廣州市農貿市場豬肉源倫敦沙門菌的流行情況及耐藥性分析

高 遠，王蘭茜，張麗娜，符 穎，張建民，廖 明，瞿孝云

(華南農業大學獸醫學院,人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室，廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，農業部人畜共患病重點實驗室,廣州 510642)

沙門菌(Salmonella)為革蘭陰性桿菌，是一種重要的人獸共患致病菌，其分布廣泛，種類繁多，不僅可以感染多種畜禽動物，甚至可以通過食品引起人類的食物中毒。每年感染沙門菌的病例超過9 300萬例，死亡達15.5萬人，其中，85%都與食物有關[1]。現今，沙門菌感染已成為國際上重要的公共衛生問題[2-5]。

迄今為止，沙門菌在世界范圍內已經發現并鑒定出超過2 600多種血清型，絕大部分能導致人類和動物發病[6]。我國約有75%食源性疾病的暴發是由沙門菌引起的，其中，90%的與食物中毒和攝入污染畜禽肉及其相關制品有關[7]。廣東省是畜牧生產和消費大省，豬肉也是沙門菌的主要貯庫，畜禽產品的安全尤其是豬肉的安全直接關系到消費者健康[8]。倫敦沙門菌在20世紀40年代被發現，目前，成為沙門菌中排名前十的優勢血清型，但在食品流通環節尤其是農貿市場中豬肉源菌株的研究鮮有報道。國內研究者曾在新生兒和食物中毒病人中有過報道，新加坡的研究在1名兒童體內檢出多重耐藥倫敦沙門菌[9-12]。因此，本研究旨在調查2016年5—10月廣州農貿市場豬肉中倫敦沙門菌的流行與耐藥情況，為臨床中合理應用抗菌藥物以及保障食品安全提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌株來源 2016年5—10月，從廣州市農貿市場采集分離倫敦沙門菌。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.2 主要試劑 木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉瓊脂(XLT4 Agar)、LB(Luria Bertani)營養瓊脂、LB 肉湯購自廣東環凱微生物科技有限公司；DNA Marker DL1000，DNA Marker DL2000，rTaqDNA聚合酶(Premix Taq)購自日本TaKaRa公司；Goldview核酸染料，購自美國Biotium公司。

1.2 方法

1.2.1 沙門菌的分離鑒定 將在農貿市場不同檔口隨機采集的豬肉樣品裝入無菌采樣袋，在8 h內低溫運送至實驗室。將所有豬肉樣品按每份25 g加入滅菌BPW 225 mL充分揉搓洗滌2 min后，置于37 ℃搖床中以100 r·min-1振蕩6～8 h。取預增菌液體1 mL，轉移至10 mL TTB內進行選擇性增菌，溫度為42 ℃，時間為18～24 h。再用接種環蘸取TTB增菌液劃線接種于XLT4瓊脂平板，37 ℃ 培養18～24 h。選取疑似沙門菌菌落(典型形態：色澤黑亮、周圍有白色透明環)接種于沙門菌顯色培養基上進行純化，取純化后的疑似菌落用沙門菌特異性基因invA進行聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定，引物詳見表2[13-14]。

表2 試驗中所用引物的相關信息

1.2.2 血清學鑒定 按照泰國S&A公司提供的沙門菌血清診斷操作步驟對菌株進行血清型鑒定，查閱S&A公司沙門菌抗血清診斷附錄，根據測定得到的抗原式確定沙門菌的血清型[12]。

1.2.3 藥物敏感性試驗 使用K-B紙片擴散法對倫敦沙門菌進行抗菌藥物敏感性試驗，并根據CLSI(美國臨床實驗室標準化委員會)推薦的操作規程對結果進行解釋。使用大腸桿菌ATCC 25922作為質控菌株。藥敏試驗判定標準見表1。

表1 藥敏紙片種類及判定標準

1.2.4 耐藥基因檢測 利用水煮法提取28株倫敦沙門菌基因組DNA。選取如下基因：氨基糖苷類耐藥基因aadA2、aadB、strA；酰胺醇類耐藥基因aphAI-IAB、cat1b、cat2b、floR；磺胺類耐藥基因sul1、sul2；四環素耐藥基因tetA、tetB；選擇β內酰胺類、碳青霉烯類耐藥基因blaTEM、blaCTM、blaOXA、blaNDM；選擇多黏菌素類耐藥基因mcr-1；選擇喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxAB、aac(6’)-Ib-cr[15-17]。擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果為陽性的PCR產物直接送廣州市艾基生物技術有限公司測序。測序結果通過NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行Blast分析,與GenBank上對應基因序列進行比對。

2 結 果

2.1 分離鑒定及血清型鑒定

從廣州市5個農貿市場采集到豬肉樣品198份，經分離鑒定后得到147份沙門菌陽性樣品，陽性率為74.2%。通過血清型鑒定，共鑒定出17種血清型，其中，主要為鼠傷寒(34/147，23.1%)、羅森(34/147，23.1%)、德比(31/147，21.1%)和倫敦(28/147，19.0%)，詳見表3。

表3 沙門菌血清型鑒定結果

2.2 藥敏試驗

表4 28株倫敦沙門菌耐藥情況

多重耐藥率為71.4%(耐3類及其以上的抗菌藥物)。28株倫敦沙門菌共存在9種耐藥譜型，其中AMP+CN+S+SXT+SUL+FFC+C+TE為優勢譜型(28.6%)，其次是AMP+CN+S+SXT+SUL+TE(25.0%)。有2株菌對9種藥物耐藥，耐藥譜型分別為AMP+CN+S+SXT+SUL+FFC+C+NA+TE(3.6%)和AMP+CN+S+SXT+SUL+FFC+C+PB+TE(3.6%)，詳見表5。

表5 28株倫敦沙門菌耐藥譜

2.3 耐藥基因檢測

通過對28株倫敦沙門菌進行耐藥基因檢測發現，β-內酰胺類類耐藥基因blaTEM的檢出率為10.7%(3/28)，未檢出blaCTX-M、blaCTX-M耐藥基因；氨基糖苷類耐藥基因aadB的檢出率為100.0%(28/28)，未檢出aadA1；酰胺醇類藥物耐藥基因cat1b、floR的檢出率為39.2%(11/28)，未檢出cat2b；磺胺類耐藥基因sul1、sul2的檢出率均為60.7%(17/28)；四環素類耐藥基因tetA、tetB的檢出率均為78.6%(22/28)；喹諾酮類耐藥基因qnrA檢出率為3.6%(1/28)，oqxAB檢出率為10.7%(3/28)，aac(6’)-Ib-cr檢出率為7.1%(2/28)；黏菌素類耐藥基因mcr-1檢出率為3.6%(1/28)；未檢出碳青霉烯類耐藥基因blaNDM，詳見表6。

表6 28株倫敦沙門菌耐藥基因檢出結果

3 討 論

沙門菌可以通過食物鏈進入人體從而引起人食物中毒等癥狀。倫敦血清型不常見，1980年曾在匈牙利引起局部流行，2000年前后，韓國感染病例的增多趨勢且出現產超廣譜β內酰胺酶菌株[18-19]。國內關于倫敦沙門菌的報道主要集中在食物中毒的案例，特別是免疫功能不完善的新生兒和有慢性疾病的較易發病[20-21]。本研究發現在廣州農貿市場售賣的豬肉中，倫敦沙門菌分離率高達19%，僅次于常見的鼠傷寒、羅森和德比血清型，為第四優勢血清型。這提示廣州市售豬肉中倫敦沙門菌污染較為嚴重，需及時對廣州市農貿市場豬肉中倫敦沙門菌的流行與耐藥情況進行檢測與監測，這對廣州地區的食品安全與公共衛生具有重要意義。

本研究在廣州農貿市場中檢出的高耐藥率倫敦沙門菌的現象應引起重視?？咕幬镌谛笄蒺B殖過程中的廣泛使用及濫用，導致多重耐藥菌株愈來愈多[28-29]。筆者發現倫敦沙門菌多重耐藥率達到71.4%，其中優勢耐藥譜型為AMP-CN-S-SXT-SUL-FFC-C-TE，甚至有10株菌對5類以上的抗菌藥物耐藥，僅次于之前報道的多重耐藥鼠傷寒沙門菌[30]。

在抗菌藥物的作用壓力下，食源性耐藥沙門菌不斷出現，細菌耐藥機制復雜，但耐藥表型與耐藥基因之間往往存在著密切聯系[31]。28株倫敦沙門菌氨基糖苷類耐藥基因aadB檢出率為100.0%，高攜帶率可能是導致沙門菌對慶大霉素耐藥的主要原因。78.6%的菌株同時攜帶tetA基因和tetB耐藥基因，tetA基因攜帶率小幅增加，tetB基因攜帶率明顯增加，說明這兩種耐藥基因可使倫敦沙門菌對四環素耐藥性加強[31]。OqxAB基因是編碼多重耐藥外排泵的常見基因，檢出率為10.7%，aac(6’)-Ib-cr基因可以編碼滅活酶，檢出率為7.1%，qnr家族的基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD等能保護拓撲異構酶Ⅳ和促旋酶來降低藥物敏感性，以上基因單獨存在時可介導低水平的喹諾酮類藥物耐藥[32]。由于只有1株菌對傳統藥物萘啶酸耐藥，所以喹諾酮類耐藥基因檢出率均較低。ESBLs基因是由質粒介導的水解酶，可以水解氨曲南等單環β-內酰胺類抗生素以及頭孢他啶和頭孢噻肟等第3代頭孢菌素[33]。倫敦沙門菌對頭孢類抗菌藥物全部敏感，未檢出blaCTX-M和blaOXA，而blaTEM檢出率為10.7%，可能部分菌株攜帶該耐藥基因導致其對氨芐西林產生了耐藥現象。mcr-1作為介導的黏菌素耐藥基因，很少在沙門菌中檢出，本研究發現有1株沙門菌攜帶mcr-1且對多黏菌素耐藥，其是否為質粒介導的耐藥性亟待人們進一步研究[34]。以上結果提示，在動物飼養過程中，抗菌藥物的不合理使用可能是導致細菌對氨基糖苷類、四環素等常見抗生素產生高度耐藥的重要原因。喹諾酮類和頭孢類藥物對沙門菌有很好的抗菌作用，可作為臨床用藥的選擇依據。

本研究可為畜禽養殖臨床用藥提供理論指導，為防控食品安全做好預警工作，加強市售豬肉的安全管控，對保障公共衛生安全及其人類健康具有重要意義。

4 結 論