銅水平對冬毛期烏蘇里貉毛皮品質、血清生化指標及肝相關基因表達的影響

張新宇，劉超楠，楊乾龍，韓菲菲，張如春，李光玉，劉晗璐

(中國農業科學院特產研究所，特種經濟動物分子生物學國家重點實驗室，長春 130112)

貉是一種珍貴經濟動物，是我國毛皮動物中最易養殖的品種，而提升毛皮品質是提高貉經濟效益的重要措施。機體毛色隨著毛黑色素含量的變化而變化，而酪氨酸酶是影響黑色素生成的重要限速酶[1]。酪氨酸酶有兩個含銅離子位點構成的活性中心[2-3]，黑色素的生物合成是一個由酪氨酸酶活性中心催化體內酪氨酸羥化而啟動一系列生化反應生成黑色素的過程[4]。國內學者對卡拉庫爾羊的毛色研究發現，銅元素含量在毛中呈現黑色毛>雜色毛>白色毛的規律[5]。許蘭嬌等[6]在對烏骨雞的研究中發現，添加適量的銅會影響器官、組織的黑色素含量以及酪氨酸酶活性。由此得知，飼糧中改變銅的含量會影響機體毛色的改變。此外，飼糧銅添加水平會明顯改變血清中一些抗氧化酶的活性，國內學者研究發現，飼喂不同銅水平的飼糧，會影響豬、兔、羊、牛等動物血清中銅藍蛋白和銅鋅超氧化物歧化酶的活性，提高清除體內自由基能力，從而提高機體免疫力[7-10]。我國是世界毛皮生產大國，但由于高檔毛皮產量較低，因此也是毛皮進口大國，為提高貉的毛皮品質，減少貉在飼養中的疾病問題，本試驗通過在飼糧中添加不同含量的蛋氨酸銅，探討毛皮品質、血清生化指標、器官指數及相關酶的活性等指標變化情況，為烏蘇里貉飼糧中銅含量的最佳水平提供建議值，為貉的飼養標準提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養管理

飼養試驗在中國農業科學院特產研究所長白山野生生物資源重點野外科學觀測試驗站進行。隨機選取(135±5)日齡、健康、體重相近((6.32±0.02)kg)的雄性烏蘇里貉105只，隨機分成7組(對照組和Ⅰ～Ⅵ組)，每組15只，單籠飼養。所有試驗動物常規免疫、單籠飼養，每日07:00與15:30各飼喂1次，自由飲水。預飼期7 d，正式試驗60 d。

1.2 試驗設計與試驗飼糧

試驗采用單因素試驗設計，各組基礎飼糧相同，分別添加蛋氨酸螯合銅(C10H20S2N2O4Cu)0(對照組)、30(Ⅰ組)、45(Ⅱ組)、60(Ⅲ組)、75(Ⅳ組)、90(Ⅴ組)、200(Ⅵ組)mg·kg-1，試驗所用蛋氨酸螯合銅購自秦皇島市三晶新農飼料有限公司，含量為12%(以銅元素計)。各處理組飼糧實際銅含量為4.1(對照組)、34.1(Ⅰ組)、49.1(Ⅱ組)、64.1(Ⅲ組)、79.1(Ⅳ組)、94.1(Ⅴ組)、204.1(Ⅵ組)mg·kg-1。

試驗參考狐NRC(1982)[11]及大中型養殖場中生產實踐中應用效果較好的烏蘇里貉育成期各營養物質需要量，配制貉基礎日糧，其組成及營養水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 血清樣品制備及生化指標測定 飼養試驗結束時，每組隨機選取8只健康烏蘇里貉，活體空腹稱重后采心血10 mL并處死，血液收集于促凝采血管中，經3 500 r·min-1離心8 min，將分離出的血清分裝在1.5 mL編好號的Eppendorf管中，置于-80 ℃保存，備用。丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、乳糖脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、血清葡萄糖(glucose，GLU)的測定采用試劑盒，以上試劑盒均購自中生北控生物科技股份有限公司，按照試劑盒說明，使用VITALIB-E全自動生化分析儀測定。

血清中總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(copper and zinc superoxide dismutase，Cu-Zn SOD)、銅藍蛋白(ceruloplasmin，CER)活力的測定采用試劑盒，以上試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司，按照試劑盒說明，使用紫外分光光度計測定吸光度并計算酶活力。

1.3.2 毛皮品質指標測定 烏蘇里貉的體長是把處死的貉平放于水平地面上，鼻尖至尾根的距離。鮮皮長為貉皮去油后，上楦板，測量鼻尖到尾根的距離。測量貉皮重量為鮮皮重。之后平穩地在貉背中部取帶毛囊的樣本三束，分別放入自封袋內。帶回實驗室后，使用游標卡尺測定貉的針毛長與絨毛長，采用光學纖維直徑分析儀測定貉背部針絨毛細度，以最粗部位直徑進行數據記錄

1.3.3 臟器指數測定 上述各組中8只烏蘇里貉處死，取皮后迅速取出心、肝、脾和腎，用濾紙吸干臟器表面的血液后進行稱重記錄，然后計算各臟器指數：臟器指數=器官重量÷體重×100%。

1.3.4 肝中相關基因的實時熒光定量PCR

1.3.4.1 肝總RNA提取與cDNA的合成：貉肝樣品中的RNA提取使用TransZolUP方法，試劑盒由北京全式金生物技術有限公司提供。使用北京全式金生物技術有限公司反轉錄試劑盒按照試劑盒說明，進行反轉錄，反應體系為20 μL。

1.3.4.2 引物設計與合成：內參基因參照劉志藍狐試驗中的引物設計及參考犬類的mRNA序列，利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0軟件設計相關基因特異性引物(表2)。

表2 引物序列

1.3.4.3 PCR擴增及檢測：用合成的引物對貉肝CER、CHR、IGF-1與Cu-ZnSOD基因進行PCR擴增，擴增體系為50 μL：2×Es TapMasterMix(Dye)25 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL，模板 DNA 0.5 μL，ddH2O補至50 μL。擴增反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 2 min。PCR產物測定采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。5 μL樣品與上樣緩沖液混合后點樣，同時點Marker DL1000 5 μL；電壓110 V電泳30 min 后，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(Bio-Rad公司產品)采集圖像。

1.3.4.4 實時熒光定量PCR：以各組貉肝的cDNA 為模板，使用SYBR GreenⅠ嵌合熒光進行PCR，試劑盒采購自北京全式金生物技術有限公司。qPCR擴增反應體系(20 μL)：模板 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Transstart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，ddH2O補至20 μL。qPCR擴增反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環。使用2-ΔΔCt法對目的基因的相對表達量進行計算。

1.4 數據分析

試驗數據通過SAS 9.4中單因素方差分析(one-way ANOVA)Duncan’s法進行顯著性檢驗。P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉毛皮品質的影響

銅水平對冬毛期烏蘇里貉毛皮品質影響見表3。Ⅲ與Ⅴ組體長顯著高于對照組(P=0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ組鮮皮長顯著高于對照組(P=0.04)。Ⅲ組針毛長顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ組，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ組針毛長顯著高于對照組(P<0.01)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組針毛細度顯著高于對照組與Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ組，Ⅴ、Ⅵ組針毛細度顯著高于對照組(P<0.01)。鮮皮重、絨毛長與絨毛細各指標組間差異不顯著(P>0.05)。

表3 飼糧銅水平對冬毛期期烏蘇里貉毛皮品質的影響

2.2 飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉器官指數的影響

如表4所示，飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉肝臟指數、心臟指數、脾臟指數與腎臟指數差異不顯著(P>0.05)。Ⅲ組的肝臟指數最大，Ⅵ組的肝臟指數最小。

表4 飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉器官指數的影響

2.3 飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉血清生化指標的影響

由表5已知，Ⅵ組血清GLU濃度顯著高于其余各組，Ⅴ組血清GLU濃度顯著高于對照組與Ⅰ、Ⅱ組，Ⅲ組血清GLU濃度顯著高于對照組與I組(P<0.01)。血清ALP酶活各組間差異不顯著(P>0.05)。Ⅵ組血清LDH酶活顯著高于Ⅴ組，Ⅴ組血清LDH酶活顯著高于對照組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組(P<0.01)。Ⅵ組血清ALT、AST酶活顯著高于Ⅴ組，Ⅴ組血清ALT、AST酶活顯著高于對照組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組(P<0.01)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ組血清CER酶活顯著高于Ⅱ組，Ⅱ組血清CER酶活顯著高于Ⅰ組，Ⅰ組CER酶活顯著高于對照組(P<0.01)。Ⅴ與Ⅵ組血清T-SOD酶活顯著高于Ⅰ組，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組血清T-SOD酶活顯著高于對照組(P<0.01)。Ⅴ與Ⅵ組血清Cu-Zn SOD酶活顯著高于對照組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，Ⅲ、Ⅳ組血清Cu-Zn SOD酶活顯著高于對照組與Ⅰ組(P<0.01)。

表5 飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉血清生化指標的影響

2.4 飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉肝相關基因表達的影響

用貉肝RNA反轉錄所得的cDNA為模板，進行PCR擴增，條帶清晰，擴增結果長度符合引物設計預期大小(圖1)。日糧不同銅添加水平對貉肝CER、GHR、IGF-1與Cu-ZnSOD基因相對表達量的影響如圖2所示，Ⅴ與Ⅵ組的肝CER基因表達水平顯著高于Ⅰ組，Ⅰ組肝CER基因表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅴ組的肝GHR基因表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅴ組的肝IGF-1基因表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅴ與Ⅵ組的肝Cu-ZnSOD基因表達水平顯著高于Ⅰ組，Ⅰ組肝Cu-ZnSOD基因表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。

圖1 目的基因PCR擴增產物電泳圖

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討 論

3.1 飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉毛皮品質的影響

毛皮品質是評價烏蘇里貉經濟效益的重要標準，而飼糧營養水平是其重要影響因素。其中，毛皮面積和被毛保溫性能是衡量毛皮品質的重要標準。鮮皮長和體長的提升有助于獲得最大的毛皮面積[12]，這可能與銅對貉有促生長作用密切相關[13]。毛皮重量和其延展性息息相關，當毛皮重量過輕時，延展性降低，本次試驗中毛皮重量沒有顯著變化，可以推斷，銅可以提升毛皮的面積，但不會影響毛皮的延展性。李道林[14]在兔的研究中發現，飼糧中添加銅會對生長性能及毛皮品質有著顯著提升。Yang等[15]和程忠剛等[16]在豬的研究中發現，銅具有促進豬生長的作用，并且可以提升血清中IGF-1的含量。保溫性能主要由被毛厚度相關，針絨毛的長度是決定被毛厚度的重要指標之一。本試驗發現，飼糧中添加銅會提升被毛中針毛的長度，隨著針毛長度的增加，針毛細度也隨之增加[17-18]，并進一步提升了髓質腔容納空氣的能力。髓質腔內靜止空氣的量越多，被毛保溫性能越好[19-20]。綜上，飼糧添加適量銅可以增加體長和鮮皮長，從而提升貉的毛皮面積，提高針毛長度和細度，增加被毛厚度，使被毛保溫性能得到提升。在本試驗條件下，當飼糧銅添加水平為45～75 mg·kg-1時，可以得到最佳的毛皮品質。

3.2 飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉器官指數的影響

臟器指數可以反映器官生長發育情況，以及機體的器官功能的強弱，也可表明機體的健康情況。銅廣泛分布于各個器官，其中肝是銅代謝的主要器官，當銅積蓄過量時，肝會嚴重受損[21]。Kumar等[22]通過對大鼠飼喂高劑量銅的日糧發現，大鼠腎、腦以及肝都嚴重受損。此外有研究表明，銅缺乏會引起心外觀肥厚，從而導致心肌病[23-24]，此外，銅缺乏還會導致脾萎縮[25]。本試驗發現，貉對銅有較好的耐受量，當飼糧中銅添加水平為200 mg·kg-1時，臟器指數沒有顯著變化，對肝、腎、心和脾的功能沒有影響。未添加組的心臟指數沒有顯著變化，說明飼糧中銅可以滿足日常需要，不會產生心肌肥大、心肌病等。在小鼠與水貂等研究中也同樣發現，動物機體對銅代謝調控能力較強，適當劑量的銅對臟器指數沒有影響[26-27]。但李秀霞等[28]在小鼠中的研究中發現，飼糧中添加銅可以促進脾發育，具有延緩胸腺退化的功效。王寶維等[29]在鵝的研究中也發現相似結論。因此，在實踐生產中，雖然，日糧中銅含量不會造成銅缺乏的現象，但是在不影響腎、肝和心代謝的情況下，可以適當提高飼糧中銅含量，有助于脾發育，延緩胸腺退化和提升機體免疫力。

3.3 飼糧銅水平對冬毛期烏蘇里貉血清生化指標的影響

機體的能量主要由GLU提供，為維持體內各組織器官的能量需要，GLU必需要保持動態平衡。本試驗中貉血清中GLU濃度隨著銅含量的升高而升高，這可能是由于Cu/Zn過高，抑制鋅離子吸收，導致繼發性缺鋅[30-31]，而胰島素分子中含有兩個金屬鋅原子，缺鋅會導致胰島素失性，從而影響血糖代謝。ALP活力與骨骼發育和鈣化密切相關，在生長階段，ALP的酶活顯著升高[32]，在冬毛期貉已經生理性成熟，骨骼停止發育，所以ALP的含量趨于穩定。LDH廣泛分布于肝、心、脾、腎等細胞胞質中，是糖酵解通路的主要酶，常被用來檢測心肌梗死、肝炎、肝硬化等疾病[27]。血清AST和ALT是肝功能檢測的硬性指標，當機體肝硬化、肝中毒時，ALT與AST的血清酶活成倍上升[33]。在鵝研究中發現，當鵝飼糧銅含量超過400 mg·kg-1時，血清中LDH、AST與ALT的酶活明顯上升，死亡率達到30%[34]。在小鼠的慢性銅中毒試驗中也同樣發現，血清中AST與LDH的酶活顯著上升[35]。當飼糧中銅水平為90與200 mg·kg-1時，血清中LDH、AST與ALT的酶活呈倍數升高，證明高銅飼喂增加了肝代謝負擔，造成肝細胞破損，使細胞中LDH等酶釋放到了血清中。

Cu-Zn SOD與CER的活性中心由銅離子構成，對于清除機體自由基，抗氧化有著重要作用，CER能催化血液中的Fe3+還原成Fe2+,還可以間接減少O2-生成[36]。Cu-Zn SOD是機體重要的抗氧化酶,主要有清除O2-、保護組織細胞的作用[37-38]。本研究發現，飼糧中銅含量為60 mg·kg-1時，血清中CER、T-SOD與Cu-Zn SOD的酶活趨于穩定，隨著銅水平的提升，其活力不會再有顯著變化。有研究表明，在雛雞飼糧中提高銅的含量，血清中Cu-Zn SOD與CER酶活上升[33]。劉強[32]也曾報道，在豬飼糧中提升銅的含量，血清中Cu-Zn SOD酶活也會隨之升高。銅被小腸吸收，通過相關蛋白轉運到肝中，引起肝中銅濃度升高，而肝是合成CER與Cu-Zn SOD的主要場所，間接增強了肝合成CER與Cu-Zn SOD的能力。T-SOD的酶活與Cu-Zn SOD酶活成正比，由于機體的Cu-Zn SOD酶活隨著銅水平的升高，所以T-SOD的酶活也隨之升高。因此，在飼糧中添加適量銅會提高抗氧化酶的酶活，增強機體清除自由基的能力。

3.4 飼糧添加銅水平對冬毛期烏蘇里貉肝相關基因表達的影響

動物生長發育主要通過生長激素軸的調控，其中GH至IGF-I途徑是其中心環節，而GH只有與靶細胞上的GHR結合，通過細胞內的信號轉導機制，使靶細胞分泌IGF-I，繼而通過血液運輸到組織器官，調控機體生長。肝是GHR基因表達量最高的器官，也是IGF-I分泌的主要場所。在生長階段GH、GHR和IGF-1等基因的表達水平明顯增高，血清中GH與IGF-I的含量顯著高于其余生長時期[39]。Pierzchaa等[40-41]對仔豬的研究發現，飼糧中提高銅的水平可以提高肝GHR與IGF-1基因的mRNA表達，進而提升血清中生長激素的水平。本試驗結果顯示，飼糧中添加銅使肝中GHR和IGF-1基因的mRNA表達含量顯著高于未添加組。進一步證實，銅具有促進貉機體生長的作用。但是高銅飼糧使肝內GHR和IGF-1基因表達降低，與高銅可以抑制動物生長的結論相符[42]，這可能是由于銅與二價離子發生拮抗作用，使其繼發性缺乏導致。血清中含銅酶的活力與飼糧中銅添加量密切相關，本試驗結果表明，血清中CER與Cu-Zn SOD酶活隨著銅水平的升高而呈現先升高，然后趨于穩定，CER與Cu-Zn SOD的主要產生場所是肝，通過對肝內的CER與Cu-ZnSOD基因的mRNA表達的檢測，發現CER與Cu-ZnSOD基因的表達也呈現相似規律，進一步表明，飼糧中添加銅確實可以促進貉肝內CER與Cu-Zn SOD的合成。

4 結 論

本研究中，隨著飼糧銅水平的升高，肝內GHR與IGF-1基因表達水平呈現先升高在降低的趨勢，與貉的體長和鮮皮長的變化趨勢相似，而在飼糧銅添加水平為45～75 mg·kg-1時，貉可獲得最佳毛皮品質。而CER與Cu-ZnSOD基因的表達水平呈現先升高然后趨于穩定的趨勢，當飼糧在60～75 mg·kg-1時，血清CER與Cu-Zn SOD活力達到平穩，此后，隨飼糧銅水平的升高，兩種酶的活力不會有顯著變化。當飼糧銅添加水平為90～200 mg·kg-1時，血清中ALT、AST與LDH的活力急劇升高，表明飼糧中銅已經損傷貉肝等器官細胞，使細胞中的ALT、AST與LDH釋放到血液中。綜上所述，為提升貉的毛皮品質，抗氧化能力以及降低銅對貉機體的危害，建議貉飼糧中銅添加水平為60～75 mg·kg-1。