哺乳動物線粒體動力學(xué)和氧化磷酸化研究進(jìn)展

文禹粱，劉 秀，王繼卿，胡 江，羅玉柱，李少斌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，蘭州 730070)

眾所周知，線粒體是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)和擁有獨立基因組以及轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的細(xì)胞器[1-2]，可通過氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)，以滿足細(xì)胞行使功能所需能量，同時參與調(diào)節(jié)各種關(guān)鍵細(xì)胞事件，如活性氧的產(chǎn)生和封存[3]、鈣穩(wěn)態(tài)[4]、鐵平衡[5]、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞衰老[6]等。線粒體是一種高度動態(tài)的細(xì)胞器，可進(jìn)行連續(xù)循環(huán)的融合與分裂以改變線粒體形態(tài)、大小及位置，該生理過程被稱為線粒體動力學(xué)。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體可通過融合、分裂及自噬以補充、修復(fù)線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)和相關(guān)蛋白，給機(jī)體提供能量，滿足細(xì)胞能量需求并清除受損線粒體[7-8]。另外，線粒體融合與分裂相關(guān)蛋白在人、小鼠、蒼蠅、植物中都高度保守，這也說明因為該機(jī)制在生物進(jìn)化中具有重要作用才得以保留[9]。在生理狀態(tài)下，線粒體融合和分裂互相牽制，使線粒體達(dá)到某種動態(tài)平衡。該平衡一旦被打破，即線粒體融合和分裂受阻時，將導(dǎo)致線粒體功能受損，最終引發(fā)多種疾病[10]。本文將對線粒體形態(tài)和動力學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行綜述，分析相關(guān)基因和蛋白在融合、分裂以及氧化磷酸化過程中發(fā)揮的重要作用。強(qiáng)調(diào)線粒體形態(tài)和動力學(xué)的生物學(xué)意義，特別是相關(guān)基因或蛋白缺陷對細(xì)胞正常功能的影響，以期為今后線粒體的研究提供參考。

1 線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)

線粒體是一種被線粒體外膜(outer mitochondria membrane, OMM)和線粒體內(nèi)膜(inner mitochondria membrane, IMM)包裹，具有膜間隙(inter-membrane space, IMS)和基質(zhì)兩個腔室的細(xì)胞器，為不同類型細(xì)胞行使正常功能提供能量[1-2]。在生理條件下，OMM和IMM必須在一系列持續(xù)的融合和分裂中協(xié)同工作，從而在細(xì)胞內(nèi)形成一種穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)[11]。線粒體融合和分裂對內(nèi)穩(wěn)態(tài)和線粒體功能都至關(guān)重要，但每個生理過程在線粒體功能方面卻扮演著不同的角色。線粒體融合可導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)延長，ATP含量增加，以及各種線粒體活性物質(zhì)被轉(zhuǎn)移至新融合的線粒體中[12-13]。當(dāng)細(xì)胞在應(yīng)激條件下(饑餓處理或光刺激)，線粒體融合將達(dá)到最大程度，以產(chǎn)生足夠的ATP對抗應(yīng)激[14]。相對于融合，線粒體分裂則會產(chǎn)生新的、更小的線粒體，有助于細(xì)胞分裂和有絲分裂[8]。同時，分裂不僅產(chǎn)生可移動的線粒體，還產(chǎn)生能夠進(jìn)行自噬的線粒體[15]。線粒體生物發(fā)生和自噬由融合或分裂高度調(diào)控，這也突出了線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)對細(xì)胞功能的巨大影響。如表1所示，當(dāng)線粒體融合和分裂受阻時，將導(dǎo)致線粒體功能受損，最終可導(dǎo)致神經(jīng)退化型疾病、心血管疾病以及代謝型疾病等多種疾病的發(fā)生[10]。因此，對線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的研究不僅有助于了解線粒體融合和分裂調(diào)節(jié)機(jī)制，而且能夠為高原動物的逆境適應(yīng)性機(jī)理以及人類健康提供指導(dǎo)。

表1 與線粒體融合或分裂相關(guān)的常見疾病

2 線粒體動力學(xué)

2.1 線粒體融合及線粒體融合蛋白調(diào)控機(jī)制

線粒體可通過融合(fusion)和分裂(fission)使其在細(xì)胞中的位置和形態(tài)結(jié)構(gòu)(伸長、縮短、分叉、彎曲和腫脹)發(fā)生變化，以保持正常的生理功能。線粒體融合主要參與新線粒體的合成和受損線粒體的修復(fù)(mtDNA變異、膜電位下降)，當(dāng)受損線粒體與正常線粒體融合后，mtDNA將被重新整合、修復(fù)并調(diào)整膜電位至正常水平[27]。而當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)下(壓力、疾病、饑餓等)，線粒體融合將最大限度地產(chǎn)生ATP以支撐機(jī)體的能量需求[14]。截至目前，在哺乳動物中有3種GTPases蛋白與線粒體融合相關(guān)，其中，Mfn1和Mfn2調(diào)控OMM融合，OPA1調(diào)控IMM融合[28]。

線粒體融合包括OMM融合和IMM融合。OMM融合主要由功能相似的Mfn1和Mfn2介導(dǎo)(圖1)[29]。Mfn1和Mfn2都是OMM跨膜GTPases，包含氨基端GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、兩個卷曲結(jié)構(gòu)域以及一個跨膜結(jié)構(gòu)域的羧基末端等幾個保守區(qū)[30]。雖然Mfn1和Mfn2具有相似的功能，甚至在某些情況下能夠相互替代，但只有Mfn2的突變會引起顯著的生理變化，可導(dǎo)致神經(jīng)退化型疾病，如2A型腓骨肌萎縮神經(jīng)病變[12, 29]。二者在線粒體融合中發(fā)揮著不同的功能，即線粒體在缺氧情況下的伸長主要是通過Sirt1介導(dǎo)的Mfn1去乙酰化調(diào)控[31]，而Mfn2主要通過介導(dǎo)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸點的形成來調(diào)控線粒體融合[32]，而Mfn1和Mfn2功能存在差異的根本原因可能是因為Mfn1缺乏N端RAS結(jié)合域[33]。Koshiba等[34]研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)責(zé)線粒體融合的膜蛋白需要在相鄰的線粒體上介導(dǎo)融合，說明線粒體融合復(fù)合物需要在相鄰線粒體之間才能發(fā)揮作用，即每個蛋白質(zhì)的第二卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域形成同型或異型二聚體后反向平行卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，從而束縛和調(diào)節(jié)線粒體融合。因此，線粒體融合蛋白主要通過鄰近線粒體上的分子二聚體作用促進(jìn)融合，這在當(dāng)前線粒體融合機(jī)制研究中也是一個熱門領(lǐng)域。而IMM融合主要由OPA1介導(dǎo)。當(dāng)OMM融合后，OPA1負(fù)責(zé)將兩個IMM系統(tǒng)進(jìn)行連接、整合，并形成一個完整的IMM系統(tǒng)(圖1)。在線粒體中，OPA1被蛋白水解分裂成長型和短型兩個亞型，但是二者單獨并沒有任何生理活性，只有相互作用才可介導(dǎo)線粒體融合[35]。在正常生理條件下，兩種亞型的相對濃度幾乎相等，這是在IMM融合中發(fā)揮合適功能所必需的[36]。

線粒體融合蛋白1/2(Mfn1/Mfn2)相互作用介導(dǎo)線粒體外膜融合，視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜融合

線粒體融合與細(xì)胞生理功能息息相關(guān)，融合可將線粒體蛋白質(zhì)和mtDNA轉(zhuǎn)移至新合成的線粒體，這有助于防止受損線粒體mtDNA的積累[37]。而線粒體融合速率會受線粒體理化特性的影響，如線粒體膜電位的改變。Little等[38]在對處于G1期的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行高/低代謝，以改變細(xì)胞線粒體膜電位的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著線粒體膜電位升高，OXPHOS以及線粒體呼吸和融合速率也得到了相應(yīng)的提升。Mitra等[39]在大鼠腎細(xì)胞中也證實了上述觀點，在細(xì)胞從G1-S期過度時需要消耗大量的ATP以滿足細(xì)胞核酸和蛋白合成，此時，線粒體融合速率得到顯著加強(qiáng)，細(xì)胞中ATP水平遠(yuǎn)高于其他時期。但是，改變線粒體膜電位的因素有很多，比如衰老、凋亡及疾病等因素，因此，線粒體融合速率和膜電位是否存在正相關(guān)還有待于進(jìn)一步的研究。另有研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)水平也將影響線粒體融合，當(dāng)小鼠處于高脂膳食下，Mfn1、Mfn2表達(dá)顯著下降，并伴有線粒體呼吸功能紊亂，骨骼肌ATP含量下降[40]。對肥胖小鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)將被啟動，線粒體相關(guān)細(xì)胞膜(mitochondria-associated membranes, MAM)含量增加，進(jìn)而使得線粒體功能增強(qiáng)，骨骼肌ATP含量升高[41]。但當(dāng)小鼠處于嚴(yán)重饑餓狀態(tài)下，線粒體融合速率和線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將得到顯著增加，使得細(xì)胞AMP水平升高，蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)被激活。而后PKA反過來磷酸化Drp1，使得線粒體分裂速率減慢，融合速率和OXPHOS水平提升，ATP合酶高表達(dá)以維持細(xì)胞ATP供應(yīng)[42]。雖然饑餓和應(yīng)激可以產(chǎn)生更多的能量以維持細(xì)胞功能，但同時也增加了線粒體ROS產(chǎn)生和氧化損傷的風(fēng)險[43]。Tondera等[44]使用紫外線和放線菌素D刺激小鼠成纖維細(xì)胞的試驗發(fā)現(xiàn)，隨著線粒體融合增強(qiáng)，ATP含量和OXPHOS水平提升，ROS水平也顯著提升，線粒體損傷增加，功能減弱。由上可知，線粒體功能和融合速率呈線性關(guān)系，即當(dāng)融合速率達(dá)到某種臨界點時，線粒體融合速率將達(dá)到最強(qiáng)，但同時氧化損傷風(fēng)險最大。因此，研究線粒體融合在高原哺乳動物線粒體損傷最小的情況下，得到最大的能量供應(yīng)，以支撐機(jī)體抗逆境的能量需求對于高原哺乳動物的逆境適應(yīng)以及選種、引種有重大意義。

2.2 線粒體分裂

線粒體分裂在線粒體動力學(xué)中對線粒體融合起平衡作用。線粒體分裂主要存在兩種方式[46]；一種是 “由內(nèi)向外”，即線粒體內(nèi)膜先分裂，最終導(dǎo)致外膜分裂；另一種是“擠壓式”，即線粒體從分裂點向內(nèi)積壓，導(dǎo)致線粒體分裂。截至目前，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)與線粒體分裂相關(guān)的蛋白大都是GTPase家族蛋白，包括Drp1[47]、Fis1[48]、MFF[49]和Mid49/51[50]；同時還有協(xié)助Drp1調(diào)控線粒體分裂的動力蛋白2(dynamin protein 2, Dyn2/Dnm2)[51]、吞蛋白B1(endophilin B1)和蛋白互作因子1(bax-interacting factor 1, Bif-1)[52]；對線粒體分裂起重要作用的有神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)分化相關(guān)蛋白1(ganglioside-induced differentiation-associated protein 1, GDAP1)[53]、死亡相關(guān)蛋白1(death-associated protein 3, DAP3)[54]和線粒體蛋白18(mitochondria protein 18, MTP18)[55]等。任何的生理活動都會消耗能量，線粒體分裂所需能量主要由GTPases水解GTP提供，但分裂過程需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)參與，這將有助于在GTPase水解之前啟動線粒體分裂。如圖2所示，線粒體分裂首先由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體接觸部位的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對線粒體膜進(jìn)行“標(biāo)記”，使Drp1受體招募Drp1。隨后Drp1在分裂位點周圍將形成低聚體并進(jìn)一步收縮膜GTPase活性，緊縮線粒體并導(dǎo)致Dyn1/Dyn2補充，使額外的GTP水解以完成分裂過程，產(chǎn)生兩個獨立的線粒體。線粒體分裂對于細(xì)胞內(nèi)線粒體重塑和重排以及在有絲分裂后將健康mtDNA及其他活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到子細(xì)胞是至關(guān)重要的[56]。因此，線粒體分裂異常與很多疾病相關(guān)，比如阿爾茲海默癥[57]、心肌肥大[58]等。

2.2.1 線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點的作用 研究發(fā)現(xiàn)，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間存在接觸位點，且這些位點對于磷脂合成、Ca2+穩(wěn)態(tài)以及標(biāo)記分裂位點都至關(guān)重要[59]。在酵母中，接觸位點又稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體相遇結(jié)構(gòu)(endoplasmic reticulum mitochondria encounter structure, ERMES)，其參與線粒體分裂[60]，而在哺乳動物中，接觸位點的功能主要由Mfn2調(diào)節(jié)[61]。在最近的研究中，Hirabayashi等[62]發(fā)現(xiàn)，酵母ERMES蛋白PDZD8(MMM1同源物)在哺乳動物神經(jīng)元線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。線粒體雖然是動態(tài)的，但線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點的位置卻是保持相對恒定的，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[63]。有些研究者認(rèn)為，ER的作用是標(biāo)記線粒體收縮和分裂的起始位點[59]。Korobova等[64]證明，位于ER的INF2誘導(dǎo)了ER和線粒體接觸位點之間肌動蛋白的聚合，從而驅(qū)動線粒體裂變位點的收縮，這可能是因為Drp1寡聚物不能在沒有受體的情況下包裹線粒體膜并誘導(dǎo)分裂。根據(jù)細(xì)胞類型不同，線粒體直徑一般在200 nm以上，在進(jìn)一步收縮膜結(jié)構(gòu)之前，Drp1寡聚物識別并結(jié)合的線粒體膜直徑在110～130 nm，而ER收縮位點的直徑約為138～146 nm，表明ER啟動的收縮先于 Drp1寡聚體在線粒體膜收縮位點形成[59]。這也說明ER在線粒體收縮之前的啟動收縮過程中發(fā)揮著重要的作用，同時也證明了ER是標(biāo)記線粒體收縮和分裂的起始位點。

2.2.2 線粒體分裂蛋白調(diào)控機(jī)制 線粒體分裂主要受Drp1、Fis1、Dyn1/2以及MFF等相關(guān)基因和蛋白調(diào)控。Drp1主要定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，但Drp1不具有與脂質(zhì)結(jié)合的pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域，不能直接與線粒體膜結(jié)合，因此，其介導(dǎo)線粒體分裂就必須被招募至線粒體[65]。如圖2所示，線粒體蛋白必須作為Drp1受體將Drp1集結(jié)到線粒體外膜。在哺乳動物細(xì)胞中，已被鑒定的Drp1受體有Fis1、Mff以及Mid49/51[66-69]。研究發(fā)現(xiàn)，雖然三者都可以將Drp1招募到線粒體外膜，但Mff的結(jié)合效應(yīng)最強(qiáng)[66]。Drp1一旦被招募到線粒體外膜則形成一個環(huán)狀低聚物，并利用其GTPase活性進(jìn)一步收縮線粒體，但由于收縮強(qiáng)度限制不能完成分裂過程[70]。Dyn2/Dnm2已被確認(rèn)為線粒體收縮和分裂蛋白[71]，類似于Drp1，Dyn2/Dnm2分子可在膜周圍形成環(huán)狀寡聚物，隨著GTP的水解進(jìn)一步收縮線粒體并完成分裂[72]。在哺乳動物中，兩種分裂蛋白必須協(xié)同工作，缺一不可。Lee等[73]研究發(fā)現(xiàn)，Dyn2/Dnm2和Drp1兩種GTPase蛋白在線粒體分裂過程中，若其中一種蛋白被耗盡，線粒體會被拉長，并顯示出更精細(xì)的管狀網(wǎng)絡(luò)。線粒體分裂始于Drp1被激活，隨后從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，與受體結(jié)合從而啟動分裂。但分裂速率取決于Drp1結(jié)合數(shù)量和磷酸化修飾水平。例如在神經(jīng)元細(xì)胞中，Ca2+內(nèi)流通過電壓依賴性Ca2+通道導(dǎo)致線粒體運動的快速停止并誘導(dǎo)線粒體裂變，并且Ca2+通道可激活Ca2+調(diào)節(jié)依賴性蛋白激酶lalpha(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ialpha, CaMKlapha)進(jìn)而刺激Drp1絲氨酸(S600)磷酸化，使得其與Fis1的親和力增加，促進(jìn)線粒體分裂[74]。在小鼠成纖維細(xì)胞研究中同樣發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過電離輻射同樣會觸發(fā)CaMKlapha 并刺激Drp1(S616)磷酸化，從而加速分裂速率，但當(dāng)CaMKlapha活性被抑制時，Drp1(S616)磷酸化和分裂速率均被顯著抑制[75]。同時，PKA可介導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞Drp1(S637)磷酸化使其與MFF相互作用并被募集到線粒體外膜，從而使得線粒體分裂速率加快[49]。同樣，不同的營養(yǎng)狀況也將影響細(xì)胞中線粒體分裂速率和ATP含量。Molina等[76]發(fā)現(xiàn)，小鼠處于高糖高脂的營養(yǎng)狀況下時，胰島β細(xì)胞線粒體分裂速率提高，F(xiàn)is1表達(dá)下降，融合速率降低，ROS生成減少，觸發(fā)該機(jī)制可能是減少細(xì)胞ATP過度消耗，對細(xì)胞正常功能起到保護(hù)作用。Liu等[40]在小鼠骨骼肌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，與正常飼喂小鼠相比，高脂膳食小鼠骨骼肌中Fis1和Drp1表達(dá)上升，融合蛋白Mfn1/2表達(dá)下降。綜合上述觀點可知，當(dāng)機(jī)體(細(xì)胞)處于高脂水平下，線粒體ATP合成速率加快，同時也伴隨著ROS合成的增加，線粒體氧化損傷風(fēng)險也將增加。上面說到線粒體分裂會清除受損線粒體，將健康mtDNA和活性物質(zhì)傳遞給子代線粒體。因此為了維持線粒體正常功能，線粒體將增加分裂速率以清除受損線粒體，在傳遞過程中增加健康線粒體的比例，從而維持細(xì)胞能量的正常供給，滿足基本活動需求。因此，在對高原哺乳動物的研究中，應(yīng)著重從線粒體動力學(xué)和能量代謝層面出發(fā)，研究其調(diào)控機(jī)制或代謝途徑與適應(yīng)性的關(guān)系，這對于揭示高原哺乳動物對逆境、疾病或極端環(huán)境的適應(yīng)有重要意義。

線粒體分裂首先由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體接觸部位的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對線粒體膜進(jìn)行“標(biāo)記”，使得動力相關(guān)蛋白1(Drp1)受體招募Drp1。然后Drp1在分裂位點周圍形成低聚體并進(jìn)一步收縮膜GTPase活性，導(dǎo)致動力蛋白1/2(Dyn1/Dyn2)補充，使得額外的GTP水解，并完成分裂過程，產(chǎn)生兩個獨立的線粒體

3 線粒體氧化磷酸化

3.1 氧化磷酸化成員及其結(jié)構(gòu)

線粒體在真核細(xì)胞中最重要的作用無疑就是發(fā)生在線粒體內(nèi)膜的OXPHOS。截至目前，對于線粒體OXPHOS的研究多集中在對不同復(fù)合物結(jié)構(gòu)以及各個亞基之間的功能。線粒體內(nèi)膜OXPHOS系統(tǒng)由5種復(fù)合物(復(fù)合物Ⅰ-Ⅴ)組成。在哺乳動物中，除了復(fù)合物Ⅱ外其他都是多聚體，由線粒體基因組(mtDNA)和核基因組(nDNA)編碼的亞基組成。mtDNA編碼的亞基大都具有疏水性，可在靠近IMM的位置翻譯進(jìn)而使其更容易發(fā)生移位[77]。而由nDNA編碼的亞基可在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，進(jìn)入細(xì)胞器并正確指導(dǎo)OXPHOS過程中的結(jié)構(gòu)亞基[78]。如圖3所示，復(fù)合物Ⅰ-Ⅳ是多亞基酶協(xié)同工作，以創(chuàng)造一個橫跨線粒體內(nèi)膜的電化學(xué)質(zhì)子梯度，而后在F0F1ATP合酶(復(fù)合物Ⅴ)的作用下產(chǎn)生ATP。

圖3 線粒體呼吸鏈結(jié)構(gòu)組成[90, 99]

復(fù)合物Ⅰ又稱還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(nicotinamide adenine dinucleotide H+，NADH)，是呼吸鏈中最大的酶，由45個亞基組成，且大部分嵌在脂質(zhì)雙分子層，結(jié)構(gòu)呈典型的L型，肩膀部分突出到線粒體基質(zhì)中[79]。在細(xì)菌X射線試驗中發(fā)現(xiàn)了復(fù)合物Ⅰ的耦合機(jī)制[80]，即復(fù)合物Ⅰ將NADH底物結(jié)合到親水基團(tuán)的遠(yuǎn)端，并通過FMN和7個鐵硫原子團(tuán)簇一次轉(zhuǎn)移2個電子給兩個基團(tuán)的輔酶Q，隨著輔酶Q的還原可引起復(fù)合物Ⅰ構(gòu)象的變化，導(dǎo)致4個質(zhì)子通過通道跨膜移位進(jìn)入線粒體膜間隙[81]。隨著對哺乳動物復(fù)合物Ⅰ的深入研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物Ⅰ由N、Q、ND1、ND2、ND4以及ND5共6個模塊組成，在特定裝配因子的幫助下，通過5種主要的組件聚集在一起[82]。復(fù)合物Ⅱ又稱琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)，是電子進(jìn)入呼吸鏈的第二個獨立入口，由4個 nDNA編碼的亞基組成。2個親水性催化亞基為SDHA/SDH1和SDHB/SDH2，2個疏水性亞基為SDHC/SDH3和SDHD/SDH4，二者共同構(gòu)成了復(fù)合物Ⅱ膜錨著點，包含一個血紅素 b基團(tuán)和兩個輔酶Q結(jié)合位點[83-84]。雖然復(fù)合物Ⅱ本身不能產(chǎn)生質(zhì)子，對質(zhì)子梯度的形成不做貢獻(xiàn)，但是它可直接氧化琥珀酸并通過3個鐵硫原子團(tuán)簇轉(zhuǎn)移電子至輔酶Q[85]。復(fù)合物Ⅲ又稱細(xì)胞色素c氧化還原酶(cytochrome coxidoreductase, COX)，是一個由3個催化核心(MT-CYB、CYC1和UQCRFS1)和7個多余亞基緊密結(jié)合的對稱二聚體[86]，它能氧化復(fù)合物Ⅱ 接受質(zhì)子的輔酶Q，利用“Q-cycle”機(jī)制耦合兩個質(zhì)子并泵入膜間隙[87]。研究發(fā)現(xiàn)，從UQCRFS1上分離出的78個氨基酸線粒體靶向序列(mitochondria targeting sequence, MTS)是一個額外的亞基，在必要的時候需要被清除以保持復(fù)合物Ⅲ的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性[88]。MT-CYB含有兩個氧化還原電位不同的b型血紅素以及兩個輔酶Q結(jié)合位點，這就使得一個鐵硫原子團(tuán)簇可以插入UQCRFS1的C端，而后CYC1結(jié)合血紅素 c1基團(tuán)并將電子轉(zhuǎn)移至移動電子載體細(xì)胞色素c。在整個氧化還原過程中，多余的亞基并不參與催化作用，但對酶的正確組裝和穩(wěn)定性起到重要調(diào)節(jié)作用[89]。線粒體呼吸鏈的最后一種酶是復(fù)合物Ⅳ,又稱細(xì)胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase, CO)。它接受來自細(xì)胞色素c的電子，并將電子傳遞給1個氧分子，轉(zhuǎn)化為2個 水分子,并偶聯(lián)4個質(zhì)子泵送至膜間隙[90]。在哺乳動物中，復(fù)合物Ⅳ包含MT-CO1、MT-CO2以及MT-CO3在內(nèi)的13或14個亞基[91-92]。MT-CO1是最大的催化亞基，含有血紅素 a基團(tuán)和雙核血紅素 a3-CuB基團(tuán)；MT-CO2是第二個核心亞基，并占據(jù)CuA亞基催化中心；MT-CO3是第三個核心亞基，但并不直接參與催化作用；而其余的亞基雖然不參與催化反應(yīng)，但在穩(wěn)定催化核心和調(diào)節(jié)活性方面發(fā)揮重要作用[93]。復(fù)合物Ⅳ是唯一含有組織特異性和參與發(fā)育調(diào)控的OXPHOS復(fù)合物，同時作為OXPHOS限速酶調(diào)控其反應(yīng)速率[94-95]，這也反映了對細(xì)胞色素c氧化還原酶活性進(jìn)行精確調(diào)控的重要性。ATP合酶或復(fù)合物Ⅴ是轉(zhuǎn)運H+的具有兩個扇形結(jié)構(gòu)的ATP酶或F0F1-ATP酶，由15～18個亞基組成，總質(zhì)量為600 ku，利用復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ產(chǎn)生的質(zhì)子動力將ADP合成ATP[96]。它由兩個拓?fù)浜凸δ懿煌念I(lǐng)域組成，由中心軸和外圍軸連接的膜外部和面向矩陣的F1以及膜內(nèi)部的F0[97]。在所有亞基中，只有具有F0結(jié)構(gòu)域的亞基a(MT-ATP6)和A6L(MT-ATP8)是由mtDNA編碼，其他所有的亞基組件均由nDNA編碼[98]。當(dāng)質(zhì)子通過質(zhì)子泵時將做旋轉(zhuǎn)運動，從而為F1域中的ADP + Pi凝聚提供能量，進(jìn)而產(chǎn)生ATP[97]。氧化磷酸化是一個極其復(fù)雜的調(diào)控過程，目前更多的研究集中在各復(fù)合物的組裝，且各復(fù)合物亞基的結(jié)構(gòu)也相對比較清楚，但是功能還有待挖掘。在高原哺乳動物中，若能將各復(fù)合物與各亞基的調(diào)控機(jī)制與抗寒以及抗低氧等性狀聯(lián)系起來，亦或研究在各種抗逆環(huán)境中各復(fù)合物亞基的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、協(xié)調(diào)表達(dá)以及相互作用等，這對于高原動物的適應(yīng)和生存可能是重大突破。

3.2 氧化磷酸化超配合物

OXPHOS復(fù)合物之間相互作用可形成高級結(jié)構(gòu)-超配合物，如復(fù)合物Ⅳ和Ⅴ可形成二聚體和寡聚物[100]。當(dāng)線粒體膜提取物溶于洋地黃皂苷并經(jīng)藍(lán)原膠電泳分離后可清晰觀察到復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的關(guān)聯(lián)[101]。在小鼠心肌細(xì)胞線粒體中發(fā)現(xiàn)，OXPHOS復(fù)合物Ⅰ-Ⅳ存在于緊密的鄰近空間中，為線粒體中超配合物的裝配提供了直接證據(jù)[102]。研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其分子大小和亞基組成，主要的超配合物包括：Ⅲ2Ⅳ1、Ⅰ1Ⅲ2、Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1以及Ⅰ2Ⅲ2Ⅳ1-2[103]，其中超配合物Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1被稱為是 “呼吸體”，而Ⅰ2Ⅲ2Ⅳ2被認(rèn)為“大型綜合體”[104]。隨著對超配合物研究的深入，高分辨率的冷凍電鏡技術(shù)被用于揭示哺乳動物呼吸體超微結(jié)構(gòu)的研究，對于單個復(fù)合物與超配合物的作用關(guān)系和結(jié)構(gòu)特征已相對明確，但他們之間的具體功能機(jī)理尚不明晰，有待于進(jìn)一步研究[105-107]。對于呼吸體的組裝一直存在一些爭議，有研究者認(rèn)為，單個復(fù)合物在它們參與超配合物結(jié)合之前已經(jīng)完全組裝好了，如果超配合物的作用是提高電子轉(zhuǎn)移的效率，這種方式將允許配合物的動態(tài)結(jié)合和解離以適應(yīng)不同的能量需求[82, 108]。相反的是，Moreno-Lastres等[109]在研究復(fù)合物Ⅰ的組裝中發(fā)現(xiàn)，在超配合物完成組裝之前，不同復(fù)合物的亞基是共同組裝的，除非復(fù)合物Ⅱ2型亞基和復(fù)合物Ⅳ與復(fù)合物Ⅰ前體結(jié)合，否則復(fù)合物Ⅰ則沒有生物活性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不完整的復(fù)合物在攜帶不同結(jié)構(gòu)亞基和組裝因子的細(xì)胞和組織中竟組裝在一起，并參與了復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ組裝的最后一步，這也從側(cè)面說明超配合物的各個亞基是共同組裝的[110]。COX7A亞基是復(fù)合物Ⅳ融入超配體結(jié)構(gòu)的必要條件，被認(rèn)定為超配合物組裝因子[108]，然而，最近的研究表明，該蛋白對Ⅲ2Ⅳ1的形成有明顯作用，但對復(fù)合物Ⅳ進(jìn)入呼吸體沒有作用，因此，對于該蛋白在呼吸體形成中的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步確認(rèn)[111-112]。OXPHOS系統(tǒng)中各個復(fù)合物和超配合物的組裝是一個極其復(fù)雜的過程，當(dāng)組裝出現(xiàn)錯誤或者組裝過程受到干擾時，線粒體功能將顯著下降從而誘發(fā)多種疾病的發(fā)生[102]。雖然目前對復(fù)合物及超配合物的組裝研究有一定的進(jìn)展，但對于整個OXPHOS系統(tǒng)的認(rèn)知有限，所以，在該生物過程中，應(yīng)該重點研究每個復(fù)合物和超配合物的裝配過程，以及參與基本裝配和精細(xì)調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)及其確切的分子作用和相互作用機(jī)制。這將幫助我們了解OXPHOS在動物疾病和抗逆境過程中的核心代謝機(jī)制，了解核心亞基或復(fù)合物等裝配因子的突變與相關(guān)病理的關(guān)系。

4 結(jié)語與展望

從19世紀(jì)初首次被提及至今，線粒體一直都是研究熱點，這無非是因為其自身強(qiáng)大的功能-通過有氧呼吸為細(xì)胞提供源源不斷的能量。目前，對于線粒體的研究更多地集中在線粒體動力學(xué)與疾病發(fā)生的關(guān)系以及氧化磷酸化各復(fù)合物的組裝。本文總結(jié)了線粒體融合、分裂以及氧化磷酸化的作用機(jī)理，分析了其在細(xì)胞能量代謝和疾病調(diào)控中所發(fā)揮的作用。不管是在應(yīng)激或正常情況下，融合和分裂均會互相牽制以維持某種動態(tài)平衡。目前，對線粒體動力學(xué)和機(jī)制研究成果顯著，但其中仍存在一些問題：1)相鄰線粒體通過分子二聚體的融合機(jī)制尚不明確；2)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間接觸位點的形成機(jī)制問題；3)氧化磷酸化復(fù)合物在超配合或“呼吸體”中的相互作用機(jī)理尚不清楚等，若要解決上述問題還需要很大的努力。對于線粒體在哺乳動物中的研究，應(yīng)將線粒體機(jī)理與生產(chǎn)實踐聯(lián)系起來，結(jié)合遺傳、生理生化、細(xì)胞生物學(xué)以及組織形態(tài)學(xué)等手段研究哺乳動物在高/低溫、低氧、高輻射等惡劣環(huán)境下線粒體動力學(xué)和能量代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，這將有助于揭示高原哺乳動物的適應(yīng)性問題。隨著現(xiàn)代測序技術(shù)的普及，越來越多的與線粒體融合和分裂以及能量代謝的基因和蛋白被挖掘出來，應(yīng)優(yōu)化試驗設(shè)計，在大數(shù)據(jù)時代不應(yīng)一味追求“廣”，而應(yīng)兼顧“深”。在適應(yīng)性問題上，應(yīng)研究單基因或蛋白的機(jī)制問題，研究其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這對于深入挖掘基因功能，提高動物適應(yīng)能力和生產(chǎn)效率，增加動物產(chǎn)品具有重要意義。相信隨著對線粒體動力學(xué)和能量代謝研究的深入，相關(guān)科學(xué)問題會一一被解開，那將是對動物和人類健康的重大貢獻(xiàn)。