小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系建立及功能鑒定

張仙玉，趙 鑫，李國(guó)玲，邢萍萍，李紫聰，楊化強(qiáng)，吳珍芳*，陳 斌

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

精子發(fā)生周期貫穿雄性的整個(gè)生命過(guò)程，從精原干細(xì)胞開始直到精子的形成，而精原干細(xì)胞(SSCs)在維持這一周期不斷交替進(jìn)行中起著至關(guān)重要的作用。它是體內(nèi)唯一能將遺傳信息傳遞給下一代的成體干細(xì)胞，被應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因育種、物種的保種及生殖疾病治療等各個(gè)研究領(lǐng)域。它的數(shù)量非常稀少，在小鼠中SSCs僅占生殖細(xì)胞的0.3%，比人類(22%)要少的多[1]。所以對(duì)它的研究均建立在體外培養(yǎng)并富集后的SSCs樣細(xì)胞基礎(chǔ)上。而目前在大動(dòng)物身上實(shí)現(xiàn)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)還很難。非嚙齒類實(shí)現(xiàn)了生殖細(xì)胞集落的第一次長(zhǎng)期培養(yǎng)并具有SSCs潛能的動(dòng)物是兔[2]。然而除了兔以外，非嚙齒類其他動(dòng)物SSCs長(zhǎng)期培養(yǎng)體系的開發(fā)尚未成功，家畜的SSCs長(zhǎng)期培養(yǎng)仍處于起步階段[3]。到目前為止，人類SSCs的體外培養(yǎng)似乎并沒(méi)有找到維持和增殖的最佳條件[4-5]。事實(shí)上，即使是小鼠的生殖系干細(xì)胞(germline stem, GS)培養(yǎng)基的配方也還沒(méi)有得到優(yōu)化[6]。甚至不同品系的小鼠其SSCs體外培養(yǎng)效果也不同[7]。由此可見，目前，精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)還存在很多局限，一方面在于SSCs的來(lái)源，不同物種來(lái)源的SSCs其體外培養(yǎng)的難易程度不同。總體來(lái)說(shuō)，嚙齒類動(dòng)物SSCs體外培養(yǎng)的難度要小，大動(dòng)物及人類SSCs體外培養(yǎng)的難度大，這可能與睪丸微籠環(huán)境中調(diào)控精原干細(xì)胞增殖和分化關(guān)鍵因子的確定有關(guān)，大動(dòng)物上有待尋找到這些關(guān)鍵因子。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，嚙齒類動(dòng)物SSCs體外培養(yǎng)的效果與收獲的SSCs是何種品系來(lái)源有關(guān)，雜交品系B6D2F2體外培養(yǎng)效果沒(méi)有近交品系C57BL/6 J明顯，可能是由于睪丸微籠環(huán)境中體細(xì)胞對(duì)SSCs調(diào)控的影響[8-9]。另一方面在于飼養(yǎng)層和培養(yǎng)體系，為了對(duì)分離純化的精原干細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，使用適宜的培養(yǎng)基(如DMEM、DMEM/F12、StemPro34等)，添加合適的生長(zhǎng)因子(如GDNF、LIF、bFGF、IGF1、EGF等)，取舍胎牛血清以及飼養(yǎng)層細(xì)胞(如STO(SIM mouse embryo-derived thioguanine and ouabain resistant)或mEF)似乎是必要的[10-12]。很多體外培養(yǎng)成功的報(bào)道是基于標(biāo)志蛋白的檢測(cè)，如SSCs陽(yáng)性標(biāo)記GDNF家族受體α-1(GDNF family receptor alpha-1, GFRA1)、泛素羧基末端水解酶-1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1, UCHL1)、早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白(promyelocyte leukemia zinc-finger factor, PLZF)、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RET)、B細(xì)胞/淋巴瘤6B(B cell CLL/lymphoma 6B, BCL6B)、分化抑制劑4(inhibitor of differentiation 4, ID4)、B細(xì)胞特異性小鼠白血病病毒整合位點(diǎn)1(B cell-specific moloney murine leukemia virus integration site1, BMI1)等[13-19]，陰性標(biāo)記如v-kit細(xì)胞同源(cellular homolog of v-kit, C-KIT)、染色體結(jié)構(gòu)維持6(structural maintenance of chromosomes 6, SMC6)、DEAD 盒多肽4(DEAD box polypeptide 4, DDX4, also known VASA)等[20-22]。這些蛋白都有助于區(qū)分SSCs，但是值得注意的是，標(biāo)志蛋白通常鑒定到的是未分化的精原細(xì)胞，并不是特定于SSCs。表達(dá)這些標(biāo)志物的細(xì)胞移植后是否還能形成增殖的細(xì)胞集落，將是體外培養(yǎng)后需要解答的首要問(wèn)題[23]。事實(shí)上，只有1%～2%的培養(yǎng)物細(xì)胞在移植后還能產(chǎn)生集落[24]。由于目前還沒(méi)有特定的SSCs標(biāo)志基因，生殖細(xì)胞移植被認(rèn)為是鑒定體外培養(yǎng)SSCs樣細(xì)胞功能的金標(biāo)準(zhǔn)。

本研究通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件和體系進(jìn)行優(yōu)化，在體外實(shí)現(xiàn)ICR小鼠SSCs的穩(wěn)定培養(yǎng)，并通過(guò)移植驗(yàn)證SSCs的生物學(xué)功能。這可為別的品系小鼠SSCs體外培養(yǎng)提供重要參考。另外，來(lái)自不同物種SSCs的特性是相似的，大動(dòng)物乃至人類精原干細(xì)胞的培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)都是從嚙齒類動(dòng)物的培養(yǎng)中借鑒而來(lái)，本研究也可為大動(dòng)物及人類SSCs的體外培養(yǎng)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

ICR乳鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(mEF)、內(nèi)源性生殖細(xì)胞消融的受體小鼠均為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心提供；StemPro-34無(wú)血清培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品；重組人白血病抑制因子(LIF)為Millipore產(chǎn)品；重組大鼠膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)為RD產(chǎn)品；重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF1)、小鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF)均為Novus產(chǎn)品；泛素羧基末端水解酶-1(UCHL1)小鼠單克隆抗體為Proteinech產(chǎn)品；早幼粒細(xì)胞白血病鋅指因子(PLZF)小鼠單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；Anti-Mouse IgG(Alexa Flour 488)為CST產(chǎn)品；慢病毒顆粒細(xì)胞感染(LPP-EGFP-Lv156-400)試劑盒為廣州易錦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 小鼠睪丸細(xì)胞的分離

取6～8日齡新生ICR乳鼠的睪丸，用兩步酶消化法進(jìn)行消化，即先用膠原酶IV(工作液濃度為1 mg·mL-1)和DNAse I(工作液濃度為20 U·mL-1)37 ℃消化10 min，使曲細(xì)精管分散；再用0.25%胰蛋白酶和DNAse I(20 U·mL-1)繼續(xù)37 ℃消化5 min，使曲細(xì)精管充分消化，睪丸單細(xì)胞形成。用40 μm孔徑的尼龍細(xì)胞篩過(guò)濾單細(xì)胞懸液。濾液用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)睪丸單細(xì)胞活力。

1.3 小鼠SSCs的純化

將上述得到的睪丸單細(xì)胞懸液進(jìn)行5次差速貼壁處理，即將睪丸單細(xì)胞懸液接種在一個(gè)6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 h收集尚未貼壁的細(xì)胞懸液，重新接入一個(gè)新的6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。如此重復(fù)操作，至最后一次差速貼壁完，將收集到的未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)入一個(gè)新的6 cm培養(yǎng)皿中繼續(xù)過(guò)夜培養(yǎng)。第2天，收集到的未貼壁的細(xì)胞懸液即為純化后的SSCs細(xì)胞。

1.4 飼養(yǎng)層的制備

F3代的mEF細(xì)胞培養(yǎng)到95%匯合時(shí)，加絲裂霉素C溶液進(jìn)行處理。設(shè)置4個(gè)濃度梯度，DMEM/F12培養(yǎng)基中絲裂霉素C的含量分別為0、10、20、30 μg·mL-1。各組于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5 h后進(jìn)行換液，換為正常的完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)。第2天用96孔 板進(jìn)行傳代。設(shè)置了3個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，分別是傳代培養(yǎng)后第1、3、5天，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，確定最佳處理濃度，并將用它處理之后的mEF作為SSCs飼養(yǎng)層。另外，用多聚賴氨酸(polylysine, PLL)和層粘連蛋白(laminin)聯(lián)合鋪板(PLL-L)用于體外SSCs的培養(yǎng)，即加多聚賴氨酸溶液到一個(gè)6 cm培養(yǎng)板上，將板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后倒掉孵育液，加入層粘連蛋白工作液，繼續(xù)孵育1 h后倒掉孵育液，將板放在培養(yǎng)箱中備用。

1.5 用不同的體系來(lái)培養(yǎng)小鼠SSCs細(xì)胞

分別用DMEM/F12和StemPro-34作為培養(yǎng)基，兩種培養(yǎng)基中均加入2%的血清替代物B27和1%的谷氨酰胺來(lái)培養(yǎng)SSCs，并在培養(yǎng)后24 h觀察SSCs的增殖情況，以此來(lái)評(píng)估兩種培養(yǎng)基對(duì)SSCs體外培養(yǎng)的效果。用StemPro-34(添加B27和谷氨酰胺)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同的生長(zhǎng)因子：20 ng·mL-1GDNF、10 ng·mL-1LIF、10 ng·mL-1EGF、10 ng·mL-1bFGF、10 ng·mL-1IGF1，在SSCs體外培養(yǎng)4 d后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，來(lái)評(píng)估生長(zhǎng)因子的添加效果。

1.6 小鼠SSCs體外增殖的免疫法檢測(cè)

收集飼養(yǎng)層上增殖的SSCs，用4%多聚甲醛溶液固定后，按照AKP顯色試劑盒說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行免疫顯色，顯微鏡下觀察SSCs細(xì)胞狀態(tài)。同樣，對(duì)多聚甲醛溶液固定后的SSCs分別進(jìn)行通透化處理、封閉、一抗孵育(PLZF和UCHL-1抗體均用一抗稀釋液1∶200進(jìn)行稀釋)、二抗孵育、Hochest33342細(xì)胞核復(fù)染，最后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況。

1.7 小鼠SSCs體外增殖的分子檢測(cè)

收集飼養(yǎng)層上增殖的SSCs，按照Eastep?Super總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取RNA。按照TaKaRa說(shuō)明書進(jìn)行cDNA的合成。以合成的cDNA 為模板，以β-actin為內(nèi)參基因，對(duì)培養(yǎng)的SSCs的自我更新基因及生殖標(biāo)志基因等進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)基因及引物序列見表1。同時(shí)，以培養(yǎng)前的SSCs為對(duì)照，實(shí)時(shí)定量分析培養(yǎng)后的SSCs中多能基因SOX2和自我更新基因C-RET、GFRA1、UCHL1、BCL6B的表達(dá)水平。每個(gè)樣品3個(gè) 重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT方法計(jì)算。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR(qRT-PCR)引物

1.8 小鼠SSCs的傳代與凍存

當(dāng)SSCs克隆團(tuán)增殖到一定的密度或者克隆團(tuán)長(zhǎng)勢(shì)異常時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。首先，進(jìn)行換液，隨后，擰緊細(xì)胞培養(yǎng)瓶的瓶蓋，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察克隆團(tuán)是否脫離飼養(yǎng)層。然后，將尚未脫離下來(lái)的團(tuán)塊，用槍頭輕輕地反復(fù)吹打，顯微鏡下觀察是否吹打干凈。最后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的接種了飼養(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每培養(yǎng)1周左右進(jìn)行再次傳代。也可以根據(jù)需要按照常規(guī)的細(xì)胞凍存方法對(duì)SSCs進(jìn)行凍存處理。

1.9 小鼠SSCs生物學(xué)功能的檢測(cè)

在SSCs傳代至第6代時(shí)，收集飼養(yǎng)層上的SSCs，用慢病毒感染使其帶有EGFP報(bào)告基因。首先，輕輕吹散克隆團(tuán)細(xì)胞，在1 mL(細(xì)胞數(shù)約為2.5×104)細(xì)胞懸液中加入10 μL慢病毒包裝載體(1×108TU·mL-1)，用槍頭輕輕混勻。接著，將混合溶液轉(zhuǎn)移到12孔板的一個(gè)孔，孔里有層粘連蛋白與多聚賴氨酸的聯(lián)合鋪板，可短時(shí)期內(nèi)支持SSCs的貼壁生長(zhǎng)。然后，將培養(yǎng)板放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。孵育結(jié)束后，丟棄孵育液，加DPBS洗滌細(xì)胞，并用槍頭在DPBS中輕輕吹打，直到所有細(xì)胞漂浮。收集懸浮液到15 mL離心管中，300 g離心5 min。離心結(jié)束丟棄上清，用HBSS溶液200 μL重懸細(xì)胞。移植細(xì)胞懸液到ETV5基因敲除后內(nèi)源性生殖細(xì)胞消融的受體小鼠睪丸中。移植后2個(gè)月采集附睪，觀察精子的形成及檢測(cè)精子來(lái)源。

1.10 小鼠睪丸組織的蘇木素伊紅染色和免疫組織化學(xué)處理

采集不同周齡的ICR小鼠新鮮睪丸，將其制作成石蠟切片后，先后進(jìn)行蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin, H.E.)染色和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)處理。將石蠟切片依次進(jìn)行脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片制作成H.E.染色切片，隨后顯微鏡鏡檢；同樣，將石蠟切片依次進(jìn)行脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉、一抗孵育(PLZF)、二抗孵育、DAB顯色、細(xì)胞核的蘇木素復(fù)染制作成IHC切片，最后顯微鏡鏡檢、分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)組別均至少包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.M)”來(lái)表示。采用SPSS Statistics 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組數(shù)值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著(用*表示)，P<0.01 表示差異極顯著(用**表示)。3組及以上的數(shù)值比較采用單因素方差分析，P<0.01 表示差異極顯著(用不同字母A、B、C、D、E表示)。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠生殖細(xì)胞的發(fā)育

由圖1可以看出，小鼠1周齡時(shí)，生殖細(xì)胞(含SSCs)基本定位在基底膜，管腔中幾乎沒(méi)有發(fā)育的細(xì)胞；3周齡時(shí)管腔中的細(xì)胞增多；5周齡時(shí)各級(jí)生殖細(xì)胞增多，管腔中開始有精子的形成；8周齡時(shí)管腔中已經(jīng)有大量的精子。縱觀各個(gè)周齡發(fā)育中的生殖細(xì)胞數(shù)量，SSCs均占比很少，而在乳鼠階段(1 周齡左右)，睪丸中生殖細(xì)胞最單一，最有利于SSCs的純化。

2.2 小鼠精原干細(xì)胞的分離與純化

用兩步酶消化法獲得睪丸單細(xì)胞懸液(圖2A)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力為(99.27±0.70)%。睪丸單細(xì)胞懸液差速貼壁處理后，對(duì)留下來(lái)的未貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，PLZF蛋白標(biāo)記的細(xì)胞顯示為綠色，被統(tǒng)計(jì)為SSCs細(xì)胞(圖2B)。隨機(jī)選取6個(gè)視野，分別統(tǒng)計(jì)PLZF蛋白標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)和Hochest33342染核的細(xì)胞總數(shù)，前者與后者的比值計(jì)為SSCs的純度。統(tǒng)計(jì)到的差速貼壁后SSCs的純度為(79.30±1.56)%。

A.睪丸細(xì)胞分離；B.精原干細(xì)胞的純化

2.3 小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)飼養(yǎng)層的優(yōu)化

4組不同濃度的絲裂霉素C孵育液處理F3代的mEF細(xì)胞后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況(圖3A)。以無(wú)藥物處理組于體外培養(yǎng)1 d的細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組。結(jié)果顯示，無(wú)藥物處理組，相比第1天的細(xì)胞增殖，培養(yǎng)到第3天時(shí)細(xì)胞增殖數(shù)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；相比對(duì)照組，10 μg·mL-1處理組在第1天時(shí)細(xì)胞數(shù)量極顯著減少(P<0.01)，第3天時(shí)細(xì)胞數(shù)量增多，第5天時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯變化；20 μg·mL-1組前3 d細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化，到第5天時(shí)部分細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，細(xì)胞開始出現(xiàn)死亡；30 μg·mL-1處理組在第1天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量就出現(xiàn)極顯著減少(P<0.01)，之后一直在不斷減少。故10 μg·mL-1組為最佳處理濃度，用它處理后的mEF細(xì)胞作為SSCs的飼養(yǎng)層(圖3B)。另外，對(duì)比了mEF飼養(yǎng)層和PLL-L 鋪板對(duì)SSCs體外培養(yǎng)的效果。結(jié)果顯示，在mEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)2 d后SSCs小小克隆團(tuán)已經(jīng)出現(xiàn)，培養(yǎng)7 d 后克隆團(tuán)進(jìn)一步增大(圖3C)。在PLL-L板上培養(yǎng)2 d后也出現(xiàn)了SSCs小小克隆團(tuán)，但是培養(yǎng)7 d 后發(fā)現(xiàn)克隆團(tuán)消失，細(xì)胞死亡(圖3C)。可見，mEF作為飼養(yǎng)層優(yōu)于PLL-L，后者不能替代mEF作為SSCs的飼養(yǎng)層。

A.不同濃度絲裂霉素C對(duì)mEF細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(n=3)，不同字母(A、B、C、D、E)表示差異極顯著(P<0.01)，下同；B.SSCs接種時(shí)的飼養(yǎng)層細(xì)胞；C.mEF和PLL-L分別作為飼養(yǎng)層對(duì)SSCs體外增殖的影響，箭頭指示精原干細(xì)胞克隆

2.4 小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化

比較了DMEM/F12培養(yǎng)基和StemPro-34 培養(yǎng)基對(duì)SSCs體外增殖的影響(圖4A)，結(jié)果顯示，在DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，SSC細(xì)胞幾乎全部死亡(圖4A)，而在StemPro-34 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的SSC細(xì)胞存活下來(lái)，且出現(xiàn)小小的克隆團(tuán)(圖4A)。比較了不同生長(zhǎng)因子對(duì)SSCs體外增殖的影響(圖4B)，以StemPro-34基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不加任何因子)培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組(Control)，體外培養(yǎng)4 d后統(tǒng)計(jì)各組的細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，StemPro-34培養(yǎng)基中細(xì)胞增殖緩慢(圖4B)。在加了GDNF生長(zhǎng)因子之后，細(xì)胞增殖迅速(圖4B，P<0.01)。再加了LIF、bFGF和IGF1之后，細(xì)胞增殖均變得迅速(圖4B，P<0.01)。而EGF因子的添加對(duì)細(xì)胞的增殖效果不明顯(圖4B，P>0.05)。

2.5 小鼠精原干細(xì)胞體外增殖的檢測(cè)

體外培養(yǎng)2 和14 d后，分別用AKP染色檢測(cè)SSCs增殖情況，著色為藍(lán)紫色的細(xì)胞被認(rèn)為是陽(yáng)性SSCs。培養(yǎng)初期，SSC細(xì)胞是小小的、圓圓的、孤立的，培養(yǎng)14 d后增殖的克隆集落抱團(tuán)生長(zhǎng)，分不清楚單個(gè)細(xì)胞，克隆集落邊緣不整齊，表面凹凸不平，以一種健壯的表現(xiàn)緊緊黏附在飼養(yǎng)層上(圖5A)。抗體免疫熒光染色顯示，這些克隆集落表達(dá)SSCs自我更新因子PLZF和UCHL1(圖5B)。提取這些增殖克隆集落的總RNA，RT-PCR檢測(cè)SSCs中多能基因OCT4、SOX2、NANOG和自我更新基因GFRA1、C-RET、UCHL1、PLZF、ETV5、BCL6B以及生殖標(biāo)志基因VASA的表達(dá)。結(jié)果顯示，培養(yǎng)14 d后的SSCs集落除了不表達(dá)生殖標(biāo)志基因VASA外，其余標(biāo)志基因均得以表達(dá)(圖5C)。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，體外培養(yǎng)的SSCs處于增殖階段。隨后，用純化后未進(jìn)行體外培養(yǎng)的SSCs作為對(duì)照組，比較了體外培養(yǎng)14 d后的SSCs克隆集落中多能基因SOX2和自我更新基因C-RET、GFRA1、UCHL1、BCL6B的表達(dá)量。結(jié)果顯示，培養(yǎng)后的細(xì)胞中這些基因的表達(dá)量均極顯著高于培養(yǎng)前(圖5D，P<0.01)。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，體外培養(yǎng)14 d后的SSCs大量增殖。

A.體外培養(yǎng)2 和14 d的SSCs分別用AKP染色檢測(cè)細(xì)胞增殖；B.用PLZF和UCHL1蛋白的免疫熒光檢測(cè)SSCs的增殖，紅色箭頭指示精原干細(xì)胞克隆；C、D.體外培養(yǎng)14 d的SSCs其生殖相關(guān)基因的RT-PCR檢測(cè)和 qRT-PCR檢測(cè)(n=3)

2.6 體外穩(wěn)定培養(yǎng)的小鼠精原干細(xì)胞功能檢測(cè)

將體外傳代培養(yǎng)至第6代的SSCs用慢病毒感染使其帶EGFP報(bào)告基因，隨后被轉(zhuǎn)移到受體小鼠的一側(cè)睪丸中(圖6A)，另一側(cè)睪丸不做移植作為對(duì)照組。移植后2個(gè)月分別采集對(duì)照組和試驗(yàn)組的附睪，觀察附睪中精子的形成與形態(tài)。結(jié)果顯示，對(duì)照組睪丸其相連的附睪中無(wú)精子形成，而移植的睪丸其相連的附睪中有很多形態(tài)正常的精子(圖6B)。在熒光顯微鏡下觀察這些精子，看到精子的頭部發(fā)綠光，而任何一只野生型的小鼠，其精子頭部在熒光下不發(fā)綠光(圖6B)，說(shuō)明了試驗(yàn)組產(chǎn)生的精子為供體SSCs來(lái)源。這個(gè)結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了體外穩(wěn)定培養(yǎng)的SSCs具有正常生物學(xué)功能。

A.供體SSCs移植，SSCs帶有EGFP報(bào)告基因；B.精子來(lái)源檢測(cè)，對(duì)照組沒(méi)有進(jìn)行移植，無(wú)精子生成，試驗(yàn)組產(chǎn)生的精子頭部發(fā)出綠光，野生型組精子頭部不發(fā)綠光；紅色箭頭指示精子

3 討 論

精原干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)被認(rèn)為是探索SSCs自我更新和分化的先決條件。小鼠SSCs的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，需要考慮幾個(gè)要素。

首先是精原干細(xì)胞的分離和純化。在睪丸細(xì)胞的分離方法上，應(yīng)用的比較多的是兩步酶消化法，即膠原酶和胰蛋白酶。從睪丸細(xì)胞懸液中純化SSCs的方法有很多，最常用的包括差速貼壁、密度梯度離心、形態(tài)學(xué)分選以及基于抗體的選擇(如熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting, FACS)或免疫磁珠分選(magnetic activated cell sorting, MACS))。這些方法各有利弊，相比之下差速貼壁法最大的優(yōu)勢(shì)是對(duì)試驗(yàn)條件和設(shè)備的要求最低，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)又省力。且結(jié)合文獻(xiàn)的報(bào)道[25-27]，通過(guò)差速貼壁法，獲得了純度36%～77%的SSC細(xì)胞，雖然比報(bào)道的通過(guò)FACS和MACS可獲得90%以上高純度的SSCs要低[28]，但是，本研究中獲得的純度約為79%的SSCs在體外獲得的穩(wěn)定培養(yǎng)也說(shuō)明了差速貼壁是一種純化SSCs的實(shí)用方法。

其次是飼養(yǎng)層的選擇，本研究利用絲裂霉素C處理之后的mEF作為飼養(yǎng)層，實(shí)現(xiàn)了SSCs的體外穩(wěn)定培養(yǎng)。這與前人的文獻(xiàn)報(bào)道相一致，mEF作為飼養(yǎng)層有它獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，絲裂霉素C處理之后的mEF自身的有絲分裂受抑制，失去了增殖能力，不會(huì)與干細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)。但是它的細(xì)胞活性沒(méi)有受到影響。它能產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子，包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、活化素以及骨形態(tài)發(fā)生拮抗蛋白等[29-32]，這些因子對(duì)于干細(xì)胞的體外維持很重要。也有文獻(xiàn)報(bào)道，多聚賴氨酸和層粘連蛋白的聯(lián)合鋪板對(duì)體外培養(yǎng)SSCs的效果甚至優(yōu)于mEF[33]。這與本研究結(jié)果不一致，本研究中，PLL-L體外培養(yǎng)SSCs的第2天也出現(xiàn)了SSCs的小小克隆團(tuán)，但是隨著SSCs的逐漸死亡，培養(yǎng)到第7天時(shí)發(fā)現(xiàn)之前已經(jīng)建立起來(lái)的克隆團(tuán)均已消失，這說(shuō)明在本研究中PLL-L并不適合小鼠SSCs的體外增殖與培養(yǎng)。

再次是培養(yǎng)體系的建立，目前對(duì)于SSCs的培養(yǎng)，應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基依然是DMEM(高糖)和DMEM/F12，尤其是在家畜SSCs培養(yǎng)上[34-35]。有文獻(xiàn)報(bào)道，DMEM很可能促進(jìn)SSCs的自我更新和分化。一種可能含有未暴露成分的專有改良培養(yǎng)基StemPro-34，其中搭配的StemPro-34補(bǔ)充劑(含16個(gè)單獨(dú)的化合物)可能對(duì)細(xì)胞的增殖有利[36]。本研究采用了這種改良培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)小鼠SSCs，效果優(yōu)于上述兩種普通的培養(yǎng)基。用血清替代物代替?zhèn)鹘y(tǒng)的血清，不僅在本試驗(yàn)中獲得了SSCs的穩(wěn)定培養(yǎng)，在大動(dòng)物上，雖然成功培養(yǎng)的報(bào)道少，但是血清替代物的使用對(duì)大動(dòng)物SSCs的體外培養(yǎng)也成效顯著。山羊的SSCs在含血清的培養(yǎng)基中只能維持2周，在無(wú)血清培養(yǎng)基中能維持4周[37]。在有血清替代物的培養(yǎng)基中，水牛SSCs能體外增殖維持28～30 d[38-40]。所以，無(wú)論在嚙齒類動(dòng)物還是大動(dòng)物上，SSCs的體外培養(yǎng)都可以借鑒這種無(wú)血清培養(yǎng)體系。根據(jù)前人研究的經(jīng)歷，在培養(yǎng)體系中添加其他成分，如非必需氨基酸、丙酮酸鈉、葡萄糖、巰基乙醇等，它們對(duì)SSCs的體外培養(yǎng)效果甚微。在本研究中，這些成分的添加也不能支持小鼠SSCs的體外增殖，是在選用了StemPro-34培養(yǎng)基，添加無(wú)血清和多種因子組合的體系后，成功的支持了ICR小鼠SSCs體外穩(wěn)定培養(yǎng)。在別的物種上的研究也表明，雖然飼養(yǎng)層細(xì)胞能分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞素，但是GDNF能促進(jìn)SSC的增殖和存活，這在許多物種上都取得了效果[37]。本研究顯示，沒(méi)有添加GDNF時(shí)，即使采用了StemPro-34培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)體系，也不能支持SSCs的穩(wěn)定增殖，而當(dāng)添加GDNF之后SSCs的增殖明顯。LIF在小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新中是必需添加的[41]。有研究表明，在沒(méi)有LIF的培養(yǎng)基中干細(xì)胞的多能特性等性能會(huì)降低，細(xì)胞會(huì)傾向于分化，SSCs的數(shù)量從培養(yǎng)第1天的54.3%減少到第6天的18.7%[42]。在SSCs培養(yǎng)中，bFGF的存在導(dǎo)致PI3K/AKT和MAPK通路的激活，并提高SSCs的存活率和增殖率[43-44]。在添加GDNF、bFGF 和LIF因子后，公雞SSCs的增殖和克隆集落都有很大改善，然而，當(dāng)培養(yǎng)基中3種因子同時(shí)添加時(shí)，增殖效果最為明顯[45]。IGF1調(diào)節(jié)G2/M期細(xì)胞分裂的進(jìn)程，可能有利于培養(yǎng)的SSCs進(jìn)行有絲分裂[46]。本研究中的5種因子，在單獨(dú)添加時(shí)均有促進(jìn)小鼠SSCs增殖的效果，在多種因子組合添加時(shí)其增殖效果最為明顯。可見，無(wú)論在嚙齒類動(dòng)物還是大動(dòng)物SSCs培養(yǎng)上，這5種因子的添加尤其是組合添加體系都具有借鑒意義。雖然不同的物種其睪丸中微環(huán)境有所不同，造成體外培養(yǎng)SSCs的難易程度也不同，但是來(lái)自不同物種SSCs的特性是相似的，相信通過(guò)學(xué)者們的不懈努力，在大動(dòng)物上只要找到調(diào)控微環(huán)境中SSCs增殖和分化的關(guān)鍵因子，大動(dòng)物乃至人類SSCs的體外培養(yǎng)便會(huì)取得很大突破。

4 結(jié) 論

在本研究中，培養(yǎng)的SSC細(xì)胞是抱團(tuán)生長(zhǎng)的，用標(biāo)志性蛋白檢測(cè)均呈現(xiàn)陽(yáng)性，也表達(dá)多能基因和自我更新基因，且最后移植的結(jié)果證明，體外穩(wěn)定培養(yǎng)的SSCs具有正常生物學(xué)功能。本研究中的SSCs體外培養(yǎng)條件和體系的優(yōu)化結(jié)果可以為別的品系小鼠和大動(dòng)物以及人類的SSCs體外培養(yǎng)提供參考。