牦牛源牛凸隆病毒的檢測及其基因組特征

趙 龍，湯 承，2，岳 華,2*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041)

牛凸隆病毒(bovine torovirus, BToV)是套式病毒目(Nidovirales)托巴套氏病毒科(Tobaniviridae)凸隆病毒亞科(Torovirinae)凸隆病毒屬(Torovirus)的成員，凸隆病毒屬的成員還包括馬凸隆病毒(equine torovirus, EToV)和豬凸隆病毒(porcine torovirus, PToV)(國際病毒分類委員會：https://talk.ictvonline.org/)。BToV主要引起犢牛腹瀉甚至死亡，同時，也可引起成年牛腹瀉[1-2]。近年來，有學者從牛呼吸道樣本中檢測到BToV，證明其具有雙重組織嗜性，推測也是潛在的呼吸道致病因子[3-4]。自1982年在美國首次報道以來，目前，世界上已有17個國家報道BToV的存在或流行，其已經具有廣泛的地域分布[3-10]。

BToV為有囊膜單股正鏈RNA病毒，目前,GenBank中僅有5條BToV基因組序列，除加拿大BToV基因組為原型毒株Breda 1以外，其余均為基因Ⅱ型毒株。這5條BToV基因組長度為28 297～28 475 bp，基因組由5′UTR和ORF1a、ORF1b、S、M、HE、N6個ORF區以及3′UTR組成[11]。ORF1a、ORF1b為兩個大的重疊ORF區，分別編碼聚合酶pp1a和pp1b，在病毒的復制過程中起著重要作用[11]。S基因編碼纖突蛋白(S蛋白)，是誘導機體產生中和抗體的重要抗原[12]，并且與病毒的致病性、組織嗜性和宿主范圍密切相關[13-14]。S蛋白可在“類胰蛋白酶”裂解位點(1 003—1 007 aa)裂解為S1和S2兩個亞基[15-16]，S1亞基負責與宿主細胞表面的受體結合，S2亞基則介導病毒與宿主細胞的膜融合，在病毒的感染過程中起著重要作用[17]。M基因編碼的膜蛋白在病毒的組裝、成熟和核衣殼識別過程中起作用[18]。HE基因編碼血凝素酯酶蛋白(HE蛋白)，具有凝集素結構域(R)、酯酶結構域(E)和膜近端結構域(MP)3個結構域[19]。病毒通過HE蛋白實現與唾液酸的可逆性黏附，從而避免由于結合“假”受體而失去感染力，在啟動感染的初期發揮重要作用[19]。N基因編碼的核衣殼蛋白在病毒轉錄和翻譯中發揮作用[18]。

青藏高原的高寒高海拔地理氣候特點孕育了其獨特的生態系統[20]。牦牛是青藏高原特有物種，全世界約有1 700萬頭牦牛，90%以上的牦牛都分布在我國青藏高原[21]。牦牛腹瀉給牦牛養殖業帶來巨大的經濟損失[22]。目前，已知引起牦牛腹瀉的病毒主要有A群牛輪狀病毒(BRV)[23-24]、牛冠狀病毒(BCoV)[25]、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)[26]、紐布病毒(NeV)[27]和星狀病毒(AstV)[22]等，但目前還沒有在牦牛中檢測到BToV的報道。因此，本研究旨在證實青藏高原牦牛BToV的存在并研究其分子特征，為牦牛腹瀉的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

145份3月齡以內牦牛腹瀉糞便樣本于2018年5—7月采集于西藏(3個牧場)、青海(3個牧場)、四川藏區(6個牧場)，樣本凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑及儀器

TrizolTM、pMD19-T克隆載體、反轉錄試劑盒、DH5α感受態細胞等購于寶生物公司；PCR 預混酶購于TOYOBO公司；1640培養基購自Hyclone公司，胰蛋白酶、胎牛血清購自BI公司；HRT-18細胞系由本實驗室保存；凝膠成像系統Doc2000(Bio-Rad公司，美國)；熒光倒置顯微鏡(Olympus Corporation 公司，日本)；基因擴增儀、CO2細胞培養箱(Thermo公司，美國)。

1.3 RNA提取與cDNA合成

取糞便0.2 g與PBS緩沖液(1∶5)混勻后以8 000 r·min-1離心8 min，取上清液400 μL用Trizol 法提取RNA，然后反轉錄合成cDNA凍存于-20 ℃待用。

1.4 臨床樣本BToV檢測

采用Ito等[28]的RT-PCR方法進行BToV檢測。PCR陽性產物送生物工程(上海)股份有限公司測序以驗證序列正確性并用于遺傳進化分析。

1.5 病毒的分離培養

參照Aita等[2]的BToV分離培養條件對本研究中BToV陽性樣本進行BToV分離培養。

1.6 陽性樣本中其他腸道病毒共感染調查

對BToV陽性樣本采用先前報道的方法進一步檢測BRV、BCoV、BVDV 3種病毒的感染情況[23, 29-30]。PCR陽性產物送生物工程(上海)股份有限公司測序以驗證序列正確性。

1.7 基因組擴增

根據GenBank中現有的5條完整BToV基因組序列，采用Primer Premier 5.0設計27對引物(表1)，用于擴增基因組序列(包括5′和3′末端序列)，所有BToV陽性樣本均進行全基因組擴增。PCR擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。反應體系：PCR預混酶 12.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補足25 μL。陽性PCR產物使用膠回收試劑盒回收后連接于pMD19-T載體，再轉入DH5α感受態細胞，增菌后送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。對獲得的序列采用SeqMan7.0(version 7.0; DNASTAR, USA)拼接，拼接后的序列進行BLAST比對驗證。再基于拼接后的序列設計10對引物(表2)，參照上述相同方法進行序列復核。

表1 BToV基因組序列測定引物信息

表2 BToV基因組復核引物信息

1.8 序列和遺傳進化及重組分析

使用ORF在線預測工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測基因組的ORF位置；使用MEGA 7.0.26進行多序列比對，并采用最大似然法建立核苷酸及氨基酸系統發育樹；使用MegAlign(DNASTAR Inc., WI, USA)計算核苷酸和氨基酸相似性；使用RDP 4.97中的RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq 7種方法進行重組分析。

2 結 果

2.1 臨床樣本檢測及病毒分離培養

145份樣本檢出10份BToV陽性，平均陽性率約為6.9%(10/145)。其中，西藏、青海、四川藏區的陽性率分別約為11.8%(4/34)、8.9%(4/45)、3.0%(2/66)。這10份BToV陽性樣本分別來自4個不同牧場，陽性率分別約為36.4%(4/11)、5.3%(1/19)、2.9%(1/35)、16.0%(4/25)。10份BToV陽性樣本中有5份為BToV單獨感染，3份為BToV與BRV混合感染，1份為BToV與BCoV混合感染，1份為BToV、BRV、BCoV 3種病原混合感染。將10份陽性樣本接種HRT-18細胞系盲傳6代后均無細胞病變產生，并檢測細胞培養物中BToV，無陽性。

2.2 M基因遺傳進化分析

10份BToV陽性PCR產物測序成功(635 bp)(GenBan登錄號：MN882588～MN882597)，其核苷酸相似性為99.7%～100%，與GenBank中已有的13個BToV-M基因片段(≥635 bp)的核苷酸相似性為94.8%～98.6%。系統發育分析表明，本研究中的10個M基因片段聚為獨立的一支，與荷蘭毒株的親緣關系最近，與美國毒株親緣關系最遠(圖1A)。進一步分析發現，這10個M基因片段與所有13個BToV-M基因片段相比，它們均在138位堿基由T突變為C，但該突變并未引起氨基酸改變。

2.3 牦牛源BToV基因組分析

本研究成功從1份西藏陽性樣本中拼接得一條牦牛源BToV基因組，命名為yak-XZ01(GenBank登錄號：MN882587)。基因組全長28 314 bp，GC含量為36.31%，由5′UTR和ORF1a、ORF1b、S、M、HE、N6個ORF區以及3′UTR組成，長度分別為788、13 257、6 870、4 755、702、1 257、492、198 bp(圖2)。該基因組與GenBank中其余5條 BToV基因組相比，核苷酸相似性為82%～97%，與國內奶牛源BToV基因組SC2基因組相似性最高(97%)。基于GenBank中已有的5個BToV基因組、7個哺乳動物ToV基因組和yak-XZ01基因組的系統發育分析表明，BToV yak-XZ01與國內奶牛源基因組SC1和SC2共同聚為一支，親緣關最近，但也有一定的遺傳距離，與澳大利亞毒株親緣關系最遠(圖1B)。

圈中數字代表基因組中位置，剩下數字代表每個基因長度

2.4 BToV yak-XZ01 S基因分子特征

BToV yak-XZ01的S基因全長4 755 bp，編碼1 584個氨基酸。該S基因與GenBank中已有的14條完整BToVS基因的核苷酸相似性為91.4%～97.3%，氨基酸相似性為89.97%～97.85%，與其中的日本毒株AB526863.1氨基酸相似性最高。基于完整S基因氨基酸序列的系統發育分析表明，BToV yak-XZ01與土耳其毒株MG957145.1共同聚為一支，親緣關系最近，與美國毒株AF076621.1親緣關系最遠(圖1C)。進一步分析表明，與GenBank中已有的14條完整BToVS基因序列相比，本研究中的S基因具有8個獨特的氨基酸變異(S35F、T54I、I132V、Q614R、T801I、E885Q、T1 335I、K1 583R)，其中，前6個氨基酸突變位點位于S1區，后2個氨基酸突變位點位于S2區。

▲表示本研究中的序列

重組分析表明本研究的S基因發生區域重組事件，RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq 7種方法支持，得分為0.623，重組區域推測為222—2 473 bp區間。預測的主要親本毒株是土耳其MG957146.1，次要親本毒株是日本AB526863.1(圖3A)。

2.5 BToV yak-XZ01 HE基因分子特征

BToV yak-XZ01的HE基因全長1 257 bp，編碼418個氨基酸。該HE基因與GenBank中已有的21條完整BToV-HE基因的核苷酸相似性為71.4%～96.9%，氨基酸相似性為75.7%～96.9%，與其中的荷蘭毒株AJ575380.1氨基酸相似性最高。基于完整HE基因氨基酸序列的系統發育分析表明，BToV yak-XZ01株屬于BToV基因Ⅲ型毒株，與土耳其毒株MG957145.1同聚為一支，親緣關系最近(圖1D)。進一步分析表明，與GenBank中已有的21個完整BToVHE基因序列相比，本研究的HE基因在酯酶結構域具有1個獨特的氨基酸變異(P44S)。

重組分析表明本研究的HE基因發生點重組事件，RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq 7種方法支持，得分為0.453，重組斷點推測位于1 067 bp，預測的主要親本毒株是美國PToV KM403390.1，次要親本毒株是美國BToV AF076621.1(圖3B)。

圖3 BToV yak-XZ01 S基因(A)、HE基因(B)重組分析

3 討 論

BToV是導致牛腹瀉的一種重要病原[1-2]，目前已有包括中國在內的17個國家報道該病毒[3-10]。本研究首次從牦牛中檢測到BToV，陽性樣本來自3個省(區)的4個不同牧場，豐富了牦牛腹瀉病原譜，雖然陽性率不高，但是具有廣泛的地域分布，這與土耳其的報道類似[8]。M基因檢測片段的系統發育分析表明，所有牦牛源BToV毒株在遺傳進化樹上單獨聚為一大支，表現出獨特的進化趨勢，提示有必要進一步開展牦牛源BToV的流行病學調查。值得注意的是，這10份陽性樣本中有5份存在混合感染，這會增加臨床診斷的困難性，需要引起重視。

本研究從1份西藏陽性樣本中拼接得到1條牦牛源BToV基因組，與GenBank中現有的5條BToV基因組相比，該基因組具有以下4個特點：(1)這是第1個牦牛源BToV基因組；(2)該基因組也是第1個基因Ⅲ型基因組；(3)該基因組的S、HE基因存在重組事件;(4)該基因組的S、HE基因均具有獨特的氨基酸突變。這些發現對進一步了解BToV的分子特征和遺傳進化具有重要意義。

本研究基因組與國內奶牛源基因組SC2同源性最高，親緣關系最近，這表明牦牛BToV有可能由國內奶牛BToV傳播而來。但是，與國內奶牛源BToV SC1、SC2相比，牦牛源BToV的各ORF區域均存在氨基酸變異，這可能是BToV在感染牦牛的過程中對新宿主以及青藏高原環境適應所發生的變異[31]。本研究的BToV基因組為基因Ⅲ型，而國內關于BToV的分子流行病學資料較少[9,32]，目前只檢測到基因Ⅱ型的存在，與本研究中BToV的基因型不同。前期研究表明，基因Ⅱ型和Ⅲ型毒株在荷蘭[33](GenBank登錄號:AJ575380.1)和土耳其(GenBank登錄號MG957145.1、MG957146.1)同時存在流行，因此有必要進一步調查基因Ⅱ型和Ⅲ型毒株在我國牛群中的流行情況。

BToV的S蛋白與BCoV類似，該蛋白是引起機體產生中和抗體的重要抗原[12]，并且目前普遍認為S蛋白與病毒的致病性、組織嗜性和宿主范圍的變化有關[13-14]。在病毒的感染過程中，S蛋白通過“類胰蛋白酶”裂解位點(1 003—1 007aa)裂解為S1和S2兩個亞基[15-16]，S1亞基負責與宿主細胞表面的受體結合，S2亞基則介導病毒與宿主細胞的膜融合[17]。本研究的S蛋白上存在8個獨特的氨基酸變異(S35F、T54I、I132V、Q614R、T801I、E885Q、T1 335I、K1 583R)，其中前6個變異位點位于“S1”亞基，后2個變異位點位于“S2”亞基，這可能就會改變病毒與宿主細胞表面受體結合以及膜融合的能力[34]。然而，目前關于BToV S蛋白研究資料較少，這些獨特的氨基酸變異的生物學意義還需要進一步研究。

BCoV的S、HE基因重組事件十分常見[35-36]。基因重組在冠狀病毒的進化中起著重要作用，病毒可通過重組來有效地改變組織嗜性和宿主范圍，從而產生新的致病毒株[37-38]。BToV與BCoV基因組結構相似，兩者S蛋白功能類似[39]。本研究首次報道了凸隆病毒屬成員S基因的區域重組事件，進一步分析發現土耳其毒株MG957145.1也具有相同的重組事件。鑒于S基因在病毒的致病性、組織嗜性和宿主范圍上起著重要作用，這種S基因重組毒株的生物學特性需要進一步研究。

目前，GenBank中有21條完整HE基因序列，根據BToV-HE基因序列特征可將其劃分為3種基因型[33]，最早發現的3個BToV毒株均為基因Ⅰ型毒株，來自加拿大[11]、美國[16]和荷蘭(GenBank登錄號: Y10866.1)；基因Ⅱ型毒株共有15個，主要報道于日本[2]、中國[9]和荷蘭[33]等國；基因Ⅲ型毒株共有3個，僅在土耳其(GenBank登錄號MG957145.1)和荷蘭[33]有報道。近年來流行的毒株均為基因Ⅱ型和Ⅲ型毒株。2003年Smits等[33]對GenBank中HE基因進行重組分析，認為基因Ⅱ型毒株是由基因Ⅰ型原型毒株與PToV重組而來，而基因Ⅲ型毒株則被認為是由基因Ⅱ型毒株與一種未知的ToV重組而來。由于該重組分析所用序列都是2003年之前上傳，因此可能由于當時HE基因序列的數量和年限限制，未能預測到基因Ⅲ型毒株的親本株。而本研究中HE基因重組事件的親本毒株預測為美國BToVⅠ型毒株與美國PToV毒株(該序列為2014年上傳)，進一步分析發現GenBank中已有的3株Ⅲ型毒株也存在相同的重組事件。因此，BToV基因Ⅲ型毒株有可能是由BToVⅠ毒株與PToV毒株重組而來，這對了解Ⅲ型毒株的遺傳進化提供了參考。

HE蛋白的E結構域負責行使受體破壞酶的功能，從而使病毒能夠可逆地結合唾液酸[19]。而本研究的HE蛋白在E結構域中的氨基酸突變(P44S)可能會影響HE蛋白的酯酶活性，從而影響病毒對唾液酸的可逆性結合。R結構域負責行使受體結合的功能，相關的受體結合位點包括Phe207、Leu170、Leu168、Phe264、Trp109以及形成疏水袋內發夾結構的206—213位氨基酸殘基，已有研究證明當受體結合位點的氨基酸殘基經丙氨酸替代可明顯降低HE蛋白與受體結合的能力[19]。而包括本研究毒株在內的所有基因Ⅲ型毒株均在這些關鍵的結合位點上有4個氨基酸變異(L170V、W109Y、G210D、T209A)，這些變異可能會直接影響基因Ⅲ型毒株HE蛋白與受體結合的能力，然而并不是所有的氨基酸突變都是突變為丙氨酸，這些基因Ⅲ型毒株共有的氨基酸突變對受體結合能力的影響，還需要進一步研究予以證明。

4 結 論

本研究證實了BToV在牦牛中的存在，豐富了牦牛腹瀉病原譜，為牦牛腹瀉防控提供了參考。獲得了牦牛源BToV基因Ⅲ型基因組，報道了BToV中的S基因重組事件，為進一步研究BToV的流行和遺傳進化提供了參考。