線粒體DNA在先天性免疫中的作用

宋銀娟，廖 軼，周向梅

(中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

先天性免疫系統是機體抵御病原體感染的第一道防線。先天性免疫系統的模式識別受體(pattern-recognition receptors, PRRs)可識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)，病原相關分子模式包括病原微生物的結構組分、核酸以及蛋白質等[1]。PRRs主要分為4個家族：Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)、NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)、C型凝集素受體(C-type lectin receptors, CLRs)以及RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ like receptors, RLRs)[2-3]。配體結合可激活PRRs從而激活下游的炎性復合體、干擾素調節因子(interferon regulatory factors, IRFs)、核轉錄因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)及絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)等信號，引起炎性細胞因子、趨化因子和Ⅰ型干擾素等的產生。近年來，研究表明線粒體與先天性免疫反應之間存在串擾。

線粒體是動態的、具有雙膜結構的細胞器，起源于15億～25億年前的一種古老的變形桿菌[4-6]。線粒體含有自己的遺傳物質線粒體DNA，線粒體DNA是一種小的、雙鏈的環狀分子，可以編碼13種氧化磷酸化系統必需的蛋白亞基、2個核糖體RNA以及22個轉運RNA，驅動線粒體呼吸和ATP產生[7]。線粒體在細胞中執行多種功能，是細胞的能量工廠。除產生能量外，它們在代謝中的重要作用還包括氨基酸和脂肪酸代謝以及血紅素、激素和鐵硫團簇的生物合成。此外，線粒體參與調節細胞凋亡、鈣穩態以及活性氧信號[8]。同時，線粒體被證明在宿主免疫反應中有著多種作用，如發揮信號和效應功能、促進免疫細胞激活和抗菌防御，并在細胞和組織損傷時觸發炎癥反應[9]。當受到內源性或外源性刺激時，線粒體會發生應激，釋放線粒體DAMPs，如線粒體DNA、線粒體活性氧等進入細胞質或細胞外環境[10]。線粒體DNA與細菌DNA相似，包含大量可被TLR受體識別的去甲基化CpG基序。近年來，越來越多的研究證據表明，釋放進入細胞質或細胞外的線粒體DNA可通過激活細胞分子信號通路參與不同類型的先天性免疫調節，在病原感染和炎癥性疾病中發揮關鍵的作用。因此，本文就線粒體DNA自身的獨特性、線粒體DNA如何激活先天性免疫反應以及其在病原感染和炎癥性疾病中的作用進行討論。

1 線粒體DNA的獨特性

線粒體DNA自身具有的幾個獨特特征與其在先天性免疫反應和炎癥中的作用有關。首先，每一個真核細胞中都存在成百上千的線粒體DNA，線粒體DNA的豐度以一種細胞類型特異性的方式受到細胞嚴格調控，并且當受到內源性和外源性刺激時，線粒體DNA數量會發生變化，這與核DNA形成鮮明對比[11]。例如，人的骨骼肌和心肌細胞比神經元細胞含有更多的線粒體DNA來滿足這些細胞更高的能量需求[12]。小鼠巨噬細胞在受到各種PAMPs(如脂多糖)刺激時會啟動線粒體DNA的復制，激活含吡啶結構域的Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3)的炎性小體，從而引起促炎細胞因子的分泌和引發炎癥[13]。最新的研究發現牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細胞后線粒體DNA拷貝數也會顯著增加[14]。這表明細胞線粒體DNA豐度的改變可能是一種真正的應激反應。其次，線粒體DNA除含有細菌核酸序列的殘基外，其甲基化方式也與核DNA不同，這使其看起來更像是外來的而不是自身的DNA。目前，對于線粒體DNA甲基化的精確程度(無甲基化或有一定程度的甲基化)、甲基化的本質(CpG甲基化還是N6腺嘌呤甲基化)以及負責催化甲基化的酶的種類尚未達成共識[15]。然而，雖然線粒體DNA甲基化的分子細節很重要，但無論甲基化程度是高是低、甲基化本質為何，PRRs都可能識別線粒體DNA。第三，線粒體DNA僅編碼小于1%的線粒體蛋白，約99%的線粒體蛋白都是核DNA編碼的，這些蛋白包括參與維持線粒體結構和動力學的因子、線粒體信號轉導的介質、線粒體代謝途徑的成分，甚至負責線粒體DNA復制、轉錄和翻譯的酶[16]。第四，相對于核DNA, 線粒體DNA的修復機制是有限的。線粒體缺乏核苷酸切除修復和核DNA的其他修復機制。從能量和代謝的觀點來看，同一細胞中同時存在多個野生型線粒體DNA拷貝可以耐受線粒體DNA突變[17]。然而，突變或受損的線粒體DNA仍可被細胞內的先天性免疫傳感器檢測到并激活炎癥[15]。第五，線粒體DNA轉錄和復制過程中產生的多種中間核酸種類(如雙鏈RNA、無帽mRNA以及DNA:RNA雜合體)也被證明具有免疫刺激潛力[18]。線粒體DNA的獨特性使其更容易與PRRs結合，從而激發先天性免疫反應，這也突顯了完整的線粒體膜在阻止健康細胞和組織中先天性免疫激活的重要屏障作用。線粒體作為高度敏感的細胞器，在各種類型刺激作用下極易發生應激反應，從而失去線粒體膜的完整性，使得線粒體DNA進入細胞質，被PRRs識別，最終引發先天性免疫反應。這表明線粒體DNA可能作為病理條件下啟動炎性反應的中樞環節。

另外，線粒體DNA并不是裸露存在的，而是被線粒體DNA結合蛋白[如線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)]包裝成擬核樣結構。由于線粒體DNA與呼吸復合物產生的線粒體活性氧非常接近，因此，TFAM起到保護性外殼的作用并壓縮線粒體DNA，從而保護其免受氧化損傷[19]。細胞和組織中的TFAM濃度及其與線粒體DNA結合密度可能被調控，從而實現不同的包裝模式和對線粒體DNA轉錄的精確調控[20]。此外，TFAM與其他高遷移率族蛋白類似，具有免疫調節潛能，這也同樣支持了線粒體DNA及其相關分子作為先天性免疫系統激動劑的觀點[21-22]，更為重要的是，TFAM表達以及其與線粒體DNA的結合緊密度受到細胞和組織的自主調控，表明線粒體DNA激發的先天性免疫或炎性反應不僅存在于病理過程中，而且還可能是細胞和組織主動控制的生理過程的重要環節。

2 線粒體DNA是天然免疫反應的激活劑

2004年，Collins等[23]首次報道線粒體DNA具有免疫刺激的潛能。他們發現將線粒體DNA注射到小鼠關節中會導致局部炎癥，引起關節炎。進一步的研究表明，線粒體DNA引起的炎癥依賴于線粒體DNA中氧化損傷的堿基的存在，注射相同序列但沒有氧化堿基的寡聚脫氧核苷酸則不會引起炎癥。線粒體DNA能引起有效免疫反應的觀察開辟了一個全新的研究領域。此后，許多研究證實了這些早期觀察，并表明線粒體DNA可以直接激活先天性免疫系統的PRRs以增強促炎反應[1](圖1)。

線粒體發生應激后，線粒體DNA釋放進入細胞質。去甲基化的線粒體DNA和氧化的線粒體DNA可激活TLR9及其下游信號，從而引起促炎細胞因子、中性粒細胞趨化因子以及基質金屬蛋白酶分泌，并誘導Ⅰ型干擾素反應；線粒體DNA、氧化的線粒體DNA以及線粒體DNA和線粒體RNA雜合體可激活cGAS及其下游信號，引起促炎細胞因子分泌、Ⅰ型干擾素反應以及干擾素刺激基因表達；線粒體DNA和氧化的線粒體DNA可激活NLRP3或NLRC4炎性小體，線粒體DNA可激活AIM2炎性小體，從而引起含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)活化，誘導白介素-1β和白介素-18分泌

2.1 線粒體DNA激活TLR9

Toll樣受體家族可通過識別大量不同的細菌特征進而激發先天性免疫。Toll樣受體9(toll-like receptor 9，TLR9)是第一個被證明可以識別核酸的Toll樣受體，它可識別DNA的低甲基化CpG基序[24]。TLR9主要在單核細胞、巨噬細胞、漿細胞樣樹突狀細胞和B淋巴細胞中表達。在生理狀態下，TLR9駐留在內質網中，當受到CpG DNA刺激后，TLR9轉運至內體和溶酶體，識別DNA并通過銜接蛋白髓樣分化初級反應蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88，MYD88)進行信號傳導[25]。MYD88可激活MAPKs和NF-κB以觸發炎癥反應或激活干擾素調節因子7(interferon regulatory factor 7, IRF7)以增強樹突狀細胞或其他免疫細胞中的Ⅰ型干擾素反應(圖1)。2010年，Hauser實驗室的兩項研究證明來自線粒體DNA的CpG基序可以激活TLR9信號，從而激活p38和p42-44 MAPK活性、CXC趨化因子配體8分泌以及中性粒細胞的趨化性[26-27]。此外，他們還報道在創傷患者和其他非感染性損傷患者的血漿中存在循環的線粒體DNA，這表明線粒體DNA是一種DAMPs。線粒體DNA不僅可以通過細胞外釋放機制激活TLR9，而且還可通過以細胞內部結合機制激活TLR9來促進炎癥和疾病的發生。Oka等[28]研究表明，在脫氧核糖核酸酶Ⅱ(DNase Ⅱ)缺失的小鼠心肌細胞中，線粒體DNA不能通過自噬有效降解，從而在胞內被TLR9識別，誘發心肌細胞炎性反應和擴張型心肌病。此外，氧化的線粒體DNA已被證明可誘導TLR9和IRF7依賴的干擾素α表達，從而增強漿細胞樣樹突細胞的Ⅰ型干擾素反應[29]。綜上所述，線粒體DNA釋放進入細胞質后可激活TLR9受體，引起炎性反應。在風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、高血壓、急性肝損傷和NASH等疾病的發生發展中扮演著重要的角色。

2.2 線粒體DNA與炎性小體激活

哺乳動物的炎性小體是宿主先天性免疫系統的重要組成部分。它們是一組胞質蛋白聚集物，由至少一種先天性免疫傳感器分子[如NLRP3、含CARD結構域的Nod樣受體4(nod-like receptor CARD domain containing 4,NLRC4)或黑素瘤缺失蛋白 2(absence in melanoma 2, AIM2)]和一種效應分子(即caspase-1前體)組成。傳感器分子和效應分子之間通過匹配的結構域結合，某些炎性小體不存在這樣的結構域，所以需要額外的銜接分子(如凋亡相關斑點樣蛋白)介導結合。銜接分子可連接傳感器分子和效應分子，誘導炎性小體的組裝。在病原體感染或無菌損傷后，炎性小體傳感器、銜接分子和效應分子受到刺激后會迅速組裝成一個高度有組織的、大的胞質蛋白復合物，導致caspase-1前體自我剪切和激活。活化的caspase-1可將未成熟的細胞因子[即白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和白介素-18前體]分別蛋白水解為具有生物活性的形式，從而引發炎癥[30]。

炎性小體可被外源性PAMPs以及在細胞壞死或應激時釋放的內源性DAMPs激活[31]。雖然線粒體DAMPs的釋放和線粒體動力學的改變與炎性小體的激活有關，但線粒體參與NLRP3和其他炎癥小體激活的確切機制尚不清楚[32]。

近年來，大量研究證據表明線粒體DNA是炎性小體的內源性激動劑。2010年，Nakahira等[33]的研究率先將線粒體DNA與NLRP3炎性小體激活聯系起來。該研究顯示，當小鼠骨髓源巨噬細胞經脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和ATP刺激后，線粒體DNA會釋放進入細胞質，促進NLRP3炎性小體的激活，從而使IL-1β和IL-18分泌增加。2012年，研究表明細胞凋亡過程中釋放到細胞質內的氧化線粒體DNA可與NLRP3炎性小體結合，從而使后者活化。該項研究增進了人們對線粒體DNA和NLRP3炎性小體之間相互作用的理解[34]。利用敲除TFAM基因的方法使小鼠巨噬細胞中95%以上的線粒體DNA耗盡，導致NLRP3炎性小體的激活被抑制。然而在敲除TFAM的巨噬細胞中外源轉染氧化的線粒體DNA可促進受抑制的NLRP3炎性小體的激活[13]，這表明氧化的線粒體DNA可以有效激活NLRP3炎性小體。除了NLRP3炎性小體外,線粒體DNA也可能影響其他炎性小體的激活，例如轉染線粒體DNA可直接激活NLRC4炎性小體[35]。此外，Ⅱ型糖尿病患者血漿中的線粒體DNA可觸發AIM2炎性小體依賴的caspase-1活化以及巨噬細胞中IL-1β和IL-18的分泌[36]。此外，由線粒體DNA釋放引起的相關炎性小體的激活可能參與多種疾病過程，包括動脈粥樣硬化、年齡相關性黃斑變性和某些細菌感染[35, 37]。上述研究表明，線粒體DNA作為炎性小體激動劑與疾病的致病機制有關。

雖然有明確的證據表明線粒體DNA參與炎性小體的激活，但仍有許多機制相關的問題有待研究。首先，目前線粒體DNA是如何進入細胞質的尚不清楚，這是一個主動和程序化的過程，還是一個線粒體損傷后的被動事件? 如果是主動過程，線粒體DNA的釋放是否依賴一個共同的潛在機制？抑或在很大程度上依賴于細胞內外的環境因素? 盡管有人提出Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，BAX)/Bcl-2同源拮抗劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer，BAK)依賴性線粒體外膜孔的形成和線粒體內膜向外擠出是介導細胞凋亡過程中的線粒體DNA釋放的機制[38]，但尚不清楚炎癥激活因子觸發的線粒體損傷是否利用相同的機制釋放線粒體DNA。同樣地，線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)在炎性小體激活劑誘導的線粒體DNA釋放中的作用仍存在爭議，需要進一步闡明[39]。2020年，有研究報道成孔蛋白Gasdermin D可將線粒體DNA釋放到細胞質中[40]。研究表明，細菌內毒素脂多糖可激活成孔蛋白Gasdermin D，而活化的Gasdermin D可在內皮細胞中形成線粒體孔，從而釋放線粒體DNA進入細胞質中。其次，尚不清楚是整個線粒體DNA基因組被釋放到細胞質中，還是只有小片段受損的線粒體DNA從線粒體中泄漏出來，從而激活炎性小體。第三，盡管在免疫共沉淀試驗中NLRP3和NLRC4復合物似乎與線粒體DNA或氧化的線粒體DNA結合，但NLRs本身是否可直接結合線粒體DNA還是需要其他因子尚不清楚。此外，需要進一步研究自噬或線粒體自噬通過去除受損的線粒體DNA來限制炎性小體激活的機制，以及線粒體損傷和線粒體DNA釋放與炎性小體依賴的caspase-1激活的上下游關系[41-42]。最后，還需要更多的努力來解開NLRs與線粒體的動態聯系以及這種聯系是如何特異性地激活NLRs信號通路的[43]。

2.3 線粒體DNA與Ⅰ型干擾素反應

線粒體DNA除可觸發促炎反應外，釋放進入細胞質和細胞外的線粒體DNA也可激活PRRs觸發Ⅰ型干擾素和干擾素刺激基因表達。雖然一些機制細節仍有待研究，但明確線粒體DNA作為誘導Ⅰ型干擾素的DAMPs對理解涉及線粒體應激和以Ⅰ型干擾素表達為特征的感染性和非感染性疾病的病理機制具有重要意義。在本節內容中，將討論線粒體DNA作為細胞質中或質膜上PRRs的配體，如何調節TLR9、循環GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)以及干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)介導的Ⅰ型干擾素反應。

2.3.1 細胞內線粒體DNA激活cGAS-STING信號通路 cGAS-STING信號軸是Ⅰ型干擾素對外源性和內源性DNA反應的關鍵調節通路[44]。DNA感受器cGAS可檢測細胞質DNA并生成環鳥苷一磷酸-腺苷一磷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP)，cGAMP作為第二信使激活STING。活化的STING與TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1, TBK1)結合，后者使干擾素調節因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)磷酸化，以促進其同源二聚化并易位至細胞核，從而誘導干擾素β和干擾素刺激基因的表達。一些研究小組已證明cGAS是感染細胞胞質中病毒和細菌DNA的主要傳感器[45-46]。此外，cGAS-STING信號在協調Ⅰ型干擾素和對自身DNA的炎癥反應、誘導Ⅰ型干擾素病理過程(如Aicardi Goutieres綜合征)以及調節腫瘤微環境中的炎癥反應方面發揮了重要作用[47-48]。雖然大多數cGAS內源性配體被認為來源于核DNA，但一些證據表明線粒體DNA在某些情況下也可以作為細胞內源性的cGAS配體。

2014年，研究表明在Bax/Bak介導的細胞凋亡過程中釋放的線粒體DNA可以激活cGAS-STING-IRF3信號通路，并觸發Ⅰ型干擾素反應和干擾素刺激基因表達。在caspase-9缺失或caspase-3和caspase-7缺失的情況下，線粒體DNA激活cGAS，增強Ⅰ型干擾素反應和干擾素刺激基因表達，這表明凋亡caspase級聯功能會抑制凋亡過程中細胞內在的、線粒體DNA依賴的Ⅰ型干擾素反應[49-50]。White等[50]利用免疫沉淀分析發現在Bax和Bak使線粒體外膜通透性增強后，cGAS不加區別地與線粒體DNA結合，這表明在凋亡過程中整個線粒體基因組有可能都暴露在cGAS可結合的環境中，這就引發了對有關線粒體外膜通透性增強后線粒體DNA釋放機制以及cGAS是否有可能進入線粒體內部等問題的思考。

線粒體通透性轉換孔的激活與長度達700 bp的線性線粒體DNA片段的釋放有關，因此，在某些情況下，MPTP可能在細胞凋亡或線粒體應激期間負責線粒體DNA片段的釋放[51-52]。與MPTP依賴的線粒體DNA釋放機制一致，研究表明疫苗佐劑殼聚糖刺激會引起線粒體應激、線粒體活性氧的產生和胞質DNA的積累，從而激活樹突細胞中的cGAS-STING信號傳導和Ⅰ型干擾素應答。盡管該研究未明確表明線粒體DNA是激活cGAS的配體，但通過加入環孢菌素A抑制了殼聚糖刺激誘導的Ⅰ型干擾素和干擾素刺激基因表達，環孢菌素A以前被證明可阻斷MPTP和線粒體DNA片段的釋放[53]。但是，必須謹慎解釋這些發現，因為環孢菌素A可以直接抑制PRR和NF-κB信號傳導，因此其在該研究條件下對Ⅰ型干擾素反應的調節可能與線粒體通透性的改變無關[54-55]。MPTP作為線粒體DNA釋放的直接通道的假設最近受到挑戰，需要進行更多的研究才能闡明[56]。線粒體ATP合酶似乎是MPTP的主要成分，甚至可能是實際的孔[57-58]。結合質粒R388的細菌Ⅳ型偶聯蛋白TrwB作為細菌DNA移位酶FtsK/SpoIIIE家族成員之一，是一種DNA依賴性的F1 ATP酶，參與結合過程中細菌之間的DNA轉移[59]。TrwB在結構上與線粒體F1 ATP酶相關，而且考慮到線粒體ATP合酶在MPTP形成以及MPTP在線粒體DNA釋放中的作用，有理由相信受調控的線粒體DNA釋放可能是該細胞器細菌起源的進化遺跡。未來的研究應該闡明MPTP在線粒體DNA釋放中的作用，或許更重要的是明確能被cGAS而不是其他DNA傳感器特異性識別的線粒體DNA種類。

2015年，又一項研究為線粒體DNA依賴的cGAS-STING信號通路的激活提供了證據[60]。該研究發現TFAM雜合子(TFAM+/-)小鼠的細胞和組織中的線粒體擬核形態發生了改變，推測是由于線粒體DNA包裝的改變導致干擾素刺激基因和抗病毒因子表達增加，并且對病毒感染具有明顯的抵抗能力。TFAM+/-細胞中的抗病毒因子表達的增加是由cGAS-STING-TBK1信號傳導到IRF3所驅動的，并依賴于異常的擬核結構的存在及其傳遞的應激。用雙脫氧胞嘧啶處理TFAM+/-細胞可特異性地抑制線粒體DNA復制并促進線粒體DNA消耗，顯著降低干擾素刺激基因表達和病毒抗性，這表明在此研究背景下cGAS的激活是線粒體DNA依賴性的。雖然該研究并沒有揭示線粒體DNA片段從線粒體中釋放的確切機制，但TFAM+/-細胞中線粒體的形態發生了改變，并且線粒體融合蛋白的敲除可抑制干擾素刺激基因表達，這表明線粒體形態或線粒體動力學的改變也有助于線粒體DNA的釋放。總之，該研究的發現進一步支持了線粒體應激時釋放到胞質的線粒體DNA可作為內源性cGAS配體的觀點。2019年，Aarreberg等[61]報道炎性細胞因子IL-1β可引起線粒體DNA釋放，從而激活cGAS-STING先天性免疫信號通路。該研究表明外源性IL-1β可誘導人髓樣細胞、成纖維細胞和上皮細胞中干擾素β(interferon-β, IFN-β)產生和激活干擾素信號，從而誘導一種抑制登革病毒感染的強大先天性免疫反應。這與先前關于IL-1β和IFN-β信號之間是相互抑制的研究結果是相矛盾的[62]。先前的研究報道在結核分枝桿菌感染的小鼠和巨噬細胞中，IL-1β和IFN-β信號之間存在相互平衡的機制，然而在該研究中并未考慮到線粒體DNA也可引起IFN-β的產生。上述研究說明闡明線粒體DNA 激活cGAS-STING信號通路的機制在相關病原的研究中具有關鍵作用。

2.3.2 細胞外線粒體DNA在Ⅰ型干擾素反應中的作用 除了細胞內線粒體DNA在觸發Ⅰ型干擾素反應中的作用外，從活化的中性粒細胞釋放的線粒體DNA也可參與鄰近免疫細胞上的cGAS-STING途徑或TLR9途徑[29, 63]。中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular trap, NET)的形成與細菌清除和無菌性炎癥疾病(如系統性紅斑狼瘡)有關，導致細胞死亡和中性粒細胞DNA或蛋白質復合物進入細胞外空間。NET最近被證明含有線粒體DNA，因此，增加了細胞外線粒體DNA可能參與Ⅰ型干擾素介導的系統性紅斑狼瘡患者發病機制的可能性[64]。與這一假設相一致，Lood等[63]的研究表明，含有核糖核蛋白的免疫復合物刺激中性粒細胞，可增加線粒體活性氧的生成和線粒體易位到細胞表面，以支持富含氧化的線粒體DNA的網狀物的形成。DNA的氧化程度是決定其免疫刺激潛能的關鍵因素，人外周血單核細胞和脾細胞的Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子的表達被氧化作用增強，經線粒體活性氧清除劑治療的小鼠發生類似狼瘡的疾病減少。研究發現對線粒體DNA富集的NETs的反應需要STING，而不是TLR9-MYD88，這表明cGAS在這種反應中起著至關重要的作用[65]。氧化線粒體DNA也被證明可以與漿細胞樣樹突細胞上的TLR9結合[66]。Caielli等[29]進一步指出中性粒細胞釋放的氧化線粒體DNA是漿細胞樣樹突細胞分泌TLR9依賴性干擾素α的驅動因素。他們發現由于線粒體自噬減少，中性粒細胞將線粒體DNA-TFAM復合物(以及某些特異性的線粒體組分)釋放到細胞外空間。雖然有研究表明線粒體來源的囊泡(mitochondria-derived vesicles, MDVs)通常會將氧化線粒體DNA導向溶酶體進行降解,然而在系統性紅斑狼瘡患者的中性粒細胞中，這一過程被打亂，導致氧化線粒體DNA-TFAM復合物向細胞外的釋放。然后，這些復合物激活晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycosylation end products, RAGE)和TLR9，促使漿細胞樣樹突細胞產生干擾素α，從而參與誘導系統性紅斑狼瘡的發生。雖然這些觀察結果提示了中性粒細胞特異的線粒體自噬和線粒體DNA降解機制的可能性，但是控制MDVs運輸和氧化的線粒體DNA包裝機制仍不清楚。上述研究表明，細胞外線粒體DNA在炎癥和Ⅰ型干擾素介導的系統性紅斑狼瘡以及其他自身免疫性疾病的誘導中起作用。

2.4 線粒體DNA特異性激活先天性免疫傳感器的決定因素

由于細胞中存在多種先天性免疫傳感器(如cGAS、NLRP3、AIM2或TLR9)，一個重要的問題是: 線粒體DNA從應激線粒體中逃逸后如何決定激活哪個傳感器？到目前為止，已經提出了幾個決定因素。首先，DNA長度很重要。雖然AIM2對短的DNA片段具有一定的結合活性，但最近的研究表明要脫離AIM2-DNA相互作用的“遲緩期”需要長度至少為70 bp的DNA片段，而當DNA大于250 bp時，產生穩定的AIM2-DNA復合物的效率達到最佳[67-68]。這些發現與早期的研究報道一致，即80 bp，但不是50 bp或更短的DNA能在體外誘導人外周血單核細胞產生AIM2炎性體依賴的IL-1β[69]。同樣，cGAS也更傾向于結合長DNA，而不是短DNA[70]。相比之下，NLRP3的激活似乎與DNA片段長度無關[13]。其次，線粒體DNA的氧化還原狀態似乎是決定免疫傳感器激活特異性的另一個重要因素。具體來說，已被證明轉染氧化的線粒體DNA可激活NLRP3，而非氧化的線粒體DNA與AIM2相結合。事實上，幾乎所有的NLRP3(而不是AIM2)激活劑都能誘導線粒體損傷和隨后的線粒體活性氧產生，從而促進線粒體DNA的氧化損傷[32]。第三，似乎TFAM結合的擬核結構也在某種程度上決定了線粒體DNA激活哪個免疫傳感器。例如，裸露的氧化線粒體DNA完全能夠在TFAM缺陷型巨噬細胞中誘導NLRP3炎性小體激活[13]。相反，TFAM似乎是線粒體DNA誘導的cGAS激活所必需的[21]。第四，免疫傳感器的不同亞細胞定位在確定線粒體DNA激活哪種先天性免疫傳感器方面也起著至關重要的作用。例如，TLR9位于內質網，因此需要被運輸到內體和溶酶體中才可識別線粒體DNA[71]。在巨噬細胞中，盡管AIM2被認為普遍分布于整個細胞[72]，但NLRP3存在于靜息狀態下巨噬細胞的內質網中，在NLRP3激活劑的刺激下才被轉移到內質網線粒體相關膜和內質網高爾基體接觸位點[73]。與這些炎性小體傳感器相比，cGAS之前被認為是一種胞質蛋白，但cGAS也存在于樹突狀細胞的細胞核中，它利用其非酶促的N末端結構域與著絲粒DNA結合并啟動先天性免疫反應[74]。然而，人和小鼠巨噬細胞中的cGAS駐留在細胞膜上，通過其N端磷酸肌醇結合結構域選擇性地與PI(4,5)P2結合。cGAS定位在細胞膜上被認為有助于抵抗病毒感染，但無助于檢測自我DNA。支持這一觀點的是，脂質結合有缺陷的cGAS突變體被錯誤地定位到細胞質和核腔，在基因毒性應激下可誘導一種強有力的Ⅰ型干擾素反應，但是對病毒感染表現出更弱的反應[75]。活化的caspase-1被證明可以裂解巨噬細胞中的cGAS，從而抑制DNA病毒感染小鼠后Ⅰ型干擾素的產生[76]。這表明巨噬細胞可能有一個精密的機制嚴格調控線粒體DNA等自身DNA激活cGAS的反應，以防止不可控的Ⅰ型干擾素的產生，否則可能誘發自身免疫性疾病。與上述caspase-1拮抗cGAS的作用相反，cGAS-STING通路的組分在某些情況下可能會促進炎性小體的激活。例如，STING的激活配體cGAMP被證明可以促進炎性小體的激活，從而誘導人類和小鼠的骨髓源巨噬細胞和樹突細胞產生IL-1β[77]。綜上所述，雖然線粒體DNA可激活多種先天性免疫信號通路，但其具體機制仍有待進一步探索。

由于相對于核DNA，線粒體DNA的修復機制是有限的，線粒體缺乏核苷酸切除修復和核DNA的其他修復機制，因此，線粒體DNA極易發生氧化損傷[17]。據報道，線粒體DNA的D-loop和Ori-L區域可發生不同種類的氧化損傷，如單鏈斷裂(single strand breaks, SSBs)、雙鏈斷裂(double strand breaks, DSBs)、脫堿基位點(abasic sites, AP sites)和氧化堿基(如7,8-dihydro-8-oxoguanine, 8 oxoG)[78]。氧化損傷的線粒體DNA會優先被TFAM結合[79]，TFAM結合會使線粒體DNA上形成U型結構，從而有利于被cGAS識別[21]。然而，TFAM的結合對于線粒體DNA被NLRP3識別不是所需要的[13]。同時，單鏈斷裂或雙鏈斷裂的損傷會使氧化損傷的線粒體DNA長度比非損傷線粒體DNA的長度更短，這表明氧化的線粒體DNA可能更容易被cGAS和NLRP3所識別，而不是AIM2。TLR9對于線粒體DNA的識別與線粒體DNA在細胞內的位置有關，位于內體和溶酶體中的氧化線粒體DNA或線粒體DNA可能更容易被TLR9識別。與TFAM解離的氧化線粒體DNA會被直接送到溶酶體，位于溶酶體的線粒體DNA則更容易被TLR9所識別[29]。然而，PRRs識別線粒體DNA的機制是高度復雜的，需要更多的體內和體外研究去闡釋。最新的研究報道了一種可用于線粒體DNA堿基編輯的方法[80]，細菌胞苷脫氨酶毒素DddA可實現線粒體的堿基編輯，這對于進一步研究線粒體DNA的特性和線粒體相關疾病的治療提供了新的途徑和方法。

3 線粒體DNA在病原感染中的作用

雖然線粒體被稱為細胞的能量工廠，但它也調節程序性細胞死亡途徑，并在先天性免疫系統中發揮中央樞紐的作用。線粒體可通過誘導抗病毒信號通路誘發炎癥[1]。胞質傳感器RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相關蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)識別不同的病毒RNA種類并通過線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial anti-viral signalling protein, MAVs)激活下游信號，引起Ⅰ型和Ⅲ型干擾素等細胞因子的表達，從而限制病毒復制[81]。除線粒體蛋白外，線粒體DNA也可通過cGAS-STING-IRF3信號通路誘導Ⅰ型干擾素產生，引發抗病毒免疫反應[60]。盡管cGAS是DNA特異性的模式識別受體，但感染登革熱病毒等RNA病毒也會引起cGAS-STING反應[82]。登革熱病毒感染會引起氧化的線粒體DNA釋放進入細胞質中，從而激活cGAS[83]和TLR9受體[84]，而且，登革熱病毒已進化出免疫逃逸策略，通過編碼靶向cGAS和STING降解的蛋白酶來逃避感染過程中胞質線粒體DNA誘導的cGAS信號傳導，從而確保病毒感染的持久性[85]。2019年，研究表明，甲型流感病毒M2蛋白會引起線粒體DNA以MAVs依賴的方式釋放進入細胞質，胞質線粒體DNA可被cGAS和DDX41(D-E-A-D-box polypeptide 41)識別，從而激活STING依賴的天然免疫反應，限制病毒在宿主體內的復制。然而，流感病毒的非結構蛋白1(nonstructural protein 1, NS1)也可與線粒體DNA結合以逃避STING依賴的抗病毒免疫[86]。這表明線粒體DNA可能在 RNA病毒感染中發揮著關鍵的作用。

據報道，線粒體產生的活性氧在巨噬細胞相關的抗菌免疫反應中起關鍵作用。同線粒體活性氧一樣, 線粒體DNA也參與抗菌反應。某些宿主免疫細胞(如中性粒細胞和肥大細胞)利用基于核DNA的胞外誘捕網(extracellular traps, ET)(由核DNA、組蛋白和抗菌肽等組成)捕獲并殺死微生物病原體[87]。嗜酸性粒細胞可以特異性地釋放線粒體DNA，而線粒體DNA作為胞外誘捕網的組分之一可以協助固定微生物病原體，因此，嗜酸性粒細胞可以識別并殺死微生物[88]。像中性粒細胞和肥大細胞的胞外誘捕網一樣，嗜酸性粒細胞的胞外誘捕的過程依賴于活性氧的產生，但重要的是，不會導致細胞死亡，因為在線粒體DNA被釋放后嗜酸性粒細胞仍然存活。盡管明顯缺乏吞噬活性，但嗜堿性細胞也可以通過形成含有線粒體DNA和顆粒蛋白的嗜堿性細胞胞外誘捕網殺死細菌[89]。如上所述，在嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞中，線粒體DNA在病原體誘導的細胞外誘捕網形成等抗菌免疫反應中發揮重要作用。

關于病原體感染誘導的線粒體DNA應激，已有研究表明單純皰疹病毒1(herpes simplex virus 1, HSV-1)和HSV-2感染細胞會引起線粒體DNA應激和線粒體DNA拷貝數的迅速下降。缺失靶向線粒體DNA基因的HSV-1突變株在觸發抗病毒反應和干擾素刺激基因表達方面效率較低[60, 90]，這可能說明細胞對線粒體DNA穩態的監測是一種進化上有益的機制，它與病毒核酸的典型感應相配合，充分參與抗病毒先天性免疫。然而，宿主Ⅰ型干擾素反應也可增強某些微生物(如結核分枝桿菌)的發病機制。結核分枝桿菌感染可觸發cGAS-STING信號和線粒體應激，誘導Ⅰ型干擾素和干擾素刺激基因表達，從而有利于自身存活[45,91-92]。此外，與單純皰疹病毒感染不同，牛分枝桿菌感染小鼠巨噬細胞會增加線粒體DNA的拷貝數，引起線粒體DNA釋放進入細胞質內，參與牛分枝桿菌誘導的干擾素β產生。通過siRNA干擾TFAM表達可抑制線粒體DNA拷貝數的增加，減少進入細胞質的線粒體DNA的量，從而抑制細胞內細菌存活[14]。這些結果表明，線粒體損傷和線粒體DNA釋放可能是結核分枝桿菌或牛分枝桿菌以及其他微生物用于促進cGAS激活、增加Ⅰ型干擾素反應和增強細胞內存活的一種策略。

綜上所述，線粒體DNA在不同類型病原感染中可以扮演有益或有害的雙重作用。然而，受損線粒體的異常積累和線粒體DNA泄漏到細胞質中也可能引起炎癥性疾病。

4 線粒體DNA與炎性疾病

線粒體DNA在激活炎性小體、TLR9和cGAS-STING途徑中發揮重要作用，因此線粒體DNA作為一種重要的炎癥驅動因子，促進許多人類疾病的發生發展也就不足為奇了。例如，線粒體DNA被認為是人和小鼠系統性紅斑狼瘡發病機制的關鍵因素。中性粒細胞是系統性紅斑狼瘡的關鍵致病性免疫細胞, 用含核糖核蛋白的免疫復合物刺激中性粒細胞導致相對于基線的線粒體活性氧產生增加，然后線粒體遷移到細胞表面，有助于形成富含氧化線粒體DNA的中性粒細胞胞外誘捕網。這些氧化的線粒體DNA被鄰近的免疫細胞(例如漿細胞樣樹突細胞)識別，然后誘導Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子的產生，從而促進小鼠狼瘡樣疾病的發展[29, 63]。中性粒細胞胞外誘捕網中的線粒體DNA的免疫刺激作用似乎依賴于STING和TLR9。然而，炎性小體介導的線粒體DNA識別是否也在系統性紅斑狼瘡發病機制中發揮作用還需要進一步研究。

此外，線粒體DNA還參與心血管疾病的致病進程。例如，已證明釋放的線粒體DNA可激活心肌細胞中TLR9，從而誘發心肌炎和擴張型心肌病，最終導致心力衰竭。與野生型小鼠相比，DNase II缺陷小鼠心臟炎性細胞浸潤增加，炎性細胞因子分泌過剩以及心肌自噬溶酶體中線粒體DNA沉積增加。使用TLR9抑制劑寡聚脫氧核苷酸處理或將TLR9基因敲除，可顯著減緩DNase II缺陷小鼠的心肌病的發展。這表明線粒體DNA-TLR9信號軸可能有助于該模型小鼠心肌慢性炎癥和心力衰竭的發生[28]。除誘導心力衰竭外，氧化線粒體DNA還被證明會促進動脈粥樣硬化發展。死亡細胞釋放的線粒體DNA可以與抗菌肽LL-37形成復合物。這種線粒體DNA:LL-37復合物可逃避DNase II的降解，并能激活漿細胞樣樹突細胞、中性粒細胞和內皮細胞上的TLR9受體，從而加劇動脈粥樣硬化[93]。

線粒體DNA也可驅動非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)的致病進程[94]，NASH是工業化國家最常見的肝病[95]。NASH患者和小鼠血漿中含有更高水平的氧化線粒體DNA。線粒體DNA的氧化可增加其激活TLR9的能力。血漿線粒體DNA主要存在于肝細胞來源的微顆粒(microparticles, MPs)中。從血漿中去除這些MPs導致TLR9激活的顯著降低。在小鼠中，高脂飲食引起的NASH發展需要骨髓細胞中TLR9的表達，給予TLR9拮抗劑的小鼠表現出NASH癥狀的減輕，證明線粒體DNA釋放和TLR9信號在NASH的發病機制中具有重要作用[94]。在另一項研究中，STING缺失在NASH小鼠模型中減輕了肝脂肪變性、纖維化和炎癥。高脂飲食喂養小鼠的肝細胞線粒體DNA可以誘導STING依賴的枯否氏細胞(肝巨噬細胞)激活，這表明線粒體DNA誘導的STING激活可能促進NASH的肝臟炎癥[96]。如以前的研究所述[97]，研究線粒體DNA在NASH患者中是否也能誘導炎性小體的激活將會是一個有意義的工作。

5 小 結

線粒體是多功能的細胞器，是細胞代謝和信號傳遞的關鍵樞紐，但越來越多的證據表明，線粒體作為內源性損傷相關分子模式的重要來源，參與了對病原體感染和細胞損傷的先天性免疫反應。線粒體DNA相對的低甲基化、獨特的結構特征和對氧化損傷的高度敏感性等特性，使其成為一種強有力的線粒體損傷相關分子模式，可以激活TLR9、炎性小體、cGAS和其他先天性免疫傳感器，從而觸發促炎過程和Ⅰ型干擾素反應，在病原感染和炎性疾病的發生發展中扮演著重要角色。然而，目前，關于線粒體DNA是如何釋放進入細胞質或細胞外以及其如何特異性地激活不同先天性免疫傳感器的機制尚不清楚。因此，進一步闡明線粒體DNA釋放和感應機制、異常的線粒體DNA釋放參與炎性疾病發展的機制以及線粒體DNA在病原體感染中發揮的作用，可為控制感染和相關疾病的治療干預開辟新的途徑。