辛伐他汀聯合雷奈酸鍶對成骨細胞及破骨細胞生物學特性的影響

胡文雄 蔣家正 李華

海南西部中心醫院，海南 儋州 571799

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種進行性全身性骨骼疾病，其特征是骨量降低和骨微結構發生改變，在絕經后婦女中非常常見[1]。由于雌激素水平和卵巢功能降低，導致成骨細胞形成和破骨細胞吸收之間失衡，引發骨脆性增加和易于骨折[2]。因此，開發有效和安全的PMOP治療藥物已成為當務之急。雷奈酸鍶(strontium ranelate，SR)在歐洲國家被廣泛用于治療絕經后婦女的骨質疏松癥。眾所周知，SR通過增加骨形成和減少骨吸收[3-4]，可以降低椎體和髖部骨折的風險，從而對骨產生合成代謝作用[5-6]。辛伐他汀(simvastatin，SIM)具有降血脂作用，用于治療心血管疾病。近年來，藥學領域一直致力于研究和發現SIM的新作用。已經發現SIM具有促進成骨和抑制破骨作用，且可以顯著提高骨組織中BMP-2的表達，這些結果提示SIM可能用于治療骨質疏松癥[7-8]。鑒于SIM以及SR促進成骨和抑制破骨的效果，本研究通過使用SIM以及SR干預成骨細胞和破骨細胞活性的影響，以探索兩者聯合使用治療骨質疏松癥的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

30只12周齡雌性SD大鼠由上海實驗中心提供；辛伐他汀、雷奈酸鍶和α-MEM培養基購自GIBCO BRL(Grand Island，NY，USA)；用于基礎培養的α-MEM購自HyClone；胎牛血清(FBS)購自GIBCO(目錄號：16400-044)；核因子-B配體的人重組受體活化劑(RANKL，cat：400-30，批號：0209437)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF，cat：400-28，批號0310418)購自PeproTech；二抗購自中國北京夏思生物技術有限公司(Pro-spec，cat：SV30010)；針對GSK3β(Ab-9;cat：A7098)、GSK3(cat：B7098)、AKT(Ab-124;cat：B0407)、AKT(磷酸化Ser473;cat：A7005)、基質金屬蛋白酶14(cat：CO266)的抗體β-catenin(Ab-33/37;cat：B7022-1)和β-連環蛋白(phospho-Ser33 cat：A7022)購自Assay Biotech；二抗(目錄號：Abmart M21001 L，目錄號：HA1001)購自Assay Biotech；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所(A059-2)。

1.2 方法

1.2.1成骨細胞和破骨細胞的培養:原代成骨細胞來源于出生24 h的乳鼠顱骨，用PBS洗滌。解剖出顱骨后，用含有青霉素/鏈霉素(PS)的冷PBS溶液洗骨骼2～3次。使用牙鉆取出長度、寬度和厚度均為1 mm的骨碎片；將骨樣品放置在充滿0.1 %胰蛋白酶的離心管中，放置在搖水浴(120 次/min)中20 min。然后，將顱骨放入50 mL離心管中，用0.2 %的膠原酶在37 ℃搖動水浴(120圈/min)中孵育兩次共60 min。通過添加生長介質和反復移液終止反應，并使用濾網去除骨碎片。收集濾液，在1 200g離心，4 ℃下離心8 min，然后丟棄上清液。細胞在含10 %胎牛血清和1 % PS(2 mL/孔)的α-MEM中復蘇，在37 ℃下用5 % CO2孵育2 d，每3天更換一次培養基[9]。獲取5周齡雄性SD大鼠的股骨和脛骨，中間截斷股骨和脛骨髓腔使用培養液洗滌。使用大鼠骨髓來源的巨噬細胞的原代培養物誘導形成破骨細胞。將細胞放置于含10 %FBS和1 %PS的α-MEM中培養24 h，培養環境為5 %CO2和37 ℃。然后將非粘附細胞轉移到含有M-CSF(25 ng/mL)+ RANKL(50 ng/mL)的α-MEM中培養以觀察破骨細胞的形成[10]。

1.2.2茜素紅染色:為了檢查成骨細胞的基質礦化，將細胞放置于含有50 μg/ mL維生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸鹽的成骨細胞誘導培養基中。隨后一列孔加入 5 mmol /L的 SR (SR組)，一列 孔 加 入5 mmol /L的 SIM(SIM組)，一列孔同時加入2.5 mmol /L的SIM和SR(SIM +SR組)，一列孔不加入任何藥物為對照組。將成骨細胞培養21 d后，除去上清液，用PBS沖洗細胞3次；其中使用的SIM和SR劑量對成骨細胞及破骨細胞均未發現毒副作用。然后將細胞用95 %乙醇原位固定10 min，用蒸餾水沖洗兩次，用茜素紅染色30 min，用蒸餾水沖洗兩次，以觀察紅色礦化結節。使用分光光度計在562 nm的波長下測量所得上清液的光密度。收集對數期大鼠成骨細胞，培養72 h，然后用PBS洗滌3次。在液氮中反復冷凍并解凍后重新收集細胞。使用ALP測試試劑盒(A059-2)測量ALP活性。使用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。使用分光光度計測定各組管的吸光度。

1.2.3ALP活性和骨坑實驗:在96孔羥基磷灰石(HA)涂層板(康寧，紐約州，美國)的每孔中加入250 μL等位基因α-MEM，并在37 ℃、5 % CO2中孵育2 d；隨后，將非誘導破骨細胞前體添加到固定細胞中，并在37 ℃、5 % CO2中孵育2 d (以下在添加10 %FBS、1 % 25 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL mycillin的誘導培養基中)，隨后一列孔加入 5 mmol /L的 SR (SR組)，一列 孔 加 入5 mmol /L的 SIM(SIM 組)，一列孔同時加入2.5 mmol /L的SIM和SR(SIM +SR組)，一列孔不加入任何藥物為對照組，培養14 d。使用Media Cybernetics軟件分析圖像(Silver Spring，MD，USA)[11]。

1.2.4蛋白質印跡分析:根據Bicinchoninic Acid(BCA)試劑盒(Boster，中國武漢)提供的說明書，將細胞樣品離心后提取的上層蛋白在裝載緩沖液(30 μg/孔)中于95 ℃煮沸，持續10 min。使用12 %凝膠通過電泳分離蛋白質樣品，然后使用半干轉移系統(Millipore，Bedford，MA，USA)轉移至聚偏二氟乙烯膜。在室溫下用5 %脫脂奶粉孵育2 h后，將一抗溶液加入膜中并在4 ℃保持過夜;然后將膜用TBS-T緩沖液洗滌5次，每次10 min，并在室溫下與對應二抗溫育1 h。使用增強的化學發光凝膠成像系統來捕獲圖像用于分析。

1.3 統計學分析

所有數據均以均數±標準差表示，并使用SPSS19.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)通過單因素方差ANOVA分析。P<0.05、P<0.01或P<0.001表示比較差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成骨細胞和破骨細胞AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號通路改變

圖1顯示了單獨使用SIM或SR或用SIM聯合SR處理后成骨細胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號通路的變化。單獨給予SIM或SR后，成骨細胞中p-Akt/Akt和β-Gsk3β/Gsk3升高，p-β-catenin/β-catenin和NFATC1/β-catenin降低，在使用SIM聯合SR處理后，相同的比率趨勢變得更加明顯。相比之下，SIM或SR或SIM聯合SR處理對破骨細胞中蛋白質含量的比率有相反的影響(圖2)。這些結果表明，SIM聯合SR對成骨細胞和破骨細胞中AKT/GSK3NFATC1/β/β-catenin/NFATC1信號傳導的作用，比單獨使用兩種藥物中的任何一種都要強。

圖1 成骨細胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號傳導的Western blot結果注：a：WB檢測結果；b～e：蛋白表達定量結果。Fig.1 Western blot results of AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1 signaling in osteoblasts

圖2 破骨細胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號傳導的Western blot結果注：a：WB檢測結果；b～e：蛋白表達定量結果。Fig.2 Western blot results of AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1 signaling in osteoclasts

2.2 成骨細胞和破骨細胞功能的改變

進一步探索了在體外研究SIM聯合SR是否會影響破骨細胞的骨形成和吸收能力。此外，評估SIM、SR或SIM聯合SR對兩種細胞類型的成骨細胞礦化結節形成、破骨細胞骨吸收和功能標志物水平的影響。使用SIM、SR或SIM聯合SR處理的成骨細胞的礦化結節形成和ALP活性如圖3所示。SIM或SR均能促進成骨細胞礦化結節的形成和ALP活性。然而，SIM聯合SR顯著增加了形成的礦化結節的數量和成骨細胞的ALP活性。

圖3 茜素紅染色的礦化結節和成骨細胞ALP活性注：a：茜素紅染色的礦化結節；b:礦化相對活性；c：細胞ALP活性。Fig.3 Mineralized nodules as visualized by Alizarin red staining and ALP activity in osteoblasts

圖4顯示SIM、SR或SIM聯合SR處理對破骨細胞骨吸收能力和TRACP活性。單獨使用SIM和SR均可降低破骨細胞的骨吸收面積并抑制TRACP的活性；然而，在SIM聯合SR聯合應用后，骨吸收面積顯著降低，并且破骨細胞的TRACP活性明顯低于單獨使用SIM和SR的結果。這些體外實驗結果表明，與單獨使用SIM或SR相比，SIM和SR聯合應用能更好地促進骨形成，抑制骨吸收。

圖4 破骨細胞介導的骨吸收和TRACP活性的改變注：a：骨坑實驗結果；b:骨坑定量結果；c：細胞TRACP活性。Fig.4 Osteoclast-mediated changes in bone resorption and TRACP activity

3 討論

本研究表明SIM和SR均能抑制AKT-GSK3-β-β-catenin-NFATC1信號通路激活，SIM聯合SR效果更加。雖然SIM在常規劑量下副作用較小，但是藥物療效有劑量依耐性，特別是在長期應用中，這嚴重限制了它的臨床價值[12]，本研究中選取較低劑量的SIM，通常情況下對細胞無毒副作用[12]。SR治療骨質疏松癥雖然治療有劑量依耐性，但是較低劑量的副作用發生率更低[5-6]。目前普遍認為聯合治療策略既有效又安全。因此，本研究探討較低劑量SIM和SR聯合治療骨質疏松癥可行性，并測試該方法是否可以通過抑制akt/gsk3β/β-catenin/NFATC1途徑抑制破骨細胞活性和促進成骨細胞活性。這種方法可以與細胞水平的主動篩選概念進行比較，以確定有效的藥物組合。旨在更清楚地闡明聯合藥物治療的機制，為聯合療法治療骨質疏松癥提供理論依據，也為動態骨失衡引起的骨代謝疾病的治療奠定基礎。

研究[13]表明，Wnt信號通路在骨健康和疾病發展中起著至關重要的調節作用，它們可以為骨質疏松癥的研究和治療提供新的靶點。Wnt/β-catenin信號刺激成骨細胞增殖，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，促進成骨細胞表達Osx1，同時抑制脂肪和軟骨形成[14]。此外，Wnt通過β-catenin依賴性和β-catenin非依賴性途徑阻止成熟成骨細胞的凋亡并延長其生命周期[14]。除了對成骨細胞的影響外，Wnt/β-catenin信號還刺激護骨素的產生和分泌，以減少破骨細胞的分化[15]。最近的研究[15]還表明，破骨細胞中β-catenin的失活可以增加破骨細胞數量和骨吸收，從而減少骨量。在調節GSK3β/NFATC1的AKT信號通路中，發現抑制PI3K可以下調NFATC1的表達，影響小鼠的破骨細胞分化，從而影響骨量和骨強度[16]。這些研究表明AKT-GSK3-β-β-catenin-NFATC1信號通路在骨質疏松的治療中起著關鍵作用。

本實驗結果表明，SIM和SR單獨使用以及SIM和SR聯合使用對成骨細胞和破骨細胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信號通路的影響是一致的。此外，SIM和SR聯合的作用明顯大于單獨使用任何一種藥物。最近的研究[17]表明，成骨細胞中NFATC1表達的降低增加了成骨細胞的成骨活性，而破骨細胞中NFATC1表達的降低了這些細胞的骨吸收能力。這些觀察表明，SIM和SR聯合使用不僅促進骨形成，抑制骨吸收，而且在治療骨質疏松方面也比單獨使用這兩種化合物更有效。

本研究試圖確定SIM和SR聯合使用是否可以促進成骨細胞活性和抑制破骨細胞活性，以及其效果是否優于單獨使用這兩種藥物中的任何一種。因此，觀察了礦化結節的形成和成骨細胞的ALP活性以及破骨細胞的吸收能力和TRACP活性。SR在一定程度上增加成骨細胞的活性，但SIM與SR聯合使用時，成骨細胞的ALP活性增加更為顯著。此外，與單獨使用SIM或SR相比，礦化結晶的形成明顯增強。與單獨SIM或SR使用相比，SIM聯合SR干預更顯著降低TRACP活性，顯著減少破骨細胞介導的骨吸收。雖然SIM聯合SR的劑量是單獨使用藥物劑量的一半，但聯合使用的細胞實驗效果明顯大于單獨使用任何一種化合物的效果。

總的來說，SIM聯合SR治療是一種潛在的治療骨質疏松癥的方案，但還需要進一步行體內研究確定。