勢正相反。見表3。

表3 異補骨脂素對骨質疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA表達的影響Table 3 Effects on the expressions of Runx 2 and MMP 13 mRNA in bone tissues of osteoporotic rats

2.5 異補骨脂素對骨質疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP13 蛋白表達的影響

采用Western blotting方法檢測骨質疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 蛋白表達。與正常對照組比較，其余四組Runx 2 蛋白表達水平均下降(P<0.05)；與模型空白組比較，異補骨脂素三個濃度組的Runx 2 蛋白表達水平均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴；MMP 13 蛋白表達趨勢正相反。見表4和圖2。

圖2 異補骨脂素對骨質疏松大鼠骨組織Runx2、MMP13 蛋白表達的影響注：A：正常對照組；B：模型空白組；C：異補骨脂素低濃度組；D：異補骨脂素中濃度組；E：異補骨脂素高濃度組。Fig.2 Effects on the expressions of Runx2 and MMP13 proteins in bone tissues of osteoporotic rats

表4 異補骨脂素對骨質疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP13 蛋白表達的影響Table 4 Effects on the expressions of Runx 2 and MMP13 proteins in bone tissues of osteoporotic rats

3 討論

補骨脂中含有豐富的異補骨脂素，在既往的大鼠實驗研究[6]中證實補骨脂注射液可促進成骨細胞的增殖，抑制成骨細胞的凋亡。該藥物還可促進體外培養的骨髓間充質干細胞的增殖與分化，并且還可促進BGP的分泌，減少鈣鹽沉積，證實異補骨脂素是抗骨質疏松的有效成分[7]。本次研究采用維甲酸與1 %羧甲基纖維素鈉混合灌胃建立骨質疏松癥大鼠模型，相較于常規去卵巢造模方法可減輕對大鼠造成的傷害，符合實驗動物福利原則，與劉穎等[8]報道的造模方法一致。但有研究[9]認為，該方法建模成功率不理想，可能是由于維酸鉀與1 %羧甲基纖維素鈉混合灌胃對骨吸收和骨形成的影響不顯著，作用緩慢。本研究發現治療后異補骨脂素三個濃度組的骨密度和骨代謝均顯著改善，作用效果呈濃度依賴性。

Runx 2是轉錄因子Runxx家族的重要成員之一，是一種特異性轉錄因子，可參與骨組織的形成和重建。Runx 2決定著多能干細胞向成骨細胞的分化，并且還可促進軟骨的血管化，加快軟骨細胞的成熟，與破骨細胞與細胞外基質的形成也密切相關[10-11]。MMP13是靶向軟骨降解的主要酶，主要局限于結締組織，具有特異性切割II型膠原作用，在骨骼發育和軟骨重建中均有參與[12]。有報道發現[13-14]，通過調控骨組織Runx 2/MMP13信號通路的基因與蛋白表達可促進骨細胞的增殖，誘導其向成骨細胞分化，改善骨代謝和骨微結構，是骨質疏松癥臨床治療研究的新靶點。本研究推測異補骨脂素可對骨組織Runx 2/MMP13信號通路產生調控作用，對骨代謝的調控作用、骨結構的保護作用很可能均通過此途徑實現。

本研究中異補骨脂素三個濃度組的骨結構破壞減輕，可見異補骨脂素可減輕骨質疏松癥大鼠的骨結構破壞，且呈濃度依賴性。此外，異補骨脂素三個濃度組的骨組織Runx 2 mRNA及蛋白表達均高于模型空白組，MMP13 mRNA與蛋白表達均低于模型空白組，推測異補骨脂素可調控骨質疏松大鼠骨組織Runx 2/MMP13信號通路，促進Runx 2基因及蛋白表達，抑制MMP13基因及蛋白表達，從而實現骨保護作用。Jian Wang等[15]研究發現異補骨脂素對骨質疏松癥大鼠模型療效理想，且發現該藥物可減輕其氧化應激反應；Ge L等[16]指出異補骨脂素可通過激活成骨細胞的生物學活性改善骨代謝，也證實該藥物在骨質疏松癥治療方面有良好的應用前景。

綜上所述，在骨質疏松癥大鼠中采用異補骨脂素治療可提高大鼠的骨密度，改善骨代謝，并且可上調Runx 2 mRNA及蛋白表達、下調MMP13 mRNA及蛋白表達。